Summary
En HMCA-baseret tænkelig plade præsenteres for invasion assay ydeevne. Denne plade letter dannelsen af tre-dimensionelle (3D) tumor spheroids og måling af kræft celle invasion i den ekstracellulære matrix (ECM). Invasion assay kvantificering opnås ved halvautomatiske analyse.
Abstract
Kræft metastaser er kendt for at forårsage 90% af kræft dødelighed. Metastaser er en flertrins proces, som starter med penetration/invasion af tumorceller i omkringliggende væv. Invasionen er således et afgørende skridt i metastase, gør invasion proces forskning og udvikling af anti-metastatisk narkotika, meget sigende. For at løse dette krav, der er behov for at udvikle 3D in vitro- modeller, der imiterer arkitektur af solide tumorer og deres mikromiljø tættest til i vivo staten på den ene side, men på samme tid være reproducerbare, robust og velegnet til højt udbytte og høj indhold målinger. I øjeblikket, de fleste invasion assays lean på sofistikeret mikrofluid teknologier, som er passende for forskning, men ikke for høj lydstyrke stof screening. Andre assays ved hjælp af plade-baserede enheder med isolerede enkelte spheroids i hver brønd er materiale forbruger og har lav stikprøvestørrelse pr. betingelse. Målet med den nuværende protokol er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D celle-baseret system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Vi udviklede en 3D model for invasion analysen baseret på HMCA imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk drug discovery. Denne enhed gør det muligt for produktion af talrige ensartet spheroids pr. brønd (høj stikprøvestørrelse pr. betingelse) omgivet af ECM komponenter, mens løbende og samtidig observere og måle spheroids på ét element opløsning til mellemstore throughput screening af anti-metastatisk narkotika. Denne platform er præsenteret her af produktionen af HeLa og MCF7 spheroids for eksemplificere enkelt celle og kollektive invasion. Vi sammenligner indflydelse af ECM komponent hyaluronsyre (HA) på kollagen omkring HeLa spheroids invasive kapacitet. Endelig, vi introducere Fisetin (invasion hæmmer) til HeLa spheroids og nitrogenoxid (NO) (invasion aktivator) til MCF7 spheroids. Resultaterne er analyseret af in-house software, som gør det muligt for semi-automatiske, enkel og hurtig analyse, som letter multi-parameter undersøgelse.
Introduction
Kræft død er hovedsagelig tilskrives spredning af metastatisk celler til fjerne steder. Mange bestræbelser i kræftbehandling fokusere på målretning eller forhindre dannelsen af metastatisk kolonier og progression af systemisk metastatisk sygdom1. Kræft celle migration er et afgørende skridt i tumor metastaser proces, forskning i kræft invasion cascade er således meget vigtigt og en forudsætning for at finde anti-metastatisk therapeutics.
Anvendelsen af dyremodeller som værktøjer til at studere metastatisk sygdom er blevet fundet for at være meget dyrt og ikke altid repræsentativt for tumor hos mennesker. Desuden påvirker de ekstracellulære mikromiljø topologi, mekanik og sammensætning kraftigt kræft celle opførsel2. Da i vivo modeller i sagens natur mangler evnen til at adskille og kontrollere sådanne specifikke parametre, som bidrager til kræft invasion og metastaser, er der behov for en kontrollerbar biomimetiske in vitro- modeller.
For at metastaserer til fjerntliggende organer, skal kræftceller udstille vandrende og invasive fænotypiske egenskaber, som kan målrettes til terapi. Da de fleste in vitro- kræftmodeller ikke efterligne de faktiske funktioner af solide tumorer3, er det imidlertid meget udfordrende at opdage fysiologisk relevante fænotyper. Derudover dikterer fænotypiske heterogenitet, der findes inden for tumor, at analysere tumor migration på ét element beslutning for at opdage fænotype-instrueret behandlinger, for eksempel ved at målrette den metastase-indlede celle befolkningen i heterogene tumorer4.
Undersøgelse af celle motilitet og kollektive migration er primært udført i éncellelag kulturer af epitelceller på homogene plane overflader. Disse konventionelle cellulære modeller for kræft celle migration er baseret på befolkning analysen af individuelle celler invaderer gennem membraner og ECM komponenter5, men i sådanne systemer, de iboende forskelle mellem individuelle celler ikke kan være studerede. Generere 3D spheroids enten via stilladser eller stillads-gratis mikro-strukturer er betragtes som en overlegen betyder at studere tumor celle vækst og cancer invasion6,7,8. Dog mest 3D systemer er ikke egnet til høj overførselshastighed formater, og Inter klumpformet interaktion opnås normalt ikke da isolerede enkelte spheroids genereres i hver mikro-godt9. Nylige undersøgelser der involverer kræft migration er baseret på mikrofluid enheder3,10,11,12, men disse sofistikerede mikrofluid værktøjer er vanskelige at producere og ikke kan bruges til high throughput screening (HTS) af anti-invasive narkotika.
To vigtigste fænotyper, kollektive og individuelle celle migration, som spiller en rolle i tumorceller at overvinde ECM barriere og invaderer nærliggende væv, har været demonstreret13,14, hver viser forskellige morfologiske karakteristika, biokemiske, molekylære og genetiske mekanismer. Desuden er to former for overflytning tumorceller, fibroblast-lignende og amoeboid, observeret i hver fænotype. Da begge, invasion fænotyper og migration tilstande, defineres primært ved morfologiske egenskaber, der er behov for cellulær modeller at aktivere imaging-baseret detektion og behandling af alle former for tumor invasion og overflytning af celler.
Det overordnede mål i den aktuelle metode er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D i vitro celle-baserede system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Her introducerer vi HMCA-baserede 6-godt imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk terapi. Teknologien gør det muligt for dannelsen af et stort antal ensartet 3D tumor spheroids (450 pr. brønd) i en hydrogel mikro-kamre (MC) struktur. Forskellige ECM komponenter føjes til matrixen klumpformet aktivere invasion af celler ind i det omgivende miljø. Invasion processen overvåges løbende af kort og lang sigt observation af de samme individuelle spheroids/invaderer celler og letter morfologiske karakteristika, fluorescerende farvning og hentning af specifikke spheroids på ethvert tidspunkt. Da talrige spheroids deler plads og medium, er interaktion via opløselige molekyler mellem individuelle spheroids og deres indvirkning på hinanden muligt. Semi-automatisk billedanalyse udføres ved hjælp af in-house MATLAB kode, som giver mulighed for hurtigere og mere effektiv samling af store datamængder. Platformen letter præcise, samtidig måling af talrige spheroids/invaderer celler i en tid-effektive måde, medium throughput screening af anti-invasion narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HMCA plade prægning
Bemærk: Den komplet proces for design og fabrikation af Polydimethylsiloxan (PDMS) stempel og HMCA imaging plade anvendes i denne protokol er beskrevet i detaljer i vores tidligere artikel15,16. PDMS stempel (negativ form) bruges til prægning HMCA (positiv form), som består af omkring 450 MCs pr. brønd (figur 1A). Som vist i figur 1B, hver af MCs har en form af en afkortet hovedet firkantet pyramide (højde: 190 µm, små basisareal: 90 µm x 90 µm, og store basisareal: 370 µm x 370 µm). HMCA plade anvendes til forberedelse og dyrkning af 3D tumor spheroids og derefter til invasion assay. Alternativt kunne en kommerciel stempel bruges til produktion af HMCA.
- Der fremstilles en opløsning af 6% lavt smeltepunkt Agarosen (LMA). Indsætte LMA pulver og sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (0,6 g af LMA pr. 10 mL PBS) i en glasflaske med en magnetomrører. Læg flasken på en varme plade og rør løsning samtidig opvarmning til 80 ° C i et par timer, indtil en ensartet løsning opnås. Holde løsningen ved 70 ° C indtil brug.
- Pre heat PDMS stempel til 70 ° C i ovnen. Holde det varme indtil brug. Alternativt kan du bruge en kommerciel stempel og følg instruktionen.
- Placere kommercielle 6-godt glas-bund plader på en tør bad forvarmet til 75 ° C. Vent et par minutter, indtil pladen er helt varm.
- Hæld en dråbe (400 µL) forvarmet LMA på glas bunden af hver enkelt af brøndene i pladen. Anbring forsigtigt forvarmet PDMS stempel over Agarosen drop. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 5-10 min til pre geldannende og Pre-køling. Der inkuberes ved 4 ° C i 20 min. til at opnå fuld Agarosen gellation. Derefter forsigtigt skrælle PDMS, forlader agarosegel mønstrede med MCs.
