Summary
صفيحة تصوير على أساس همكا تعرض للغزو مقايسة الأداء. وتيسر هذه اللوحة تشكيل الماغنيسيوم الورم (3D) ثلاثي الأبعاد والقياس من غزو خلايا السرطان في المصفوفة خارج الخلية (ECM). التحديد الكمي المقايسة غزو يتحقق عن طريق تحليل شبه التلقائي.
Abstract
من المعروف أن يسبب 90% فتك السرطان سرطان خبيث. ورم خبيث هو عملية متعددة المراحل الذي يبدأ مع الاختراق/غزو الخلايا السرطانية إلى الأنسجة المجاورة. وهكذا، الغزو خطوة حاسمة في ورم خبيث، مما يجعل الغزو عملية البحث والتطوير المتنقل لمكافحة المخدرات، هامة للغاية. ولمعالجة هذا الطلب، هناك حاجة إلى وضع نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر الذي تقليد الهندسة المعمارية للأورام الصلبة وبهم المكروية أوثق إلى في فيفو الدولة من جهة، ولكن في نفس الوقت يمكن استنساخه وقوية ومناسبة قياسات المحتوى عالية وعالية الغلة. حاليا، معظم غزو فحوصات الانكفاء على التكنولوجيات المتطورة موائع جزيئية وكافية للبحث ولكن ليس لفحص المخدرات كبيرة الحجم. فحوصات أخرى باستخدام الأجهزة المستندة إلى اللوحة مع الماغنيسيوم فردية منعزلة في كل بئر المواد المستهلكة وحجم العينة منخفضة لكل شرط. وهدف البروتوكول الحالي توفير نظام يستند إلى الخلية 3D المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. قمنا بتطوير نموذج ثلاثي الأبعاد للمقايسة غزو استناداً إلى لوحة التصوير همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم واكتشاف الأدوية المضادة المنتشر. ويتيح هذا الجهاز إنتاج الماغنيسيوم موحدة عديدة كل بئر (حجم العينة عالية كل شرط) محاطة بمكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، بينما بشكل مستمر وفي نفس الوقت مراقبة وقياس الماغنيسيوم في القرار عنصر مفرد للمتوسطة فحص الإنتاجية المنتشر لمكافحة المخدرات. هذا المنهاج يرد هنا بإنتاج الماغنيسيوم هيلا و MCF7 لتجسد خلية مفردة والغزو الجماعي. نحن مقارنة تأثير حمض الهيالورونيك المكون إدارة المحتوى في المؤسسة (ها) على قدرة الكولاجين المحيطة الماغنيسيوم الحلة الغازية. وأخيراً، نقدم فيسيتين (غزو المانع) هيلا الماغنيسيوم وأكسيد النيتريك (لا) (غزو المنشط) الماغنيسيوم MCF7. ويتم تحليل النتائج بالبرامج الداخلية التي تمكن من تحليل شبه التلقائي وبسيطة وسريعة مما يسهل فحص المعلمة متعددة.
Introduction
السرطان الموت تعزى أساسا إلى نشر خلايا المنتشر إلى أماكن بعيدة. الكثير من الجهود في معالجة السرطان التركيز على استهداف أو منع تشكيل المستعمرات المنتشر وتطور المرض المنتشر النظامية1. سرطان الخلية الهجرة خطوة حاسمة في عملية استئصال ورم خبيث، وبالتالي، من البحوث المتعلقة بتتالي غزو السرطان مهم جداً وشرط أساسي لإيجاد العلاجات المضادة المنتشر.
قد تم العثور على استخدام نماذج حيوانية كأدوات لدراسة المرض المنتشر لتكون مكلفة للغاية وليس دائماً ممثلة للورم في البشر. وعلاوة على ذلك، طبولوجيا المكروية خارج الخلية والميكانيكا وتكوينها بشدة يؤثر سرطان الخلية السلوك2. نظراً لطبيعتها في فيفو نماذج عدم القدرة على فصل والسيطرة على هذه المعلمات المحددة التي تسهم في غزو السرطان وورم خبيث، هناك حاجة للمحاكاة البيولوجية يمكن السيطرة عليها في المختبر نماذج.
أجل السرطاني على الأجهزة البعيدة، يجب أن يحمل الخلايا السرطانية السمات المظهرية المهاجرة والغازية التي يمكن أن تكون هدفا للعلاج. ومع ذلك، منذ تقليد نماذج السرطان في المختبر معظم الميزات الفعلية من الأورام الصلبة3، أنها صعبة للغاية لكشف تعمل فسيولوجيا ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس المظهرية التي توجد داخل الورم، يملي الحاجة إلى تحليل الهجرة ورم في القرار عنصر مفرد من أجل اكتشاف العلاجات الموجهة النمط الظاهري، على سبيل المثال، عن طريق استهداف الخلية الشروع في ورم خبيث السكان داخل الأورام غير متجانسة4.
ويجري دراسة حركية الخلية والهجرة الجماعية أساسا في ثقافات أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية على الأسطح المستوية متجانسة. هذه النماذج الخلوية التقليدية لسرطان الخلية الهجرة تستند إلى تحليل السكان من الخلايا الفردية الغازية من خلال الأغشية وإدارة المحتوى في المؤسسة مكونات5، ولكن في مثل هذه الأنظمة، لا يمكن أن تكون الاختلافات الجوهرية بين خلايا فردية درس. توليد الماغنيسيوم 3D أما عبر السقالات أو في هياكل صغيرة خالية من السقالة تعتبر متفوقة يعني بدراسة الورم الخلية النمو والسرطان غزو6،،من78. بيد أن معظم النظم 3D ليست مناسبة لتنسيقات عالية الإنتاجية والتفاعل بين الوكالات كروي عادة لا يمكن أن يتحقق منذ الماغنيسيوم فردية منعزلة يتم إنشاؤها في كل الدقيقة، حسنا9. الدراسات الحديثة المتعلقة بهجرة سرطان تستند إلى موائع جزيئية الأجهزة3،10،،من1112، ولكن هذه متطورة موائع جزيئية صعبة لإنتاج أدوات ولا تستخدم لارتفاع الإنتاجية الفحص (HTS) الغازية لمكافحة المخدرات.
اثنين الرئيسية تعمل، الهجرة الخلية الجماعية والفردية، والتي تلعب دوراً في التغلب على الحاجز ECM الخلايا السرطانية وغزو الأنسجة المجاورة، وقد تم إثبات13،14، كل عرض متميزة المورفولوجية الخصائص والآليات البيوكيميائية والجزيئية والوراثية. وباﻹضافة إلى ذلك، لوحظت شكلين لترحيل الخلايا السرطانية، مثل تنتجها الخلايا الليفية واميبيه، في كل النمط الظاهري. منذ على حد سواء، تعمل الغزو وطرق الهجرة، تتحدد أساسا بالخصائص المورفولوجية، هناك حاجة الخلوية نماذج هذا الكشف على أساس تصوير تمكين وفحص جميع أشكال الغزو الورم وتهاجر الخلايا.
والهدف العام للطريقة الحالية تقديم المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه 3D في المختبر نظام يستند إلى الخلية لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. هنا، نحن نقدم لوحة 6-جيدا التصوير على أساس همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم والعلاج المضادة المنتشر. التكنولوجيا تمكن تشكيل عدد كبير من الماغنيسيوم الورم 3D موحدة (450 كل بئر) في بنية مايكرو-دوائر (MC) المائية. مختلف مكونات ECM تضاف إلى الصفيف كروي لتمكين غزو الخلايا في البيئة المحيطة. ويرصد باستمرار المراقبة القصيرة الأجل والطويلة الأجل لنفس الخلايا الفردية الماغنيسيوم/الغازية عملية الغزو ويسهل توصيف الخصائص المورفولوجية وتلطيخ الفلورسنت واسترجاع الماغنيسيوم محددة عند أي نقطة. منذ الماغنيسيوم عديدة مشاركة مساحة والمتوسطة، من الممكن التفاعل عن طريق الجزيئات القابلة للذوبان بين الماغنيسيوم الفردية وتأثيرها على بعضها البعض. يتم إجراء تحليل صورة شبه تلقائية باستخدام MATLAB شفرة داخلية تمكن من جمع كمية كبيرة من البيانات أسرع وأكثر كفاءة. المنهاج يسهل قياس دقيقة وفورية لخلايا عديدة الماغنيسيوم/الغازية بطريقة فعالة من حيث وقت، السماح بفحص الإنتاجية المتوسطة لغزو لمكافحة المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-همكا لوحة النقش
ملاحظة: يتم وصف العملية الكاملة لتصميم وتصنيع ختم بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) ولوحة همكا التصوير المستخدمة في هذا البروتوكول بالتفصيل في أعمالنا السابقة المادتين15،16. ختم PDMS (الشكل السلبي) يستخدم للنقش همكا (الشكل الإيجابي) الذي يتكون من حوالي 450 MCs كل بئر (الشكل 1A). كما هو موضح في الشكل 1 باء، كل الإشراف على شكل هرمي مربع الشكل رأسا مبتوراً (الارتفاع: 190 ميكرون، ومساحة قاعدة صغيرة: 90 ميكرون x 90 ميكرومتر، ومساحة قاعدة كبيرة: 370 مكم x 370 ميكرومتر). يتم استخدام لوحة همكا للإعداد واستزراع من الماغنيسيوم الورم 3D وبعد ذلك، لغزو المقايسة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام طابع تجاري لإنتاج همكا.
- تعد حلاً من 6% انخفاض ذوبان [اغروس] (LMA). إدراج مسحوق والفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) (0.6 جم كل 10 مل من برنامج تلفزيوني) في زجاجة زجاج مع محرض مغناطيسية. ضع الزجاجة على لوحة تدفئة وآثاره الحل أثناء التدفئة إلى 80 درجة مئوية لعدة ساعات حتى يتم التوصل إلى حل موحد. يبقى الحل في 70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- قبل الحرارة الختم PDMS إلى 70 درجة مئوية في الفرن. يبقيه دافئ حتى الاستخدام. وبدلاً من ذلك، استخدم طابع تجاري، واتبع التعليمات.
- وضع لوحات تجارية أسفل الزجاج 6-جيدا في حمام جافة ساخنة مسبقاً إلى 75 درجة مئوية. انتظر لبضع دقائق حتى تصبح اللوحة دافئة تماما.
- من أجل قطره (400 ميليلتر) لما قبل ساخنة على أسفل الزجاج لكل واحدة من الآبار في اللوحة. بلطف ضع ختم PDMS قبل ساخنة على الإسقاط [اغروس]. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 – 10 دقيقة التبلور مسبقاً وقبل التبريد. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتحقيق كامل [اغروس] جيليشن. ثم، بلطف تقشر PDMS, ترك [اغروس] هلام منقوشة مع الإشراف.
ملاحظة: يتم إجراء هذه الخطوة في وقت واحد في جميع الآبار. - ضع لوحة منقوشة في ضوء علاج نظام مجهزة بالأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) مصباح، واحتضان لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: الآن هو لوحة همكا الأشعة فوق البنفسجية للتعقيم. - ملء الماكرو-الآبار مع PBS العقيمة ضمان إبقاء الرطب، ثم تغطية اللوحة، التفاف مع بارافيلم وتخزينه في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- قبل الاستخدام، قم بإفراغ مخلفات برنامج تلفزيوني من لوحة همكا. ضعه في هود البيولوجية.
2-تحميل الخلايا وتشكيل كروي
- جمع الخلايا كما يلي: إزالة المتوسطة كل من 10 سم ثقافة لوحة خلية أحادي الطبقة، وتغسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني التخلص من المخلفات من المصل، وإضافة 5 مل التربسين (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان لمدة 3 دقائق في الحضانة عند 37 درجة مئوية. ثم، اهتز لوحة بلطف لضمان انفصال أحادي الطبقة، وإضافة 10 مل من إكمال المتوسطة (مرحلة ما قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) وماصة صعودا وهبوطاً حتى يتحقق تعليق خلية متجانسة. الطرد المركزي وتغسل تعليق خلية مع 15 مل متوسطة جديدة، ثم تعلق بتركيزات مناسبة في المتوسط كاملة جديدة.
- تحميل تعليق خلية بلطف (~ 16 – 40 50 ميليلتر، 150 – 360 × 103 خلايا/مل في المتوسط، الخلايا الواحدة MC) على رأس همكا وتسمح للخلايا بتسوية بالجاذبية لمدة 15 دقيقة.
- بلطف إضافة مختبرين 6 – 8 من 500 ميليلتر الطازجة المتوسطة (مجموع 3 – 4 مل) إلى حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا خارج الصفيف خاتم والمائية.
- احتضان خلايا هيلا ح 72 وخلايا MCF7 ح 48 في 37 درجة مئوية و 5% CO2، في جو هوميديفيد لتشكيل الماغنيسيوم.
