Summary

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

Published: August 17, 2018
doi:

Summary

En este estudio, presentamos un protocolo para realizar dos fotones intravital proyección de imagen y de la célula análisis de interacción en la mucosa traqueal murina después de la infección con virus de la gripe. Este Protocolo será relevante para los investigadores que estudian la dinámica celular inmune durante las infecciones respiratorias.

Abstract

El análisis de célula o célula-patógeno interacción en vivo es una herramienta importante para entender la dinámica de la respuesta inmune a la infección. Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) permite la observación de las interacciones de la célula en tejidos profundos en animales vivos, reduciendo al mínimo el fotoblanqueo generado durante la adquisición de la imagen. Hasta la fecha, se han descrito distintos modelos de 2P-IVM de órganos linfoides y no linfoides. Sin embargo, la proyección de imagen de órganos respiratorios sigue siendo un reto debido al movimiento asociado con el ciclo de la respiración del animal.

Aquí, describimos un protocolo para visualizar en vivo la célula inmune interacciones en la tráquea de ratones infectados con el virus de la influenza usando 2P-IVM. Para ello, hemos desarrollado una plataforma de proyección de imagen personalizada, que incluía la exposición quirúrgica y la intubación de la tráquea, seguida por la adquisición de imágenes dinámicas de neutrófilos y células dendríticas (DC) en el epitelio de la mucosa. Además, detallan los pasos necesitados para llevar a cabo la gripe intranasal infección y flujo análisis cytometric de células inmunes en la tráquea. Finalmente, se analizaron del neutrófilo y motilidad de DC así como sus interacciones en el transcurso de una película. Este protocolo permite la generación de imágenes de 4D estable y brillante es necesario para la evaluación de las interacciones célula-célula en la tráquea.

Introduction

Dos fotones microscopía intravital (2P-IVM) es una técnica eficaz para proyección de imagen en tiempo real de las interacciones célula a célula que se producen en su entorno natural1. Una de las principales ventajas de este método es que permite el estudio de procesos celulares en una mayor profundidad de la muestra (500 μm a 1 mm) en comparación con otras técnicas por imágenes tradicionales2. Al mismo tiempo, el uso de dos fotones de baja energía generada por el láser de dos fotones reduce el foto-daño de tejido por lo general asociado con el proceso de adquisición de imagen2. Durante la última década, 2P-IVM ha sido aplicado para estudiar diferentes tipos de interacciones célula-célula en varias disciplinas3,4,5. Estos estudios han sido especialmente relevantes para investigar las células inmunes, que se caracterizan por su alto dinamismo y la formación de destacados contactos siguiendo las señales generadas por otras células y el medio ambiente. 2P-IVM se ha aplicado también para estudiar las interacciones entre el patógeno y huésped6. De hecho, se ha demostrado previamente que algunos patógenos pueden alterar el tipo y la duración de los contactos entre las células inmunes, dificultando, en consecuencia, la respuesta inmune7.

La mucosa de las vías respiratorias es el primer sitio en el que la respuesta inmune contra patógenos aerotransportados es generado por la8. Por lo tanto, en vivo análisis de las interacciones patógeno-host en este tejido es fundamental para entender la iniciación de los mecanismos de defensa del huésped durante la infección. Sin embargo, 2P-IVM de las vías respiratorias es difícil principalmente debido a los artefactos producidos por el ciclo de respiración de los animales, que compromete el proceso de adquisición de la imagen. Recientemente, se han descrito diferentes modelos quirúrgicos para imagen tráquea murino9,10,11,12 y pulmones13,14,15, 16. Modelos traqueal P 2-IVM representan una excelente configuración para visualizar la fase inicial de la reacción inmunitaria en las vías aéreas superiores, mientras que el pulmón alvéolos 2P-IVM modelos son más adecuados para el estudio de la fase tardía de infecciones. Los modelos de pulmón desarrollados presentan una limitación asociada a la presencia de alvéolos llenos de aire, que restringen la penetración óptica del láser y la capa mucosa de las vías aéreas intrapulmonares inaccesibles para el en vivo de17 . Por el contrario, la estructura de la tráquea, formada por un epitelio continuo, facilita la adquisición de la imagen.

Aquí, presentamos un protocolo que incluye una descripción detallada de los pasos necesarios para realizar la infección por influenza, preparación quirúrgica de los animales y 2P-IVM de la tráquea. Además, se describe un montaje experimental específico para la visualización de los neutrófilos y las células dendríticas (DC), dos tipos de células inmunes que juegan un papel importante como mediadores de lo mecanismo de defensa contra influenza virus18,19 . Por último, se describe un procedimiento para analizar las interacciones del neutrófilo-DC. Estos contactos se ha demostrado que modulan la activación de la DC y, posteriormente, afectar la respuesta inmune contra patógenos20.

Protocol

Todos los procedimientos animales ratones que realizaron los animales protocolos y directrices de la Oficina veterinaria Federal de Suiza fueron aprobados por las autoridades veterinarias locales. 1. gripe infección de ratones de CD11c-YFP Seguridad de la biotecnologíaNota: La cepa de ratón adaptado de gripe H1N1 de A/Puerto Rico/8/34 (PR8) fue cultivada en huevos fertilizados, purificada y valora como se describió anteriormente21. Tod…

Representative Results

En este trabajo describen un protocolo detallado para el estudio en vivo la motilidad y las interacciones entre neutrófilos y DC durante la infección por influenza en tráquea murino (Figura 3A). Para ello, se aislaron neutrófilos PPC+ (92% pureza; Figura 3B) de ECFP CK6 ratones y eventualmente trasladaron en un ratón de CD11c-YFP infectado con influenza. Después de eso, realizamos 2P-IVM de la tráquea e…

Discussion

Este trabajo presenta un protocolo detallado para la generación de imágenes de 4D que muestra la migración de neutrófilos eventualmente transferidos y sus interacciones con DC durante una infección de gripe en la tráquea de ratón. El modelo descrito P 2-IVM será relevante para el estudio de dinámica celular inmune durante una infección en las vías respiratorias.

Recientemente, varios modelos basados en la visualización de la dinámica de la célula en las vías respiratorias han si…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las donaciones de la Fundación Nacional Suiza (SNF) (176124 145038 y 148183), europeo Marie Curie reintegración subvención de la Comisión (612742) y SystemsX.ch para una beca a D.U.P. (2013/124).

Materials

Gigasept instru AF Schülke & Mayr GmbH 4% solution
CD11c-YFP mice Jackson Laboratories 008829 mice were bred in-house
CK6-ECFP mice Jackson Laboratories 004218 mice were bred in-house
1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D8537-500ML
10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride Sigma D1408-500ML
Percoll PLUS Sigma E0414-1L Store at 4°C
Ketamin Labatec Labatec Pharma 7680632310024 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
Rompun 2% (Xylazin) Bayer 6293841.00.00 Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture
26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak BD Plastipak 305501
30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes BD 324826
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
2 mL Syringes BD Plastipak 300185
Microlance 3 18 G needles BD 304622
Introcan Safety 20G (catheter) Braun 4251652.01
6 Well Cell Culture Cluster Costar 3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1X) ThermoFisher Scientific 42401-018 Store at 4°C
Liberase TL Research Grade Roche 5401020001 Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture
DNAse I Amresco (VWR) 0649-50KU Store at -20°C
CellTrace Violet stain ThermoFisher Scientific C34557 Store at -20°C
EDTA Sigma EDS-500G
Fetal Bovine Serum Gibco 10270-106 Store at -20°C
PE-10 Micro Medical Tubing 2Biological Instruments SNC #BB31695-PE/1
Surgical Plastic Tape M Plast
Viscotears Bausch & Lomb Store at RT
Plasticine Ohropax
High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round Warner Instruments 64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Nuvo Lite mark 5 GCE medline 14111211
MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) Tem Sega
SURGICAL BOARD University of Bern
TrimScope II Two-photon microscope LaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa lasers Coherent Inc.
25X NA 1.05 water immersion objective Olympus XLPLN25XWMP2
The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller Life imaging Services
Imaris 9.1.0 Bitplane Imaging software
GraphPad Prism 7 GraphPad Statistical software

References

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Cite This Article
Palomino-Segura, M., Virgilio, T., Morone, D., Pizzagalli, D. U., Gonzalez, S. F. Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (138), e58355, doi:10.3791/58355 (2018).

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