Bemærk: Dette trin sker samtidigt i alle brønde. - Prægede pladen anbringes i en lys hærdende system udstyret med ultraviolet (UV) lampe, og der inkuberes i 3 min.
Bemærk: Nu HMCA plade er UV steriliseret. - Fylde makro-brøndene med steril PBS til at sikre, at de holdes fugtigt, derefter dække nummerpladen, Pak det med parafilm og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- Før brug, tømme PBS restprodukter fra HMCA plade. Placere den i den biologiske hætte.
2. ladning celler og klumpformet dannelse
- Indsamle cellerne som følger: Fjern alle medium fra et 10 cm kultur plade celle éncellelag, vaskes to gange med 10 mL PBS til at bortskaffe serum residualer, tilsættes 5 mL trypsin (pre-hjertelig til 37 ° C) og Inkuber i 3 min. i varmeskab ved 37 ° C. Derefter, ryste plade forsigtigt at sikre éncellelag detachement, der tilsættes 10 mL af komplette mellemstore (pre-hjertelig til 37 ° C) og pipetteres op og ned indtil homogen cellesuspension opnås. Der centrifugeres og vaske cellesuspension med 15 mL frisk medium, så suspendere i passende koncentrationer i frisk komplet medium.
- Forsigtigt indlæse cellesuspension (50 µL, 150-360 x 103 celler/mL i medium, ~ 16 – 40 celler pr. MC) oven på HMCA og tillade cellerne til at afregne ved tyngdekraft i 15 min.
- Forsigtigt tilføje 6 – 8 delprøver af 500 µL frisk medium (samlede 3-4 mL) med makro-godt plast bunden uden for ring og hydrogel arrayet rand.
- Inkuber HeLa celler for 72 h og MCF7 celler i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2, i en fugtig atmosfære for dannelsen af spheroids.
3. levedygtighed påvisning af Propidium Iodid (PI) farvning
- Forberede en stamopløsning af PI (500 µg af PI per 1 mL PBS). Holde det ved 4 ° C i ca 6 måneder. Frisk forberede en fortynding af 1:2,000 (0,25 µg/mL), ved tilsætning af 6 µL af materiel til 12 mL komplet medie uden phenol rød, 6-godt HMCA plade (2 mL pr. brønd).
- Overføre HMCA pladen med 48-72 h spheroids, fra inkubator til den biologiske hætte. Fjern alle medium fra HMCA af skæve spids ende på kanten af den makro-godt plast bunden ved siden af matrixen hydrogel, forlader matrix tank fyldt med medium.
- Forsigtigt tilføje 2 mL af PI fortynding fra trin 3.1 til hver brønd af skæve spids ende på kanten af den makro-godt plastik bund. Inkubér HMCA plade i 1 timer ved 37 ° C og 5% CO2, i en fugtig atmosfære. Fortsæt til trin 7.
Bemærk: Andre farvestoffer kan bruges her så godt, for eksempel, Hoechst for nucleus farvning, tetramethylrhodamine methylester (TMRM) til mitokondrielle membran potentiale farvning, fluorescein diacetat (FDA) til påvisning af levende celler, Annexin V for apoptose registrerings- og andre.
4. kollagen blanding forberedelse
- Forberede sterile dobbelt destilleret vand (DDW) af autoklave og et lager af 100 mL 1 M natriumhydroxidoploesning filter-steriliseret. Vedligeholde materialer på RT og tips til kollagen blanding forberedelse frosset ved-20 ° C, indtil brug.
- 10 – 20 min før brug, placere alle intergrades herunder: sterile DDW, 1 M NaOH steril opløsning, sterile 10 x PBS, skriver jeg kollagen fra rotte hale (opbevares ved 4 ° C for 3-måneder) og en steril tube i isspand indtil helt afkølet. Sted isspand inde i biologiske hætten.
- Forberede 1.800 µL af kollagen blandingen i en endelig koncentration på 3 mg/mL, 6-godt HMCA invasion assay plade (300 µL pr. brønd) som følger. Tilføj intergrades ind i den afkølede rør i følgende rækkefølge: 515 µL af DDW, 24,8 µL 1 M NaOH og 180 µL 10 x PBS. Bland godt af vortex og sted tilbage ind i isen. Endelig, tilføje 1080 µL af kollagen til blandingen, vortex igen og sat tilbage i isen.
5. HA og kollagen blanding forberedelse
- 10 mg HA i 2 mL sterilt DDW opløses. Inkuber blanding på RT for et par minutter og vortex forsigtigt indtil pulveret er helt opløst. Gemme stamopløsning ved 4 ° C i op til to år.
- Lige før brug, placere HA stamopløsning i isspand inde i biologiske hætten.
- Forbered en 3 mg/mL kollagen blanding som beskrevet i trin 4. Tilføje 36 µg (7,2 µL) ha til 1.800 μL af klar til at bruge kollagen blanding, til en slutkoncentration på 20 µg/mL. Så vortex igen kort og sætte ind i is.
6. ECM blandingen ud
- Overføre HMCA pladen, med 48-72 h spheroids, fra rugemaskinen i den biologiske hood og placere den på isen. Der inkuberes i 10 min, indtil pladen er afkølet. Pre varme en opløsning af 1% LMA til 37 ° C i et vandbad.
- Fjerne alle medium fra omkring HMCA, af skæve spids ende på kanten af den makro-godt plast bunden ved siden af matrixen hydrogel. Meget grundigt, fjern derefter alle medium fra array tank med en fin spids/gel lastning tip, ved hælder spids ende udkanten array, blidt og langsomt sugende alle mellemlang ud.
Bemærk: Efter at fjerne alle medium fra omkring matrixen hydrogel, array tank er stadig fyldt med medium. Dette medie har at blive fjernet meget forsigtigt for at undgå ødelæggelse af hydrogel MC og dislokation af spheroids. - Tage 150 µL af kollagen blanding eller HA og kollagen blanding (ECM blanding) med den pre frosne fine spids og tilføje i array tanken ved at knytte tip til array kant. Slip blandingen langsomt for at undgå klumpformet dislokation. Gentag dette trin med en anden alikvot af 150 µL, for en samlet 300 µL pr. brønd. Følg den samme procedure for hver brønd, indtil alle wells er fyldt. Derefter placere pladen i inkubator for 1 h til den fulde gellation af ECM.
- Efter den fulde gellation af ECM har opnået, afpipetteres 400 µL af pre varmede 1% LMA oven på ECM gel. Dække pladen med låg, inkuberes plade på RT for 5-7 min og så 2 min. ved 4 ° C, til Agarosen gellation. Endelig, forsigtigt tilsættes 2 mL af komplette mellemstore af skæve spids ende på kanten af den makro-godt plastik bund.
Bemærk: Agarosen lag forhindrer udstationering af matrixen kollagen-gel fra HMCA.
7. invasion Assay erhvervelse og analyse
- Belastning HMCA plade på en motoriseret inverteret mikroskop fase udstyret med en inkubator, pre justeret til 37 ° C, 5% CO2 og fugtig atmosfære.
- Pre bestemme standpunkter for image erhvervelse i hver godt for at dække området hele array, og bruge 10 X eller 4 X mål (dette trin er påkrævet for image erhvervelse software, der anvendes her, se Materialer tabel nedenfor for detaljer). Alternativt, brug image erhvervelse software til at lette automatisk scanning af hele kræves område, ved at vælge den "Stich" valgmulighed.
- Erhverve lysfelt (BF) billeder hver 2-4 h for en samlet periode på 24-72 h for at følge invasionen af celler fra klumpformet kroppen ind i de omkringliggende ECM.
- Erhverve fluorescerende billeder til PI påvisning ved hjælp af en dedikeret fluorescerende cube (excitation filter 530-550 nm, dichroic spejl 565 nm lang pass og emission filter 600-660 nm).
- Eksportere time-lapse BF/fluorescerende billeder fra image erhvervelse software og gemme dem i formatet tagged image file format (TIFF) til en dedikeret mappe ved hjælp af fanen "Database" i værktøjslinjen og derefter "Eksporter optage filer" knappen.