3-إمكانية الكشف بواسطة يوديد Propidium (PI) تلطيخ
- إعداد حل أسهم بي (500 ميكروغرام بي كل 1 مل من برنامج تلفزيوني). يبقيه في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر. طازجة إعداد إضعاف 1:2,000 (0.25 ميكروغرام/مل)، بإضافة 6 ميليلتر من الأسهم إلى 12 مل متوسطة كاملة دون الأحمر الفينول، لوحة همكا 6-جيدا (2 مل في البئر).
- نقل لوحة همكا مع الماغنيسيوم ح 48-72، من الحاضنة إلى هود البيولوجية. إزالة المتوسطة جميع من همكا واسطة يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا بجوار الصفيف المائية، ترك الدبابة الصفيف مليئة بالمتوسطة.
- بلطف إضافة 2 مل لتمييع PI من 3.1 الخطوة لكل بئر، يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو، حسنا. احتضان لوحة همكا ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2، في جو هوميديفيد. تابع إلى الخطوة 7.
ملاحظة: الأصباغ الأخرى يمكن استخدامها هنا كذلك، على سبيل المثال، هويشت لتلطيخ نواة، إستر الميثيل تيتراميثيلرهوداميني (تمرم) لإمكانات غشاء الميتوكوندريا تلطيخ، اسيتات فلوريسسين (FDA) للكشف عن الخلايا الحية، "أنيكسين الخامس" للمبرمج الكشف وغيرها.
4-إعداد الخليط الكولاجين
- تحضير الماء المقطر مزدوجة العقيمة (دو) اﻷوتوكﻻف ومخزون من 100 مل حل تصفية تعقيم هيدروكسيد الصوديوم 1 م. الحفاظ على المواد في RT، ونصائح المستخدمة لإعداد مزيج الكولاجين المجمدة في-20 درجة مئوية، حتى الاستخدام.
- 10 – 20 دقيقة قبل الاستخدام، ضع جميع إينتيرجراديس بما في ذلك: دو العقيمة، حل عقيم M هيدروكسيد الصوديوم 1، 10 العقيمة x برنامج تلفزيوني، النوع الأول من الكولاجين من ذيل الفئران (المخزنة في 4 درجات مئوية لمدة 3 – أشهر) وأنبوب عقيمة في دلو الثلج حتى يبرد تماما. مكان دلو الجليد داخل غطاء البيولوجية.
- إعداد 1,800 ميليلتر من مزيج الكولاجين بتركيز نهائي 3 ملغ/مل، 6-بئر همكا غزو المقايسة لوحة (300 ميليلتر للبئر الواحد) على النحو التالي. إضافة إينتيرجراديس في أنبوب تبريد بالترتيب التالي: 515 ميليلتر من دو، 24.8 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم و 180 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 10 x. مزيج جيد من دوامة ومكان العودة إلى الجليد. وأخيراً، إضافة ميليلتر 1080 الكولاجين إلى الخليط، دوامة مرة أخرى ووضع مرة أخرى في الجليد.
5-ها وإعداد مزيج الكولاجين
- حل 10 مغ هكتار في 2 مل دو العقيمة. احتضان هذا الخليط في RT لبضع دقائق ودوامه برفق حتى يذوب المسحوق تماما. تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين.
- حق قبل الاستخدام، وضع الحل الأسهم هكتار في دلو الجليد داخل غطاء البيولوجية.
- إعداد 3 مغ/مل مزيج الكولاجين كما هو موضح في الخطوة 4. إضافة 36 ميكروغرام (7.2 ميليلتر) من هكتار في 1,800 ميكروليتر من استعداد لاستخدام مزيج الكولاجين، لتركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل. ثم، من دوامة مرة أخرى بإيجاز ووضعها مرة أخرى في الثلج.
6-إضافة خليط إدارة المحتوى في المؤسسة
- نقل لوحة همكا، مع الماغنيسيوم ح 48 – 72، من الحضانة إلى هود البيولوجية ووضعه على الجليد. احتضان لمدة 10 دقائق حتى يتم تبريد اللوحة. الحرارة قبل التوصل إلى حل 1% لما إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إزالة المتوسطة كل من حولها همكا، يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا بجوار الصفيف المائية. ثم إزالة بعناية فائقة، المتوسطة كل من خزان الصفيف مع غرامة نصيحة/هلام تحميل تلميح، التي يميل في نهاية الحافة على حافة الصفيف، بلطف وبطء امتصاص جميع المتوسطة خارج.
ملاحظة: بعد إزالة المتوسطة كل من حول الصفيف المائية، خزان الصفيف لا تزال مليئة بالمتوسطة. وقد هذه الوسيلة المراد إزالتها بلطف جداً من أجل تجنب تدمير المائية MC والتفكك من الماغنيسيوم. - تأخذ 150 ميليلتر مزيج الكولاجين أو خليط هكتار والكولاجين (خليط ECM) مع طرف ما يرام قبل المجمدة وإضافة إلى الخزان الصفيف بإرفاق الحافة إلى الحافة الصفيف. الإفراج عن هذا الخليط ببطء لتجنب التفكك كروي. كرر هذه الخطوة مع قاسمة آخر من 150 ميليلتر، ميليلتر 300 مجموع كل بئر. اتبع نفس الإجراء لكل بئر حتى يتم ملء جميع الآبار. ثم ضع اللوحة في الحاضنة ح 1 جيليشن الكاملة لإدارة المحتوى في المؤسسة.
- بعد أن أنجز جيلاتيون الكاملة لإدارة المحتوى في المؤسسة، "الماصة؛" 400 ميليلتر من قبل حرارة 1% لما فوق هلام إدارة المحتوى في المؤسسة. تغطية اللوحة مع غطاء لها، واحتضان اللوحة على RT لمدة 5 – 7 دقائق، ومن ثم لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، جيلاتيون [اغروس]. وأخيراً، بلطف إضافة 2 مل متوسطة كاملة يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو، حسنا.
ملاحظة: يمنع الطبقة [اغروس] مفرزة المصفوفة جل الكولاجين من همكا.
7-غزو المقايسة اقتناء وتحليل
- تحميل لوحة همكا على محركات مقلوب مرحلة مجهر مجهزة حاضنة، قبل تعديلها إلى 37 درجة مئوية، 5% CO2 وجو هوميديفيد.
- قبل تحديد المواقف للحصول على الصور في كل جيدا حتى تغطي منطقة الصفيف بالكامل، واستخدام 10 X أو 4 X أهداف (هذه الخطوة غير مطلوبة من أجل البرنامج اقتناء الصورة المستخدمة هنا، انظر الجدول المواد أدناه للحصول على التفاصيل). بدلاً من ذلك، استخدم أي برنامج اقتناء الصورة لتسهيل المسح التلقائي للمنطقة المطلوبة بأكملها، باختيار "ستيتش" الخيار.
- اقتناء الصور الميدانية مشرق (BF) كل ح 2 – 4 لفترة مجموعها 24 – 72 ساعة كي تتبع غزو الخلايا من جسم كروي إلى ECM المحيطة بها.
- الحصول على الصور الفلورية لكشف بي باستخدام مكعب فلورسنت مخصصة (الإثارة تصفية 530-550 نانومتر، مرآة مزدوج اللون 565 نانومتر طويلة تمرير والانبعاثات تصفية 600-660 nm).
- تصدير الوقت الفاصل بين فرنك بلجيكي/فلوري الصور من خلال البرنامج الحصول على الصورة وحفظها في تنسيق ملف صور ذي علامات (TIFF) إلى مجلد مخصص باستخدام علامة التبويب "قاعدة البيانات" في شريط الأدوات، ومن ثم الزر "تصدير ملفات السجل" .
ملاحظة: قمنا بتطوير مدونة تحليل داخلي خاص ببرنامج MATLAB يحتوي على واجهة مستخدم الرسومية مصممة (GUI) في الغزو الذي يمكن أن ينفذ تحليل أسرع وأسهل. في هذه التعليمة البرمجية التحليل، يتم تجزئة الماغنيسيوم وغزو المنطقة شبه تلقائياً باستخدام عامل تصفية سوبيل تليها العوامل المورفولوجية تآكل وتمدد. بعد التلقائي تقسيم المناطق، قدمت التصحيحات اليدوية حيث تدعو الحاجة لدقة أفضل. تلقائياً بعد انتهاء الانقسام، مجموعة من معلمات تحسب البرمجيات وتصديرها إلى ملف excel لمزيد من التلاعب. قائمة المعلمات: مجال كروي الأساسية الأقسام في وقت = 0، مجال غزو خلايا متصلة بجسم كروي = الغزو الرئيسي, منطقة الخلايا المفصولة من منطقة الغزو الرئيسي، وعدد الخلايا المفصولة من منطقة الغزو الرئيسي، ومتوسط المسافة من غزو من الدمار لمركز كروي الأساسية إلى المحيط المنطقة الغزو الرئيسي والخلايا المنفصلة والمعلمة بعد الغزو الجماعي = د (د = √ ((س2 -س1)2 + (ص2 -ص1)2) من كتلة من مركز كروي X و Y تنسق، من قبل (س1، ص1) وبعد (س2، ص2) عملية الغزو الجماعي). وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم تحليل الصور مع غيرها من البرامج المتخصصة. - فتح واجهة المستخدم الرسومية وتضغط على الزر "تحميل فرنك بلجيكي" . بعد فتح الصورة، ضبط معايير تجزئة (الحد الأدنى للحجم: > 1 ونصف قطرها إغلاق: > 1) تحقيقا لتجزئة دقيقة كروي ومنطقة الغزو، ثم اضغط الزر "المنطقة للفائدة (ROI) تجزئة" للتنفيذ و سوف تظهر حدود حول كل كروي. إذا كانت التجزئة التلقائية غير صحيحة، اضغط على الزر "حذف" أو "إضافة" وإجراء التصحيحات المطلوبة يدوياً. كرر نفس الخطوات للصور اللاحقة.
- اضغط على زر "تتبع" لعدد الماغنيسيوم والبرنامج سيقوم بتعيين نفس العدد لكل كروي في كل الصور انقضاء الوقت. ثم، اضغط الزر "القياس" ، الذي سيقوم بإنشاء جدول بيانات مع كافة المعلمات. حفظ جدول البيانات هذا كملف excel لاستخدام إضافية في معالجة النتائج والإحصاءات في برنامج أكسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
همكا فريد التصوير لوحة يستخدم للمقايسة غزو من الماغنيسيوم الورم 3D. يتم إجراء فحص كامل، بدءاً بتشكيل كروي وتنتهي بعملية غزو والتلاعب إضافية، ضمن نفس لوحة. تشكيل كروي، خلايا هيلا يتم تحميلها في حوض الصفيف وتسوية في المائية الإشراف بالجاذبية. المائية الإشراف، التي لها خصائص المرفق تمسكا/منخفضة، وتيسير التفاعل خلية خلية وتشكيل الورم 3D الماغنيسيوم. يوضح الشكل 2 ألف الخلايا استقر في الإشراف، عقب استخدام 150 × 103 خلايا/مل تحميل الحل (أي.، ~ 16 الخلايا الواحدة MC تحسب القيمة). من الواضح أن شغل الخلايا الواحدة MC لا توزع بالتساوي عبر الصفيف، وهو توزيع إحصائية حصل على متوسط الخلايا ± 3.60 14.78 الواحدة MC. ويلخص الجدول في الشكل 2 توزيع الخلية الواحدة MC للوحة همكا كله. هو متوسط معامل الاختلاف (CV) توزيع الخلايا داخل ماكرو-بئر 43.33%، بينما هو بين الماكرو-الآبار 24.37%. الاختلافات في شغل الخلية ذات أهمية حاسمة وتملي مباشرة حجم الماغنيسيوم شكلت وعلى التجانس في جميع أنحاء اللوحة. من أجل الحد من/تقليل التغير تم إنشاؤها بواسطة العدد الخلايا كل MC، يتم تحليل النتائج في القرار عنصر مفرد. المؤامرات في الشكل 2-د توضيح توزيع حجم (مساحة مقطعية) الماغنيسيوم 3 أيام. وضوح تتجسد في 2D الشكل أن حساب نسبة النمو لكل كروي (مساحة مقطعية في يوم 3/يوم 2) قد توزيعاً أكثر تجانساً من التوزيع الحجم المطلق (الشكل 2)، مما أسفر عن السيرة ذاتية 15.48% و % 52.80، على التوالي. توزيع كروي قطرها 3 أيام الماغنيسيوم غلة السيرة ذاتية 24 ر 52% ونسبة النمو (قطره في day3/day2) 7.45%. تكون هذه القيم السيرة الذاتية مماثلة إلى17 أو أعلى من18 الأخرى تقارير تحقيق الخلية تحميل بالجاذبية. من أجل القضاء على الفرق المعلمة المقيسة الناجمة عن التغير في عدد الخلايا الأولية المصنف الواحد MC، أنه من الأفضل أن تطبيع المعلمات المحددة لعدد الخلايا الأولية أو أي معلمة أخرى يقاس من نفس الكائن، مثل أن لديه كل كروي سيطرتها الداخلية. ويمكن تطبيق هذا النهج بسهولة عن طريق تتبع الكائن على لوحة التصوير همكا.
ويمكن اتباع عملية تشكيل كروي والنمو بسهولة على همكا التصوير لوحة. يبين الشكل 3 أ-ب صورة فرنك بلجيكي من منطقة واحدة على همكا التصوير صفيحة تحتوي على مجاميع خلية هيلا ح 24، وكل منهما صورة ناضجة، 5–اليوم كائنات ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا، التي أصبحت أكثر كثافة وأكثر كروية. أنه يظهر بوضوح أن معظم الكائنات الاحتفاظ بمواقعها أثناء فترة الحضانة 5 أيام. ويرد تحليل الشكل (كروية) وحجم (مساحة مقطعية) أثناء تشكيل كروي في الشكل 3. يوضح مؤامرة مبعثر الزيادات في كل من المعلمات من يوم 1 إلى يوم 5؛ 0.544 a.u. ±0.020 0.684± a.u. 0.016 لكروية (ف < 0.05) و 0.00356± 0.00013 مم2 إلى 0.00538 ± 0.00015 مم2 لمساحة مقطعية (ف < 0.05)، على التوالي. حين 24-ح المجاميع الصغيرة وغير المنتظمة الشكل، الماغنيسيوم 5 أيام كل منها هي أكبر والحصول على شكل كروي.
يتم تنفيذ الكشف عن صلاحية خلية كروي باستخدام تركيزات منخفضة PI لتلطيخ19 التي تلتف الحاجة إلى صبغ الغسيل. PI يخترق غشاء الخلية، وثم إينتيركالاتيس في الحمض النووي للخلايا غير قابل للحياة. ويبين الشكل 4A 5 أيام هيلا الماغنيسيوم ملطخة PI (باللون الأحمر). ويلخص الشكل 4Bتحليلاً للنسبة المئوية للمنطقة الحمراء (تمثل الخلايا الميتة) من كل منطقة مقطعية كروي. ويبين الرسم البياني أن 85% سكان كروي يحتوي على منطقة قيمة قصوى من 5% أحمر الملون وهو المتوسط 3.01 ± 2.34% (الرسم البياني الأيسر). مساحة مقطعية من الماغنيسيوم (الرسم البياني الأيمن) يبين توزيع عادي مع متوسط 0.02447 0.00487 مم ±2.
بعد إنتاج الماغنيسيوم هيلا ناضجة 3 أيام، يتم إجراء المقايسة غزو داخل همكا التصوير لوحة. ويمكن دراسة تأثير المتغيرات، مثل تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة، ومثبطات والمنشطات، على عملية غزو كروي الورم 3D. لغزو مقايسة الأداء، المتوسط هو بلطف إزالته واستبداله ماصة حل إدارة المحتوى في المؤسسة على الماغنيسيوم في حوض الصفيف MC. بعد جيلاتيون الكامل لحل إدارة المحتوى في المؤسسة، يتم إضافة المتوسطة كاملة في الماكرو-جيدا. (1) من أجل دراسة تأثير ها على عملية غزو عفوية كروي هيلا، كانت مغطاة بالكولاجين وحل خليط هكتار (الشكل 5A) الماغنيسيوم ومقارنة بتلك التي تغطيها مع الكولاجين الحل الوحيد (الشكل 5)، و الصور فرنك بلجيكي تم الحصول عليها بعد جيلاتيون إدارة المحتوى في المؤسسة (t = 0 ح). وأعقب الحركية لعملية غزو التصوير نفس المناطق كل ح 5 لمدة 63 ساعة. بعد 50 ساعة حضانة، الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من الكولاجين وأظهرت هكتار (الشكل 5B) تشتت الخلية السفلي إلى ECM المحيطة بالمقارنة مع الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من الكولاجين فقط (الشكل 5). ويرد تحليل لغزو المنطقة الحركية على مر الزمن، الماغنيسيوم 99 في قرار واحد كروي في الشكل 5E. الشكل 5E مؤامرات منطقة الغزو يعني/متوسط الزمن بين الفريقين، ويدل بوضوح على أن إضافة هكتار للكولاجين يمنع تشتت الخلية خارج كروي، نتج عنه غزو مناطق أصغر. متوسط المنحدرات الناتجة عن الانحدار الخطي منحنيات التسوية لكل من الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من الكولاجين (/h2مم 0.000894 0.001973 ±) مقارنة بالكولاجين وحل ها (/h2مم 0.000941 ± 0.001410) إلى حد كبير مختلفة (p = 0.003، اختبار t: اثنين--نموذج مع افتراض التباينات المتساوية). (2) من أجل دراسة تأثير فيستين (العثور الفلافونويد النشطة بيولوجيا في العديد من الفواكه والخضروات التي تبين أنشطة تثبيط الخلايا وميجراستاتيك بالنيابة عن عدة أهداف جزيئية بما في ذلك فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/Akt/ج-يونيو N-terminal مؤنزم (جنك) مما يشير إلى ودوونريجولاتيس مما يشير إلى مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) Wnt/بيتا-كاتينين وآخرون20) في عملية غزو عفوية كروي هيلا، أضيفت التركيزات المتزايدة للمخدرات إلى متوسط كاملة و الصور فرنك بلجيكي تم الحصول عليها عند t = 0 (الشكل 6A) و 24 ساعة في وقت لاحق (الشكل 6B-ج). كما هو موضح، 10 ميكرون من فيستين (الشكل 6) يمنع تشتت الخلايا حول الماغنيسيوم بالمقارنة مع الماغنيسيوم هيلا غير المعالجة (الشكل 6B). تحليل تجربة استجابة الجرعة (الشكل 6) منطقة الغزو المعارض تثبيط كبيرة في 10-40 ميكرومتر فيستين (ف < 0.003)، تحقيق الإشباع في التركيز من 10 ميكرون وأعلى. (3) قد ثبت أن لا، على مستوى نانو-المولى، يسهم النمط الظاهري سرطان الثدي أكثر عدوانية بحفز التوسع والهجرة الورم16. بغية دراسة تأثير لا على عملية الغزو الجماعي الماغنيسيوم MCF7 جزءا لا يتجزأ من الكولاجين، 1 ميكرومتر من المانحين أكسيد النيتريك/ديثيلينيترياميني (ديتا/لا) أضيفت كاملة الثقافة المتوسطة وفرنك بلجيكي الصور تم الحصول عليها في t = 0 و t = حاء 20 التمثيلية التغييرات في مورفولوجيا ومواقع الماغنيسيوم 3D أثناء التعرض للجهات المانحة لم تتضح (الشكل 7 أ-ب). الماغنيسيوم تفقد بهم كروية وتصبح أكثر ممدود الحصول على النمط الظاهري المهاجرة أميبية. في الوقت ذاته، لوحظ إزفاء معززة من الماغنيسيوم داخل المصفوفة الكولاجين المحيطة بها (الشكل 7). استطالة متوسط قيمة زيادة كبيرة من 1.305 ± 0.193 a.u. إلى ± 1.477 0.298 a.u.، (ف < 0.0006). الهجرة متوسط المسافة الماغنيسيوم نفس قياس درجة كبيرة مددت، 0.0788 ± 0.0575 مم و ± 0.3164 مم 0.3365 في الغياب وحضور ديتا/لا، على التوالي (ف < 4 × 10-6).
تحليل الصور للغزو كروي حققت برامج MATLAB داخلية شبه التلقائي. صور انقضاء الوقت المكتسبة تشكيل كروي وغزو داخل همكا يتكون من الماغنيسيوم متعددة في صورة واحدة (4-6 الماغنيسيوم في 10 X التكبير والماغنيسيوم 25-30 في التكبير X 4). وأجرى تحليل تشكيل كروي، والنمو وغزو في الوقت ذاته على جميع الماغنيسيوم في الصورة. البارامترات الرئيسية التي استخرجت لغزو كروي ترد في الشكل 8 أ، مما يدل على تجزئة صورة تمثيلية من الماغنيسيوم 4 عند نقطة واحدة من وقت (t = ح 16). منطقة الغزو الرئيسية المحددة بحد أحمر، فضلا عن الخلايا المنفصلة التي فض الاشتباك وفرَّقت حوله (المشار إليها بالأسهم السوداء)، وتعقب ومرقمة لكل كروي على مر الزمن. حجم كروي قبل الغزو عند t = 0 يتم تعريفها بحدود زرقاء. يحسب من تجزئة أحمر مطوقة بالغزو يعني/متوسط المسافة من مركز كروي الكتلة إلى محيط المنطقة الغزو بما في ذلك الخلايا المنفصلة وهو مبين بالأسهم الصفراء. ويلخص البيانات المستخرجة من هذه التجربة الوقت الفاصل بين الشكل 8B-د. الرقم 8B المعارض الارتقاء بالغزو يعني المسافة من كل مركز كروي على مر الزمن. الشكل 8 المعارض الارتقاء بمنطقة الغزو الإجمالي في كل من الماغنيسيوم على مر الزمن (بما في ذلك مجال غزو الرئيسية ومنطقة فصل/فصل-الخلية). الشكل 8 1-4 يبين حجم الخلية فصل المنطقة مقارنة بمنطقة الغزو إجمالي لكل كروي (مع مرور الوقت). العدد التراكمي لفصل الخلايا هو 33, 7 و 4 و 5 الماغنيسيوم #1 و #2، #3 و #4، على التوالي. ويبين تحليل الأرقام التراكمية لفصل الخلايا ما يزيد على 20 ح غزو التي تم الحصول عليها من 126 هيلا الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من الكولاجين 8E الشكل. يتضح هنا أن هناك توزيعاً هائلة في عدد الخلايا المخلاة في دراسة السكان ومتوسط قيمة 12.3 ± 12.8 الخلايا.
رقم 1: "همكا" التصوير لوحة. (أ) صورة من بئر واحدة الماكرو تنقش مع همكا. (ب) مقطع عرضي لمولودية واحد داخل همكا التصوير لوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التجانس من خلية التوزيع وكروي نسبة النمو في همكا التصوير لوحة. (أ) تراكب فرنك بلجيكي وصور مضيئة من همكا محملة بخلايا هيلا ملطخة مسبقاً هويشت 33342 1 ميكروغرام/مل (تحميل تركيز 150 × 103 خلايا كل مل). الصور التي تم الحصول عليها بعد تسوية الخليوي في تكبير MC. الصورة 4 X، شريط مقياس = 500 ميكرومتر. (ب) الجدول يلخص توزيع خلايا هيلا داخل لوحة التصوير همكا-6-جيدا. كانت تحسب الخلايا من يصل إلى 90 MC/الماكرو-جيدا. وترد النتائج يعني يحسب ± الانحراف المعياري (SD)، السيرة الذاتية (SD/mean100) داخل وبين الماكرو-الآبار. (ج) توزيع الرسم البياني من مساحة مقطعية الماغنيسيوم يوم 3، ن = 418، تحدد من الصور فرنك بلجيكي. (د) توزيع الرسم البياني لنسبة النمو كروي (مساحة مقطعية في يوم 3/يوم 2). يتم احتساب نسبة النمو في القرار عنصر مفرد لكل من الماغنيسيوم 418. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تتبع تشكيل كروي في همكا التصوير لوحة. صورة فرنك بلجيكي لخلايا هيلا (تحميل خلايا 120 × 103 تركيز كل مل) المحتضنة في همكا لمدة يوم واحد (A) و 5 أيام (ب). صورة التكبير 4 X، شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ج) مبعثر مؤامرة من كروية كائن ثلاثي الأبعاد كدالة مساحة مقطعية، بعد يوم 1 (الماس الأزرق) و 5 أيام (المربعات براون) من الحضانة بعد تحميل الخلية. تمثل كل علامة البيانات تم تحليلها من كروي واحد، n = 83. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الكشف عن صلاحية خلية في الماغنيسيوم ناضجة. تراكب فرنك بلجيكي والصور الفلورية من الماغنيسيوم يوم 5 (تحميل خلايا 360 × 103 تركيز كل مل) ملطخة بي 0.25 ميكروغرام/مل (A). صورة التكبير 4 X، شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) توزيع الرسم البياني في المائة من منطقة بي نسبة إلى مساحة مقطعية من كروي (اللوحة اليمنى) والرسم البياني توزيع مساحة مقطعية (اللوحة اليمنى)، n = 84. يحسب القرار عنصر مفرد لكل من الماغنيسيوم 84 بالمائة من مساحة PI. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تأثير تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة في عملية غزو كروي. صور فرنك بلجيكي ليوم 3 هيلا الماغنيسيوم جزءا لا يتجزأ من مزيج من الكولاجين 3 ملغ/مل و 20 ميكروغرام/مل هكتار (A) و 3 ملغ/مل الكولاجين (ج)، عند t = 0 ح وبعد 50 ساعة من الحضانة (ب) و (د)، على التوالي. صورة التكبير 10 ×، شريط مقياس = 200 ميكرومتر. تم تحميل همكا التصوير لوحة على خشبة المسرح المجهر المقلوب مجهزة بالحاضنة. الصور تم الحصول عليها كل ح 5 ويرد تحليل الحركية في الأرض (ﻫ)، n = 99. ويمثل كل منحنى ± يعني SD من غزو المنطقة زيادة على مر الزمن، للكولاجين وها (الماس الأزرق) والكولاجين فقط (المربعات براون). منحنى متوسط الانحدار الخطي والمعادلات والتربيعي هي المشار إليها أعلاه المنحنيات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: فيستين يمنع غزو عفوية من الماغنيسيوم هيلا. صور فرنك بلجيكي ليوم 3 هيلا الماغنيسيوم، جزءا لا يتجزأ من خليط من 3 ملغ/مل الكولاجين (A) في t = 0، ومن ثم، 24 ساعة بعد إضافة 0 ميكرومتر (ب) و 10 ميكرون فيسيتين (ج) إلى متوسط الثقافة كاملة. صورة التكبير 4 X، شريط مقياس = 500 ميكرومتر. تحليل لغزو المنطقة لكل كروي عند نقطة نهاية (t = ح 24) يرد في الأرض (د)، n = 488. يمثل المنحنى SD ± يعني غزو المنطقة كدالة من 0-40 ميكرومتر فيستين. العلاج فيستين يعوق إلى حد كبير الغزو في 10 ميكرون (ف = 4.65 × 10-6)، 20 ميكرومتر (ف = 0.0021) و 40 ميكرومتر (ف = 4.86 × 10-8)، استخدام الاختبار t: اثنين--نموذج مع افتراض التباينات المتساوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: لا يدفع الغزو الجماعي في الماغنيسيوم سرطان الثدي MCF 7. صور BF 2 يوم MCF 7 الثدي السرطان الماغنيسيوم، جزءا لا يتجزأ من الكولاجين () في (t = 0) و (ب) بعد التعرض ح 20 إلى 1 ميكرومتر ديتا/لا تجزئة دوروا كروي هو تعريف بالحدود الحمراء مضافين ومرقمة باللون الأحمر على الصور فرنك بلجيكي A و "رويس باء" المعرفة بحدود زرقاء، مضافين في حجم كروي تمثل الصورة ب فرنك بلجيكي والموقع في تي = 0. التكبير 4 X, مقياس بار = 500 ميكرومتر. (ج) A مبعثر مؤامرة للعلاقة بين المسافة وعامل الهجرة استطالة من الماغنيسيوم سرطان الثدي الفردية عند التعرض إلى 1 ميكرومتر ديتا/لا (المربعات براون) كمقابل للتحكم (الماس الأزرق) عند t = 20 h, n = 54. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: تحليل الصور عفوية غزو الخلية هيلا. صور فرنك بلجيكي لمدة 3 أيام هيلا الماغنيسيوم، ح 16 بعد تضمينها في الكولاجين (A). التكبير 10 X. يعرف كروي غزو المنطقة وفصل الخلايا الحدود الحمراء، حجم كروي عند t = 0 تتحدد بحدود زرقاء، ويشار إلى غزو يعني المسافة من مركز كروي الكتلة بالأسهم الصفراء، وفصل الخلايا المشار إليها بواسطة السهام السوداء. ارسم الزيادة مع مرور الوقت لغزو يعني المسافة من مركز كروي الكتلة (ب) ومجموع غزو المنطقة (ج). المنحنيات تمثل كروي #1 (الماس الأزرق)، كروي #2 (المربعات براون)، كروي #3 (مثلثات خضراء) وكروي #4 (Xs الأرجواني). (د) شريط المخطط الرئيسي (أزرق) وفصل الخلية (براون) غزو المنطقة زيادة على مر الزمن. (ﻫ) توزيع الرسم البياني للعدد التراكمي للخلايا المنفصلة الواحدة كروي أثناء ح 20 عملية غزو، n = 126. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنه تم توثيقه جيدا أن الكائنات الحية، تتميز بمنظمتهم متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد المعقدة متميزة تماما عن الخلايا أحادي الطبقة 2D استخداماً مثقف، وإذ تشدد على الحاجة الماسة إلى استخدام النماذج الخلوية التي تحاكي الوظائف أفضل وفحص عمليات الحي للمخدرات. ، الماغنيسيوم متعددة الثقافات أورجانوتيبيك وأورجانويدس وأجهزة على رقاقة في الآونة الأخيرة أدخلت8 لاستخدامها في اكتشاف الأدوية الموحدة. ومع ذلك، يهدد بالغة التعقيد نموذجية متعددة الخلايا 3D كثيرا متانة والموازاة وتحليل البيانات التي تعتبر حاسمة بالنسبة لكفاءة الإنزيم.
عادة تدابير التقييم الكمي للقدرات غزو حركة الخلايا من خلال المواد المائية. بغية قياس غزو الورم باستخدام التقليدية الصغيرة، حسنا لوحات، المصنفة في جولة أسفل لوحات أعدادا كبيرة من الخلايا السرطانية واضطر إلى تجميع باستخدام الطرد المركزي21،22. هذه اللوحات تقييد التفاعل خلية/كروي في مجاورة الآبار، بينما الجزء السفلي جولة يعوق الجودة البصرية وتعقيد الحصول على الصور. في أساليب أخرى، خلايا فردية مغلفة عشوائياً داخل المائية، تنمو وتعمل في بيئة 3D لكن لا تتحول بالضرورة إلى الماغنيسيوم ناضجة23،24. وعلاوة على ذلك، إجراءات معقدة لتحديد المواقع خلية داخل المائية المطلوبة، مثل الخلية على أساس القوة المغناطيسية الزخرفة25 أو إشعاع الليزر اثنين-فوتون الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا26.
