I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for at udføre to-foton intravital imaging og celle interaktionsanalyser i murine trakeal slimhinde efter infektion med influenza-virus. Denne protokol vil være relevant for forskere studerer immun celle dynamics under luftvejsinfektioner.
Analyse af celle-celle eller celle-patogen interaktion i vivo er et vigtigt redskab til at forstå dynamikken i den immun reaktion på infektion. To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) giver mulighed for observation af celle interaktioner i dybe væv i levende dyr, og minimere photobleaching genereret under image erhvervelse. Til dato har været beskrevet forskellige modeller for 2P-IVM af lymfoide og ikke-lymfoide organer. Billeddannelse af åndedrætsorganerne er imidlertid fortsat en udfordring på grund af den bevægelse i forbindelse med vejrtrækning cyklus af dyret.
Her, beskriver vi en protokol for at visualisere i vivo immun celle interaktioner i luftrøret af mus smittet med influenzavirus ved hjælp af 2 P-IVM. Til dette formål udviklede vi en brugerdefineret imaging platform, som omfattede kirurgiske eksponering og intubation af luftrøret, efterfulgt af erhvervelse af dynamiske billeder af neutrofile og dendritiske celler (DC) i slimhinden epitel. Derudover detaljerede vi de nødvendige skridt for at udføre influenza intranasal infektion og flow cytometric analyse af immunceller i luftrøret. Endelig, vi analyseret neutrofile og DC motilitet samt deres interaktioner i løbet af en film. Denne protokol giver mulighed for generation af stabile og lyse 4D billeder nødvendigt for vurdering af celle-celle interaktioner i luftrøret.
To-foton intravital mikroskopi (2P-IVM) er en effektiv teknik til realtid imaging af celle-til-celle interaktioner som de forekommer i deres naturlige miljø1. En af de vigtigste fordele ved denne metode er, at det giver studiet af cellulære processer på en større modellen dybde (500 µm til 1 mm) sammenlignet med andre traditionelle billeddiagnostiske teknikker2. På samme tid minimerer brugen af to lav-energi fotoner genereret af to-foton laser væv foto-skader typisk tilknyttet image erhvervelse processen2. I det sidste tiår, er 2P-IVM blevet anvendt for at studere forskellige typer af celle-celle interaktioner i flere discipliner3,4,5. Disse undersøgelser har været særligt relevant at undersøge immunceller, som er karakteriseret ved høj dynamik og dannelsen af fremtrædende kontakter efter de signaler, der er genereret af andre celler og miljøet. 2P-IVM er også blevet anvendt til at studere samspillet mellem patogen og vært6. Ja, det har tidligere vist sig at nogle patogener kan ændre type og varighed af kontakter mellem immunceller, hæmmer, som et resultat, immunrespons7.
Luftvejene slimhinde er det første sted, hvor immunrespons mod luftbårne patogener er genereret8. Derfor, i vivo analyse af pathogen-værtssammenspil i dette væv er afgørende at forstå indledning af forsvarsmekanismer vært under infektion. 2P-IVM af luftvejene er imidlertid udfordrende hovedsagelig på grund af artefakter fremstillet af vejrtrækning cyklus af dyr, der bringer processen med billede erhvervelse. For nylig, forskellige kirurgiske modeller er blevet beskrevet for billedbehandling murine luftrøret9,10,11,12 og lungerne13,14,15, 16. Luftrør 2P-IVM modeller repræsenterer en fremragende set-up til at visualisere den indledende fase af immunreaktion i de øvre luftveje, mens lunge-alveolerne 2P-IVM modeller er mere velegnede til at studere den sene fase af infektioner. De udviklede lunge modeller præsentere en begrænsning forbundet med tilstedeværelsen af luftfyldte alveolerne, som begrænser den optiske penetration af laser og gøre den slimhinde lag i de intrapulmonary luftveje utilgængelige for i vivo billeddannelse17 . Omvendt letter strukturen i luftrøret, dannet af en kontinuerlig epitel, billede erhvervelse.
Vi præsenterer her, en protokol, der indeholder en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at udføre influenza-infektion, kirurgisk forberedelse af dyrene, og 2P-IVM af luftrøret. Derudover beskriver vi en specifik eksperimentel set-up for visualisering af neutrofile og dendritiske celler (DC), to immun celletyper, der spiller en vigtig rolle som formidlere af forsvarsmekanisme mod influenza virus18,19 . Endelig, vi beskriver en metode til at analysere neutrofile-DC interaktioner. Disse kontakter har vist sig at modulere DC aktivering og efterfølgende, at påvirke immunrespons mod patogener20.
Dette arbejde præsenterer en detaljeret protokol for generation af 4D billeder viser migration af adoptively overførte neutrofile og deres interaktioner med DC under et influenza-infektion i mus luftrøret. Den beskrevne 2P-IVM model vil være relevante at studere immun celle dynamics under en infektion i luftvejene.
For nylig, flere modeller baseret på visualisering af celle dynamics i luftvejene har været udviklede9,10,</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af de schweiziske nationale Foundation (SNF) tilskud (176124, 145038 og 148183), den europæiske Kommissionen Marie Curie-reintegrationsstipendium (612742) og SystemsX.ch for et tilskud til D.U.P. (2013/124).
Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
EDTA | Sigma | EDS-500G | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
Plasticine | Ohropax | ||
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |