Summary
HMCA ベースのイメージング プレートは、浸潤アッセイ パフォーマンスが提示されます。このプレートは、三次元 (3 D) 腫瘍スフェロイドの形成と細胞外マトリックス (ECM) に癌細胞の測定を促進します。浸潤アッセイの定量化は、半自動解析によって実現されます。
Abstract
がんの転移がん致死率の 90% を引き起こす知られています。転移は、周辺の組織に腫瘍細胞の浸透・浸潤を開始する多段プロセスです。したがって、侵略は侵略プロセス研究と抗転移治療薬の開発の非常に重要なを作る転移の重要なステップです。この需要に対処するため固形腫瘍のアーキテクチャを模倣する 3 Dの in vitroモデルを開発する必要性があるし、1 つの手が同時に生体内の状態に最も密接に彼らの微小環境が再現性の高い、堅牢な適した高収量と高糖度を計測。現在、ほとんどの浸潤アッセイは頼る十分ですが洗練されたマイクロ流体技術研究ではなく、大量の薬剤のスクリーニング。他のアッセイ プレート ベースのデバイスを用いた各ウェルに分離個々 スフェロイド材料消費と条件ごとの低いサンプル サイズを持っています。現在のプロトコルの目的は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のためシンプルで再現性のある生物模倣型 3 D セル ベースのシステムを提供することです。HMCA イメージング プレート腫瘍浸潤性および抗転移性薬剤の発見の研究に基づく侵略の試金のための 3 D モデルを作成しました。このデバイスにより、連続と同時に観察し、媒体の単一要素の解像度で回転楕円体を測定しながら ECM コンポーネントに囲まれた多数の制服スフェロイド (条件あたりの高いサンプル サイズ) ウェルあたりの生産抗転移薬のスクリーニング。このプラットフォームは、単一セルおよび集団の侵入を実証の hela 細胞と MCF7 回転楕円体の生産によってここで紹介です。Hela 細胞スフェロイドを取り巻くコラーゲンの侵襲的な能力で ECM 成分ヒアルロン酸 (HA) の影響を比較します。最後に、紹介 Fisetin (侵入阻害剤) hela 細胞スフェロイドと一酸化窒素 (NO) (侵略アクティベーター) MCF7 回転楕円体に。結果は、マルチパラ メーター検査を容易にする半自動、シンプルで高速な解析を可能にする社内のソフトウェアによって分析されます。
Introduction
癌死は遠い場所に転移細胞の普及に主に起因します。がんの治療で多くの努力をターゲットまたは転移性コロニーの形成と全身の転移性疾患1の進行予防に焦点を当てます。がん細胞の遊走は腫瘍転移プロセスの重要なステップ、したがって、がん浸潤翼列の研究は非常に重要な抗転移治療を見つけることへの前提条件。
転移性疾患を研究するためのツールとして動物モデルの使用は、非常に高価で、常に人間の腫瘍の代表ではないに発見されています。さらに、細胞外微小環境のトポロジー、力学や構成強く癌細胞の動作2を影響します。体内モデルは本質的に分離し、癌の浸潤・転移に貢献するような特定のパラメーターを制御する能力を欠いている、制御可能な模倣の in vitroモデルの必要性があります。
遠隔臓器に転移するためにがん細胞は治療の対象にすることができます渡り鳥や侵襲性の分化形質を表わさなければなりません。しかし、ほとんどのがんの in vitroモデルが固体腫瘍3の実際の機能を模倣しないので、生理学的に関連する表現型を検出する非常にやりがいのあります。さらに、表現型の多様性は、腫瘍内に存在する指示転移開始細胞によって表現型指示療法、例えばを発見するために要素が 1 つの解像度での腫瘍移行の分析の必要性異種腫瘍4内人口。
細胞の運動性と集団移動の調査は均一な平面の表面で上皮細胞の単層培養に主にです。がん細胞遊走のこれらの従来の携帯電話モデルは、個々 の細胞膜と ECM コンポーネント5、侵入の人口分析に基づいているが、このようなシステムで個々 の細胞の本質的な違いをすることはできません。勉強しました。優れた腫瘍を研究する手段として足場を経由またはスキャフォールド フリー マイクロ構造のいずれかと見なされます生成 3 D 回転楕円体セル成長および癌浸潤6,7,8。しかし、ほとんどの 3 D システム、高スループットの形式には適していません、分離個々 の回転楕円体、各マイクロも9で生成されますので通常回転楕円体間相互作用を達成することはできません。癌の移行を含む最近の研究は、マイクロ流体デバイス3,10、11,12に基づきます、しかし、これらはマイクロ ツールを生成しにくい、できない洗練されました。ハイスループットス クリーニング (HTS) 反侵襲的な薬の使用。
2 つの主な表現、集団と個々 の細胞遊走と ECM バリアを克服する腫瘍細胞の役割を担い、周辺の組織に侵入されている実証13,14、それぞれ明確な表示を形態学的、生化学的な分子および遺伝のメカニズム、特徴。さらに、移行する腫瘍細胞、線維芽細胞のようなアメーバの 2 つの形式は、それぞれの表現型の観察されます。両方以来侵略の表現型と移行モードは主に形態学的性質によって定義されます、携帯の必要性モデル イメージング ベースの検出を有効にして、細胞の浸潤と移行のすべての形態の検討があります。
現在のメソッドの全体的な目標は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のセルベースのシステム 3 D体外シンプルで再現性のある生体模倣を提供することです。腫瘍浸潤性および抗転移療法の研究 HMCA ベース 6 ウェル イメージング プレートを紹介します。ハイドロゲル マイクロ室 (MC) 構造における制服 3 D 腫瘍スフェロイド (ウェルあたり 450) の多数の形成を実現します。ECM のさまざまなコンポーネントは、周囲の環境への細胞の侵入を有効にするスフェロイド アレイに追加されます。浸潤過程同じ個々 に回転楕円体/侵入細胞の短期および長期観察によって常時監視し、形態的特性、蛍光染色、任意の時点で特定の回転楕円体の検索が容易になります。多数の回転楕円体は、空間とメディアを共有するので水溶性の分子を介して個々 の回転楕円体と互いへの影響の相互作用が可能です。半自動画像解析は、大量のデータの高速かつ効率的コレクションを可能にする社内の MATLAB のコードを使用して行われます。プラットフォーム反侵略薬の中のスクリーニングを許可する、時間効率の良い方法で多数の回転楕円体/浸潤細胞の正確な同時測定が容易になります。
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Protocol
1. HMCA プレート エンボス
注: デザインとポリジメチルシロキサン (PDMS) スタンプとこのプロトコルで使われる HMCA イメージング プレートの製造のための完全なプロセスは、私たちの以前の記事15,16でくわしく説明します。PDMS スタンプ (否定形) を使用して、よく (図 1 a) あたり約 450 MCs から成っている HMCA (肯定的な形状) をエンボスします。各 MCs に切り捨てられた逆さまに正方形ピラミッドの形は図 1 bに示されるように (高さ: 190 μ m、小さな基本領域: 90 μ x 90 μ m と大規模な基本エリア: 370 μ x 370 μ m)。HMCA プレートは、準備をし、腫瘍を 3 D 回転楕円体の培養とその後、浸潤能の測定のために使用されます。また、商業スタンプ HMCA 生産される可能性があります。
- 6% 低融点アガロース (LMA) のソリューションを準備します。磁性攪拌器でガラス瓶に LMA 粉と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (10 ml の PBS の LMA の 0.6 g) を挿入します。加熱板にボトルを配置し、均一解決が達成されるまで、数時間の 80 ° C に加熱しながらソリューションをかき混ぜます。70 ° C でのソリューションを使用するまで保持します。
- 予熱オーブンで 70 ° C に PDMS スタンプ。それは使用するまで暖かいを保ちます。また、商業のスタンプを使用し、指示に従ってください。
- 75 ° C に予熱乾燥浴上商業 6 よくガラス底プレートを配置します。プレートが完全に暖かくなるまで、数分を待ってください。
- プレートの井戸の各 1 つのガラスの下に事前に加熱された LMA のドロップ (400 μ L) を注ぐ。予熱した PDMS スタンプをアガロース ドロップにそっとかぶせます。(RT) 常温ゲル化前の予冷 5-10 分間インキュベートします。4 ° c における agarose のゲル化を達成するために 20 分間インキュベートします。その後、MCs と模様の agarose のゲルを残して、PDMS をそっとはがします。
注: この手順は、すべての井戸で同時に行われます。 - 光重合型紫外線 (UV) ランプを搭載したシステムでエンボス プレートを置き、3 分間インキュベートします。
注: 今 HMCA プレート、UV 殺菌します。 - 確認彼ら湿気の保持し、プレート カバー、パラフィルムで包んで使用するまで 4 ° C で保存する滅菌 PBS でマクロ井戸を埋めます。
- 使用前に空の HMCA プレートから PBS 残差を実行します。生物のフードにそれを配置します。
2. 読み込み細胞スフェロイドの形成
- 次のようにセルを収集: 10 mL の血清の残余の処分、トリプシン (37 ° C に加温) 5 mL を追加し、37 ° C の定温器で 3 分間インキュベートする PBS で 2 回洗い、単層細胞 10 cm 文化の板からすべての媒体を削除その後、単分子膜剥離を確実に均質な細胞懸濁液が得られるまで (37 ° C に加温) 完全培地の上下ピペット 10 mL を追加そっとプレート横に振る。遠心分離機し 15 ml の新鮮な媒体の細胞懸濁液を洗浄し、新鮮な完全培地で適切な濃度で中断します。
- 細胞懸濁液をそっとロード (50 μ L、150-360 103セル/mL 中、x ~ 16-40 MC あたりセル)、HMCA の上にでき、15 分のために重力によって解決する細胞。
- 優しくリングとハイドロゲル配列の外部マクロもプラスチック製の底の縁に 6-8 500 μ L 新鮮な媒体 (総 3-4 mL) の因数を追加します。
- 72 h の HeLa 細胞と MCF7 細胞スフェロイドの形成のための加湿雰囲気で CO2を 37 ° C、5% で 48 時間孵化させなさい。
3 生存率 Propidium ヨウ化 (PI) 染色による検出
- 円周率の貯蔵液の準備 (PBS の 1 mL あたりに PI の 500 μ g)。4 ° C で約 6 ヶ月間それを維持します。たて 6 ウェル HMCA 板 (ウェルあたり 2 mL) を 12 mL の完全培地、フェノールレッドなしの株式の 6 μ L 添加による 1:2,000 (0.25 μ g/mL) の希釈を準備します。
- 生物のフードにインキュベーターから 48-72 h スフェロイド HMCA プレートを転送します。ハイドロゲル配列の横にマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで、HMCA からすべてのメディアを削除、中でいっぱい配列タンクを残してします。
- 各ウェルにステップ 3.1 からマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで PI 希釈の 2 mL を追加する優しくします。37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気の中で、1 時間 HMCA プレートを孵化させなさい。手順 7 に進みます。
注: 他の染料はされる可能性がありますここで同様に、たとえば、核の染色、ヘキスト染色、フルオレセイン ・ ジアセテート (FDA) の生きているセル検出、apoptosis のためアネキシン V ミトコンドリア膜電位の tetramethylrhodamine メチル エステル (TMRM)検出とその他。
4. コラーゲン混合物の準備
- 1 M NaOH フィルター滅菌溶液 100 mL を保有しオートクレーブ滅菌二重蒸留水 (DDW) を準備します。RT、および使用するまで-20 ° C で凍ってコラーゲン混合物の準備の使用ヒントで材料を維持します。
- 使用前に 10-20 分配置を含むすべての intergrades: 滅菌 DDW、1 M NaOH 滅菌溶液、滅菌 10 x PBS、I 型コラーゲンのラット尾 (3-カ月の 4 ° C で保存)、生殖不能の管から完全に冷却されるまでの氷のバケツに。生物のフードの中の氷のバケツを配置します。
- 6 ウェル HMCA 浸潤アッセイ プレート (300 μ L/ウェル) を次のように最終濃度 3 mg/mL でコラーゲン混合物の 1,800 μ L を準備します。次の順序で冷却管に intergrades を追加: DDW、1 M NaOH の 24.8 μ L、180 μ L の 10 倍 PBS の 515 μ L。氷に渦と場所で混ぜる。最後に、再び渦混合物にコラーゲンの 1080 μ L を追加し、氷に戻します。
5. HA とコラーゲン混合物の準備
- ハ滅菌 DDW の 2 mL に 10 mg を溶解します。粉が完全に溶解するまで、いくつかの分および渦の優しく常温混合物をインキュベートします。2 年間の 4 ° C で原液を格納します。
- 右使用前に生物学的フード内氷バケットに HA 原液を場所します。
- コラーゲン混合物のステップ 4 で説明したように 3 mg/mL を準備します。最終濃度 20 μ G/ml にコラーゲン混合物を使用する準備ができての 1,800 μ L に HA の 36 μ g (7.2 μ L) を追加します。それから、渦を再度簡潔に、氷に戻る。
6. ECM 混合物添加
- 生物のフードにインキュベーターから HMCA プレートは、48-72 時間回転楕円体を転送し、氷の上に置きます。プレートは冷却されるまで 10 分間インキュベートします。1% の溶液を予熱 37 の ° C の水浴中に LMA。
- ハイドロゲル配列の横にマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで HMCA、周りからすべてのメディアを削除します。その後、配列の端には、優しく、ゆっくりと吸うすべてのメディアを取り出し、先端を薄くことで、ヒントを読み込んで細かいヒント/ゲルに配列タンクからすべての媒体を取除く非常に慎重に。
注: ハイドロゲル配列の周りからすべてのメディアを削除すると、中ではまだ配列タンクはいっぱい。この媒体は非常に優しくハイドロゲル MC の破壊と回転楕円体の転位を避けるために削除します。 - あらかじめ冷凍ファインチップとコラーゲン混合物または HA とコラーゲン混合物 (ECM 混合物) の 150 μ L を取るし、先端を配列エッジにアタッチすることにより配列のタンクに追加します。ゆっくりと回転楕円体の転位を避けるために混合物をリリースします。合計 300 μ L/ウェルの 150 μ L のもう一つの因数でこの手順を繰り返します。すべての井戸が埋まるまで各ウェルの同じ手順に従います。ECM におけるゲル化の 1 h の定温器にプレートを入れ。
- ECM におけるゲル化が達成された後に予め温めておいた 1% の 400 μ L をピペット LMA ECM のゲルの上。その蓋プレート カバー、5-7 分間放置、agarose のゲル化のための 4 ° C で 2 分 RT でプレートを孵化させなさい。最後に、マクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで優しく完全培地 2 mL を追加します。
注: agarose 層は、HMCA からコラーゲン ゲルのマトリックスの剥離を防ぎます。
7. 浸潤アッセイ集録および解析
- 負荷に電動 HMCA プレートは、37 ° c、5% CO2加湿雰囲気調整済み、インキュベーターを備えた顕微鏡ステージを反転します。
- 事前の各画像取り込み位置配列全体の領域をカバーするためによくし、10 X または 4 X 目標を使用を決定する (この手順はここで使用される画像集録ソフトウェアに必要な詳細については以下の表を参照)。または、任意の画像集録ソフトウェアを使用して選択することで必要な領域全体の自動スキャンを容易にする、 「スティッチ」オプション。
- 画像を取得明るいフィールド (BF) ごとの 2-4 h 24-72 h の全期間のため周囲の ECM に回転楕円体ボディから細胞の浸潤に従うために。
- (励起フィルター 530-550 nm、ダイクロイック ミラー 565 nm 長いパスおよび排出フィルター 600-660 nm) 専用の蛍光キューブを使用して円周率の検出のための蛍光画像を取得します。
- 画像集録ソフトウェアからタイムラプス BF/蛍光画像をエクスポートし、ツールバーをクリックし、 「エクスポート レコード ファイル」ボタンで「データベース」タブを使用して専用フォルダーにタグ付きイメージ ファイルの形式 (TIFF) で保存します。
注意: MATLAB ソフトウェアどの侵略で迅速かつ容易に分析は実行できるデザイン グラフィック ユーザー インターフェイス (GUI) を含む特別な社内解析コードを開発しました。この分析コードで回転楕円体と浸潤領域のセグメンテーションは、侵食と拡張形態演算子に続いて Sobel フィルターを使用して半自動的に行われます。領域の自動セグメンテーション後精度を高めるため必要に応じて手動での修正が行われました。分割完了後パラメーターのセットが自動的にソフトウェアによって計算され、さらに操作の excel ファイルにエクスポートします。パラメーターのリストです: 時に基本的な回転楕円体断面積 = 0、回転楕円体の体に接続したセルの侵入エリア = 主な侵入エリア主な浸潤領域から分離細胞の主な浸潤領域の平均距離から区切られたセルの数主な浸潤領域と分離細胞集団の侵入距離] パラメーターのまわりに基本的な回転楕円体の重心からの侵略 = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) のうち、X と Y 回転楕円体の重心座標を前に (X1, Y1) と後 (X2Y2) 集団侵略プロセス)。また、他の専門的なソフトウェアと画像解析を行うことができます。 - GUI を開くし、 "負荷 BF"ボタンを押します。画像を開いた後、分割パラメーターの調整 (最小サイズ: > 1 と半径を閉じます: > 1) 回転楕円体とその侵入地域の正確な分割を達成するために、実行のため「利益 (率 ROI) のセグメンテーションの地域」ボタンを押すと境界線は、各回転楕円体の周り表示されます。自動セグメンテーションが正しくない場合「削除」または「追加」ボタンを押すし、手動で要求された訂正を行います。後続の画像は、同じ手順を繰り返します。
- スフェロイドに番号を「追跡」ボタンを押すソフトウェアが各時間経過イメージで各回転楕円体の同じ番号を割り当てます。すべてのパラメーターをスプレッドシートを生成する「計測」ボタンを押してください。処理結果にさらに使用および統計ソフトウェアを excel で excel ファイルとしてこのスプレッドシートを保存します。
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Representative Results
ユニークな HMCA イメージング プレートは、回転楕円体 3 D 腫瘍の浸潤能の測定に使用されます。全体アッセイ、スフェロイドの形成に始まり、浸潤過程と追加の操作までは同じプレート内で実行されます。回転楕円体の形成のため、HeLa 細胞は配列盆地に読み込まれ、重力によってハイドロゲル MCs で解決。ハイドロゲル非付着性/低添付ファイルの特性を持つ、MCs 3 D 腫瘍スフェロイドの形成と細胞間相互作用を促進します。図 2 aは、150 × 103セル/mL のソリューションの読み込みの使用に続く、MCs に定住したセルを示しています (すなわち。、MC あたり 〜 16 セル計算値)。平均得られた統計量の配分は MC 当たり 14.78 ± 3.60 セルの配列を MC ごとのセル占有率が均等に配られないことは明らかです。図 2 bの表は、全体 HMCA プレート MC あたりの細胞分布をまとめたものです。マクロ ウェル内細胞分布の変動 (CV) の平均係数は 43.33% マクロ井戸間それは 24.37%。セル占有率の違いは重要な直接スフェロイド形成とプレート全体で同質のサイズに合います。削減/MC あたりのセル数によって作成された変動を最小にするには、単一要素の解像度で結果の分析が実行されます。図 2-Dのプロットは、3 日回転楕円体のサイズ (断面積) の分布を示しています。それは明らかに 15.48% と 52.80% の CV を降伏絶対サイズ分布 (図 2) よりもより均一な分布を持っている各回転楕円体 (3 日目/2 日目で断面積) の成長率を計算すること2 D 図で例示されてそれぞれ。3 日回転楕円体の楕円体径分布生成 24.52% の CV と成長率 (3 日目/2 日目で直径) は 7.45%。これらの CV 値は17と同様、18他報告重力によって読み込み達成のセルよりも高い。MC あたり初期播種細胞数の変動から生じる測定パラメーターの分散を排除するために初期細胞数、または同じオブジェクトの他の測定パラメーターに選択したパラメーターを正規化することが望ましいそのような。各回転楕円体がその内部のコントロール。このアプローチは、HMCA イメージング プレートでオブジェクトを追跡することによって簡単に適用できます。
イメージング プレート HMCA のスフェロイドの形成と成長のプロセスを簡単に続くことができます。図 3 a Bはイメージング プレート 24 h HeLa 細胞凝集塊を含む、HMCA の 1 つの領域の BF のイメージを示しのそれぞれのイメージが成熟し、5-日 3 次元物多細胞体より球と高密度になっています。ほとんどのオブジェクトが 5 日間の培養期間中にその場所を保持することを明確に示されています。形 (球形) とスフェロイドの形成中に大きさ (断面積) の解析は、図 3で示されます。散布は 5; の日に 1 日目から両方のパラメーターの増加を示します0.684± 球対称性 (p < 0.05) の 0.016 a.u. と 0.00356± 0.544 ±0.020 a.u. 0.00013 ミリメートル2 0.00538 ± 0.00015 mm2の断面積 (p < 0.05)、それぞれ。24 h 集計は少なく、非正規形をしている、それぞれ 5 日回転楕円体、大きい、球形のフォームを取得します。
回転楕円体セル実行可能性の検出、染料の洗浄の必要性を回避19の汚損のため低濃度 PI を使用して実行されます。PI を細胞膜に浸透し、非実行可能な細胞の DNA に主体と。図 4 aは、5 日間 hela 細胞スフェロイド (赤) は PI で染色を示しています。各回転楕円体の断面積からの赤の領域 (死んだ細胞を表す) の割合の解析は、図 4 bのとおりです。ヒストグラム平均は 3.01 と回転楕円体の人口の 85% が染色 5% の赤色の値をこえる地域 ± 2.34% (左ヒストグラム)。回転楕円体 (右ヒストグラム) の断面積は、0.02447 ± 0.00487 mm2の平均と分布を示しています。
3 日間成熟した hela 細胞スフェロイドの生産後、浸潤アッセイは、イメージング プレート HMCA 内で実行されます。3 D 腫瘍回転楕円体浸潤過程に及ぼす ECM 組成, 阻害剤と活性化などの変数を検査できます。浸潤アッセイ パフォーマンスの中優しくを取り外して取り替えると ECM ソリューション ピペットと、回転楕円体上 MC 配列盆地に。ECM ソリューションの完全ゲル化後にマクロも完全培地が追加されます。(1) ハの hela 細胞回転楕円体の自発的な侵略過程に及ぼす影響を調べるを回転楕円体がコラーゲンと混合な HA ソリューション (図 5 a) カバーされ、コラーゲンの唯一の解決策 (図 5) で覆われるそれらと比較して、ECM のゲル化の直後に買収された BF 画像 (t = 0 h)。浸潤過程の速度論的、63 h の期間同じ地域ごとの 5 h をイメージングが続いた。インキュベーションの 50 h 後コラーゲンに埋め込まれた、回転楕円体と HA (図 5 b) コラーゲンのみ (図 5) に埋め込まれている回転楕円体と比べて周囲の ECM にバラツキの小さいセルを示した。侵入地域単一回転楕円体の解像度で 99 回転楕円体のため、時間をかけて運動の解析は、図 5Eに集約されます。図 5 eは 2 つのグループでは、時間の経過と共に平均/平均浸潤領域が印刷し、侵略の小さい区域で、その結果コラーゲンを添加 HA が、回転楕円体からの細胞分散を阻害することを明らかに示しています。コラーゲンと HA ソリューション (0.001410 ± 0.000941 mm2/h) と比較して各コラーゲン (0.001973 ± 0.000894 mm2/h) に埋め込まれている回転楕円体の線形回帰調整曲線から生じる斜面の平均が大幅異なる (p = 0.003、t 検定: 等分散を仮定を仮定した 2 標本による)。Fisetin の影響を検討するために (2) (生理活性フラボノイドが見つかりましたいくつかの果物や野菜ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ (PI3K) を含むいくつかの分子標的に作用して cytostatic と migrastatic の活動を表わす/6 月 Akt/cN-terminal シグナル伝達キナーゼ (JNK) と Wnt/β-カテニン シグナル伝達より, マトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)20) 完全培地に追加された薬の濃度を上げる hela 細胞回転楕円体自然侵入過程とT で得られた BF 画像 = 0 (図 6 a)、24 h 後 (図 6B-c)。示すように、Fisetin (図 6) の 10 μ M は非処理 hela 細胞スフェロイド (図 6 b) と比較すると回転楕円体の周囲のセルのバラツキを抑制します。線量応答実験 (図 6) の侵攻エリア分析は、高い 10 μ M の濃度で飽和を達成する Fisetin (p < 0.003) の 10-40 μ M で重要な抑制を展示します。(3) それによって示されているいいえ、ナノ大臼歯レベルに貢献するより積極的な乳がんがん表現型刺激的な腫瘍の拡張および移行16。コラーゲン、diethylenetriamine/一酸化窒素ドナーの 1 μ M に埋め込まれた MCF7 回転楕円体の集合的な浸潤過程に及ぼす影響を検討するために (データ/いいえ) が追加された t で得られた画像完全培と BF に = 0 と t = 20, 劇的な形態とないドナーへの露出の間に 3 D 回転楕円体の位置の変化が表れている (図 7 aB)。スフェロイドの真球度を失うし、よりアメーバの渡り鳥の表現型を獲得が伸びる。付随して、周囲のコラーゲン マトリックス内回転楕円体の強化された転流を認めた (図 7)。1.477 ± (p < 0.0006) 0.298 a.u. 1.305 ± 0.193 a.u. から大幅増加平均伸び値。同じ回転楕円体の平均移動距離が有意に伸びた、0.0788 ± 0.0575 ミリメートルと 0.3164 ± 0.3365 mm でた/NO の存在、不在でそれぞれ (p < 4 10-6x)。
回転楕円体の侵略の画像解析は、半自動の社内 MATLAB ソフトウェアによって達成されました。取得時間経過スフェロイドの形成、HMCA 内浸潤像は 1 つのイメージ (10 倍と 4 倍の倍率で 25-30 回転楕円体で 4-6 回転楕円体) で多数回転楕円体から成っています。スフェロイドの形成、増殖および浸潤の解析を画像ですべて回転楕円体に付随して行った。回転楕円体の侵入のために抽出されたキー パラメーターが図 8 a、シングルの時点で 4 回転楕円体の代表的な画像の領域分割を示すに表示されます (t = 16 h)。外れるとその周り (黒い矢印によって示されます) に分散追跡, 時間をかけて各回転楕円体の番号で区切られた細胞と同様、赤い枠線によって定義される主な浸潤領域。T での侵入前に回転楕円体サイズ = 0 は、青い枠線によって定義されます。区切られたセルを含む侵入エリア周囲に回転楕円体の重心から平均値/平均浸潤距離は城壁に囲まれた赤いセグメンテーションから計算され、黄色の矢印で示されます。図 8B-Dにこのコマ撮り実験から抽出されたデータをまとめます。図 8 bは、時間をかけて各回転楕円体の中心からの平均浸潤距離の標高を表わします。図 8は、(主要な侵入の領域と分離/解除-セル領域を含む) で、回転楕円体のそれぞれの合計浸潤領域の標高を表わします。図 81-4は、(長い間に) 各回転楕円体の総侵入の領域に比較して分離セル領域の大きさを示します。上の空のセルの累積数は、それぞれ 33、7、4、回転楕円体、#4 #3 #2 #1 の 5 です。コラーゲンに埋め込まれた 20 h 以上 126 hela 細胞回転楕円体から得られた侵略の上の空のセルの累積数の解析は、図 8 eで示されます。検査された人口の上の空のセル数で広大な分布は、平均値は 12.3 ± 12.8 セルここで示した。
図 1: イメージング プレートの HMCA 。(A) マクロ-よく HMCA とエンボス加工のイメージ。(B) 断面イメージング プレート HMCA 内 1 MC。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: イメージング プレート HMCA のセル回転楕円体の分布と成長率の均一性です。(A) BF のオーバーレイとヘキスト 33342 1 μ g/mL (1 mL あたり濃度 150 × 103セルの読み込み) で事前に染色された HeLa 細胞搭載 HMCA の蛍光イメージ。MC。 画像の倍率 4 倍、スケール バーで携帯決済直後の画像が取得 = 500 μ m。 (B) 表 HMCA 6 ウェル イメージング プレート内 HeLa 細胞の分布をまとめたものです。セルは、最大 90 MC/マクロ ウェルから数えられました。結果は、平均 ± 標準偏差 (SD)、CV (SD/mean100) は内計算とマクロ井戸に掲載されています。(C) 3 日、n 回転楕円体の断面積の分布ヒストグラム = 418、BF 画像から決定されます。(D) 回転楕円体成長率 (3 日目/2 日目で断面積) の分布ヒストグラム。成長率は、418 回転楕円体の各要素が 1 つの解像度で計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: イメージング プレート HMCA のスフェロイドの形成を追跡します。HeLa 細胞 (1 mL あたり濃度 120 × 103セルの読み込み) BF 画像 HMCA 1 日 (A) と (B) の 5 日間で孵化します。画像の倍率 4 倍、スケール バー = 500 μ m。(C) 散布図を 3D オブジェクトの断面、1 日 (ブルー ダイヤモンド) と 5 日 (茶色の正方形) インキュベーション ポスト セル読み込みの関数として球形のプロットします。各マーカーは n 単一の楕円体から分析されたデータを表す = 83。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 成熟した回転楕円体の細胞生存率の検出。BF のオーバーレイと 5 日間の回転楕円体 (1 mL あたり濃度 360 x 103セルの読み込み) の蛍光イメージは、0.25 μ g/mL (A) PI とステンド グラス。画像の倍率 4 倍、スケール バー = 500 μ m。 (B) 回転楕円体 (左側のパネル) の断面積を基準として PI の割合の分布ヒストグラムと断面積 (右側のパネル) の分布ヒストグラム n = 84。PI 面積のパーセントは、84 回転楕円体の各要素が 1 つの解像度で計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 回転楕円体浸潤過程に ECM 成分の影響。3 mg/mL コラーゲンと 20 μ g/mL の混合物で埋め込まれる 3 日間 hela 細胞スフェロイドの BF 画像 HA (A) と (C) 3 mg/mL コラーゲン t = 0 h 前後 50 時間 (B) と (D)、それぞれ。画像の倍率 10 倍、スケール バー 200 μ m を =。イメージング プレート HMCA インキュベーターを搭載した倒立顕微鏡のステージに読み込まれました。画像は、すべての 5 h が買収され、速度論的解析、プロット (E) で表示 n = 99。各曲線は、コラーゲンと HA (ブルー ダイヤモンド) およびコラーゲンのみ (茶色の正方形)、時間をかけて侵略領域増加の平均 ± SD を表します。平均の線形回帰曲線とその方程式と二乗の値を上記曲線。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: Fisetin hela 細胞スフェロイドの自発の侵入を抑制する。T で 3 mg/mL コラーゲン (A) の混合物で埋め込まれる 3 日間 hela 細胞スフェロイドの BF 画像 = 0 とし、24 h 0 μ M (B) の付加の後 10 μ M と完全な培養 Fisetin (C)。画像の倍率 4 倍、スケール バー = 500 μ m. 終点各回転楕円体の侵入領域の解析 (t = 24 h) プロット (D) は、「n = 488。0-40 μ M の関数としてこの曲線を表します浸潤領域の平均 ± SD Fisetin。Fisetin 治療が大幅 10 μ M での侵入を抑制する (P = 10-6x 4.65)、20 μ M (P = 0.0021) 40 μ m (P = 10-8x 4.86)、t 検定を使用して: 等しい分散を仮定した 2 標本。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: いいえ MCF 7 乳がん回転楕円体の集団の侵入を誘発する。MCF 7 2 日目の BF 画像乳房がん回転楕円体、(A) コラーゲンに埋め込まれたので (t = 0) と (B) 1 μ M でた 20 h 暴露後。回転楕円体 ROI セグメンテーションの赤い枠線によって定義される、オーバーレイし、BF 画像 A と B. ・ ロワ BF 画像 B を表す回転楕円体サイズと t の位置に重ねての青い枠線によって定義される赤の番号 0 を =。倍率 4 倍、スケールバー = 500 μ m (C) A 散布 1 μ m でたへの露出に個々 の乳房がん回転楕円体の伸長の要因と移行距離との相関関係のない (茶色の正方形) としてに比べてコントロール (ブルー ダイヤモンド)/t =。20 h、n = 54。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: HeLa 細胞自発侵入画像解析します。BF 3 日 hela 細胞スフェロイド、16 h コラーゲン (A) への埋め込み後の画像。倍率 10 倍。回転楕円体侵入エリアと上の空のセル赤い線で、t に回転楕円体のサイズによって定義されます = 0 は青い枠線によって定義され、回転楕円体の重心からの平均浸潤距離が黄色の矢印で示されます、上の空のセルは黒の矢印で示されます。回転楕円体の重心 (B)、合計侵攻エリア (C) からの平均浸潤距離の時間増をプロットします。曲線は、回転楕円体 #1 (ブルー ダイヤモンド)、回転楕円体 #2 (茶色の正方形)、回転楕円体 #3 (緑の三角形) および回転楕円体 #4 (紫 Xs) を表します。(D) メイン (青) のグラフのバー、セル (ブラウン) 侵攻エリア時間増を分離します。(E) 分離細胞浸潤過程、n の 20 h 中に回転楕円体ごとの累積数の分布ヒストグラム = 126。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
それも記載の生きている有機体、複雑な 3 D 多細胞組織によって特徴付けられるより良い機能を模倣細胞モデルを使用する重大な必要性を強調、一般的に使用される 2次元単層培養細胞とは全く異なる・薬物の生きている有機体のプロセスの検診します。最近では、チップ上の臓器、organoids 切片培養スフェロイドは標準化された薬剤の発見の使用のために導入された8をされています。ただし、3 D の多細胞モデルの偉大な複雑さは大幅その堅牢性、並列化およびアッセイ効率のため重要なデータ解析を損ないます。
侵攻能力の定量的評価は通常、ハイドロゲル材料を介して細胞の動きを測定します。伝統的なマイクロウェル プレートによる浸潤を測定するためにがん細胞の数が多いを底板ラウンドでシードし、強制的に遠心分離21,22で集計します。これらのプレートは、丸底が光学的品質を阻害、画像集録を複雑に井戸を隣接セル/回転楕円体の相互作用を制限します。他の方法で個々 のセルがランダムに、ハイドロゲル内にカプセル化、成長、3 D 環境で機能成熟したスフェロイド23,24に必ずしも開発しません。また、ハイドロゲル内のセルの配置のための複雑な手続きが必要、磁気細胞パターニング25や生理活性ヒドロゲル26の 2 光子レーザーのようです。
上記の方法で有利であると証明する記載 HMCA ベースの技術: 細胞位置、自発的凝集と貴重な限られた携帯の使用を有効にするいくつかの分散した細胞から回転楕円体の作成を簡単に実現することができますサンプル (e.g。、がん幹細胞、初代培養細胞は、患者検体から派生した)。システム、長期実験中に空間的な正確な位置と同様、回転楕円体を構成する細胞の両方の性質を制御できます。さらに、MC のフラットボトムを容易に同じ焦点距離計画多数回転楕円体の生成、それゆえ広視野顕微鏡を介して大規模なエリアの迅速な照明と画像収集が可能、複雑な必要があります。時間のかかる共焦点の顕微鏡検査。システムは簡単にハンドルとその実用性を実現です。単純な運用手順を適用することによって、回転楕円体の約 50% に匹敵するサイズである回転楕円体集団の高稼働と信頼性の高い癌細胞浸潤容量解析を達成しました。さらに、薬が侵攻能力に及ぼす影響分析できます同時に彼らの細胞増殖抑制や細胞毒性効果多数スフェロイド培養 HMCA デバイスとハイコン テント分析アプローチを使用しています。また、HMCA、携帯電話のすべての要素は共有同じ空間と媒体、それに細胞分泌サイトカイン、ケモカイン、ホルモンおよび ECM27を介したに通常回転楕円体回転楕円体相互作用を調査することが可能。このクロストークは、生存とマクロもボリュームで個々 の細胞/小細胞塊の機能を促進します。
プロトコルの実行の重要なステップは、回転楕円体とその適切な重合を検証する上に ECM の混合物を追加。アセンブリと架橋が発生すると、適切なコラーゲン線維を形成しない限り、ECM、内に埋め込まれている場合でも、スフェロイドは回遊行動を表示されません。BF 照明でコラーゲン線維が観測できるし、コラーゲン線維のこの段階の終わりの作成を確認するには顕微鏡の下でプレートをチェックをお勧めします。回転楕円体の数があるので初期菌体濃度との割合に依存は、MCs を占領初期セル読み込み後配列をチェックする必要があります、セル占有率が最適でない場合同じ配列の再シードを実行する可能性があります。確かに、サイズと記載 HMCA のジオメトリは、比較的小さい細胞塊 (最大 150 μ m) に合わせて設計されていた。配列の新しいタイプの設計細胞遊走細胞のより大きい構造からの分析に必要になりますのでこれは制限を検討する可能性があります。
現在のプラットフォームは、最小限の細胞数と大規模なサンプル サイズ (千プレートごと回転楕円体) を提供すると同時に中の小さな試薬分注容量を利用しています。抗転移活性の 12 の異なる化合物を分析するために 2 つ 6 ウェル HMCA ベース プレートは必要、少なくとも 50 の 96 ウェル プレートは、同じ結果を達成するために必要としながら、約 5,000 回転楕円体から結果を降伏でしょう。HMCA で個々 のオブジェクトの解像度で移行を分析する能力は、高いレベルの統計的信頼性と精度、多数の回転楕円体の構造と機能の侵略の不均一性の研究を有効にするを提供します。
本研究は、一意にでた/号への露出に乳房がん回転楕円体集団の集団の侵入を示しますMCF7 細胞の細胞塊はアメーバの渡り鳥の表現型を示し、形態と各回転楕円体の位置の変化を自動的に達成することができます。我々 の知る限り、多数の 3 D 構造の集合的な侵略のモニタリングや分析が容易になります最初のアレイ システムです。相対方向と各回転楕円体の侵入距離を分析することによって集団内で回転楕円体間の相互作用を研究することが可能です。さらに、がん細胞の動作28細胞外微小環境因子の確立された影響を以下に示します。これらの要因の中で剛性と、微小環境の組成は細胞遊走に強く影響する示されています。HMCA テクノロジーは、定義、バイオミメティック、体外プラットフォーム、ECM のこれらのプロパティに簡単にアクセスおよび制御できますを提供します。純粋なコラーゲンの剛性型ハイドロゲルに本研究で使用した 3 mg/mL の濃度は約 50 600 Pa29,の30,31に報告され、HA (20 μ G/ml; 0.4 wt %) の添加が変わりませんでしたヒドロゲルの剛性大幅32,33。したがって、中分子量 (MMW) の抑制効果-HA を示した 3 D hela 細胞スフェロイドの侵攻でここではない剛性変化のため。これらの結果は、HA 分子量34,35,36,37高い依存性を持つがん細胞浸潤に HA のバイモーダル効果を示した前の研究と一致しています。
メソッドの将来のアプリケーションがサイド バイ サイド多細胞型養殖下流分子分析のため特定回転楕円体の検索とマクロ ウェル内の異なる領域の間質細胞腫瘍の含まれます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、モシェ ・ シモンとジュディス Weisbrodt の遺贈によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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