هذه التكنولوجيا على أساس همكا المعروضة هنا يثبت أن تكون مفيدة أكثر الأساليب المذكورة أعلاه: خلية التجميع العفوي، وتحديد المواقع وإنشاء الماغنيسيوم من خلايا متفرقة قليلة يمكن بسهولة تحقيق، مما يتيح استخدام الخليوي محدودة القيمة عينة (على سبيل المثال-، الخلايا الجذعية مثل السرطان أو الخلايا الأولية المستمدة من عينات المرضى). أن النظام قد تحكم على طبيعة الخلايا التي تؤلف الماغنيسيوم وكذلك عبر موقعهما المكانية خلال تجارب طويلة الأجل. وباﻹضافة إلى ذلك، أسفل شقة مولودية يسهل توليد الماغنيسيوم العديدة على نفس خطة التنسيق، ومن ثم سرعة اكتساب مساحات كبيرة عبر مجهر حقل واسعة الإضاءة والصورة ممكن، مما يلغي الحاجة لتعقيد مجهر [كنفوكل] تستغرق وقتاً طويلاً. النظام من السهل التعامل والتطبيق العملي لها عمليا. عن طريق تطبيق إجراءات تشغيلية بسيطة، حققنا أشغال عالية كروي السكان فيها بحوالي 50% الماغنيسيوم حجم مماثل، وإجراء تحليل موثوق بها من السعة غزو خلايا السرطان. وباﻹضافة إلى ذلك، أثر المخدرات على القدرات غزو يمكن تحليلها في وقت واحد مع آثارها القاتلة و/أو السامة للخلايا باستخدام نهج تحليل المحتوى عالية جنبا إلى جنب مع جهاز همكا مثقف مع الماغنيسيوم العديدة. وعلاوة على ذلك، مشاركة جميع العناصر الخلوية في همكا، نفس المساحة والمتوسطة، مما يجعل من الممكن للتحقيق كروي كروي التفاعل الذي يتم عادة بوساطة عبر السيتوكينات يفرز خلية المستقطبات والهرمونات و إدارة المحتوى في المؤسسة27. وييسر هذا عبر الحديث البقاء على قيد الحياة والوظيفة لمجموعات الخلية الصغيرة الخلايا الفردية في الحجم الكلي، حسنا.
خطوة حاسمة في تنفيذ البروتوكول هو إضافة خليط ECM على رأس الماغنيسيوم والتحقق من صحة البلمرة المناسبة لها. لن تظهر الماغنيسيوم سلوك الهجرة حتى لو أنها مضمنة داخل إدارة المحتوى في المؤسسة، ما لم تحدث الجمعية والعابرة للربط، ويتم تشكيل ألياف الكولاجين المناسبة. يمكن ملاحظة ألياف الكولاجين بالإضاءة فرنك بلجيكي، وإننا ننصح بالتحقق من لوحة تحت مجهر للتأكيد على إنشاء ألياف الكولاجين في نهاية هذه المرحلة. نظراً لعدد الماغنيسيوم المحتلة تعتمد على تركيز الخلية الأولى والنسبة المئوية للرصد والمراقبة، يجب التحقق من الصفيف بعد تحميل الخلية الأولى، وإذا شغل الخلية ليس الحل الأمثل، يمكن تنفيذ إعادة البذر في الصفيف نفس. في الواقع، حجم وهندسة همكا الموضحة هنا صممت لاستيعاب مجموعات خلية صغيرة نسبيا (يصل إلى 150 ميكرومتر في القطر). وهذا يمكن أن تعتبر قيداً نظراً تصميم نوع جديد من الصفيف سيكون ضروريا لتحليل الهجرة الخلية من أكبر الهياكل الخلية.
ويستخدم النظام الأساسي الحالي عدد الخلايا الحد الأدنى وكاشف صغيرة الحجم، بينما في نفس الوقت بتوفير حجم عينة كبيرة (آلاف الماغنيسيوم للوحة الواحدة). من أجل تحليل 12 مركبات مختلفة للنشاط المضادة المنتشر، سيكون 2 لوحات همكا على أساس 6-بئر واحدة المطلوبة، مما أسفر عن النتائج من الماغنيسيوم حوالي 5,000، بينما يلزم خمسين على الأقل 96-جيدا لوحات لتحقيق نفس النتائج. القدرة على تحليل الهجرة في القرار الكائن الفرد في همكا يوفر مستوى عاليا من متانة الإحصائية ودقتها وتمكين دراسة التغاير غزو الهيكلية والوظيفية في الماغنيسيوم العديدة.
وتوضح هذه الدراسة فريد الغزو الجماعي للسكان كروي سرطان الثدي عند التعرض لديتا/رقم إظهار المجموعات خلية من خلايا MCF7 أميبية النمط الظاهري المهاجرة، والتغيرات الكمية في مورفولوجيا والموقع لكل كروي يمكن أن يتحقق تلقائياً. على حد علمنا، هذا هو أول نظام أرراييد التي يسهل رصدها وتحليلها للغزو الجماعي في العديد من هياكل ثلاثية الأبعاد. من الممكن عن طريق تحليل الاتجاهات النسبية والمسافة غزو لكل كروي، لدراسة التفاعل المتبادل بين الماغنيسيوم داخل السكان. بالإضافة إلى ذلك، يتضح تأثير العوامل المكروية خارج الخلية المنشأة على سرطان الخلية سلوك28 هنا. ومن بين هذه العوامل، قد ثبت صلابة وتكوين المكروية التأثير بقوة على الهجرة الخلية. وتوفر تكنولوجيا همكا المحاكاة البيولوجية محددة،، في المختبر منصة، الذي هذه الخصائص إدارة المحتوى في المؤسسة يمكن بسهولة الوصول إليها والتحكم. تصلب النقي الكولاجين النوع الأول المائية في تركيز 3 مغ/مل التي استخدمت في هذه الدراسة، وتفيد التقارير أن حوالي 50 600 السلطة الفلسطينية29،،من3031 ولم يغير إضافة هكتار (20 ميكروغرام/مل؛ 0.4 wt %) صلابة المائية شكل كبير32،33. وهكذا أثر القمعية من الوزن الجزيئي المتوسط (الشهرية)-ها على غزو 3D هيلا الماغنيسيوم الذي تجلى هنا ليس بسبب تصلب التغييرات. هذه النتائج الاتفاق مع الدراسات السابقة التي أظهرت تأثير ثنائي الصيغة من ها على غزو خلايا السرطان مع الاعتماد الكبير على ها الوزن الجزيئي34،35،،من3637.
وتشمل التطبيقات المستقبلية للأساليب متعددة جنبا إلى جنب في استزراع نوع خلية الورم والخلايا اللحمية في مناطق مختلفة داخل الماكرو-البئر، واسترجاع الماغنيسيوم محددة للتحليل الجزيئي المتلقين للمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل وصية شمعون موشي وجوديث ويسبرودت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