Bemærk: Vi udviklede en in-house specialanalyse kode i MATLAB software, der omfatter en designet anskuelig brugergrænseflade (GUI) i hvilken invasion analyse kan udføres hurtigere og nemmere. I denne analyse kode gjort segmenteringen af spheroids og invasion området er semi-automatisk ved hjælp af Sobel givet filter efterfulgt af de morfologiske operatører Erosion og dilatation. Efter automatisk segmentering af områderne, blev manuelle korrektioner foretaget hvor der er behov for bedre nøjagtighed. Efter segmentering er afsluttet, et sæt af parametre blev automatisk beregnes af softwaren og eksporteres til en excel-fil til yderligere manipulation. Listen over parametre er: grundlæggende klumpformet tværsnitsareal samtidig = 0, invasion område af celler tilsluttet klumpformet krop = vigtigste invasion område af celler adskilt fra vigtigste invasion området, antal celler adskilt fra vigtigste invasion området, gennemsnitlige afstand af invasionen fra grundlæggende klumpformet center of mass til omkredsen af de vigtigste invasion området og adskilte celler og kollektive invasion afstand parameter = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) ud af den X og Y klumpformet center of mass koordinerer før (X1, Y1) og efter (X2, Y2) kollektiv invasion proces). Alternativt, billedanalyse kan gøres med enhver anden specialiseret software. - Åbne GUI og trykke på knappen "Load BF" . Når billedet er åbent, justere parametrene segmentering (mindstemål: > 1 og radius tæt: > 1) for at opnå en præcis segmentering af klumpformet og dens invasion område, tryk derefter på "Region af interesse (ROI) segmentering" knappen for udførelsen og en kant vises rundt hver klumpformet. Hvis den automatiske segmentering er forkert, skal du trykke på knappen "Slet" eller "Tilføj" og foretage de ønskede rettelser manuelt. Gentag de samme trin for efterfølgende billeder.
- Tryk på knappen "Tracking" at nummer spheroids og softwaren vil tildele det samme nummer for hver klumpformet i hver af time lapse billederne. Tryk derefter på knappen "Måling" , som vil generere et regneark med alle parametre. Gem dette regneark som en excel-fil til senere brug i resultater forarbejdning og statistikker i excel software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den unikke HMCA imaging plade bruges til invasion analysen af 3D tumor spheroids. Hele analysen, begynder med den sfæroide dannelse og slutter med invasion proces og yderligere manipulationer, der udføres inden for den samme plade. For klumpformet dannelse, HeLa celler er indlæst i array-bassinet og bosætte sig i hydrogel MCs af tyngdekraften. Hydrogel MCs, som har egenskaber, ikke-tilhænger/lav vedhæftet fil, lette celle-celle interaktion og dannelsen af 3D tumor spheroids. Figur 2A illustrerer de celler, der bosatte sig i MCs, efter brug af 150 x 103 celler/mL lastning løsning (dvs., ~ 16 celler pr. MC beregnet værdi). Det er klart, at belægning af celler pr. MC ikke er jævnt fordelt gennem array, og den gennemsnitlige opnåede statistiske fordeling er 14.78 ± 3.60 celler pr. MC. Tabellen i figur 2B opsummerer den celle fordeling pr. MC for hele HMCA pladen. Den gennemsnitlige variationskoefficient (CV) celle fordeling inden for en makro-godt er 43.33%, mens mellem makro-brønde er det 24.37%. Forskelle i celle belægning er afgørende og direkte diktere størrelsen af spheroids dannet og deres ensartethed i hele pladen. For at mindske/minimere variabiliteten lavet af antallet af celler pr. MC, udføres en analyse af resultaterne på ét element opløsning. Grunde i figur 2 c-D illustrere størrelse (tværsnitsareal) fordelingen af 3-dages spheroids. Det er klart eksemplificeret i figur 2D at beregne vækst forholdet mellem hver klumpformet (tværsnitsareal på dag 3/2) har en mere homogen fordeling end den absolutte størrelse distribution (figur 2 c), giver en CV 15.48% og 52.80%, henholdsvis. Klumpformet diameter distribution af 3-dages spheroids udbytter en CV på 24.52% og vækst ratio (diameter på day3/day2) er 7,45%. Disse CV værdier er svarende til17 eller højere end18 andre rapporter opnå celle indlæsning af tyngdekraften. For at eliminere den målte parameter afvigelse som følge af variabiliteten i den indledende seedede celle nummer pr. MC, er det at foretrække at normalisere de valgte parametre til den første celle nummer eller til andre målte parametre vedrørende det samme objekt, sådan at hver klumpformet har sine interne kontrol. Denne tilgang kunne anvendes let ved at spore objektet på HMCA imaging plade.
Processen med klumpformet dannelse og vækst kunne følges let på HMCA imaging plade. Figur 3A-B viser en BF billede af én region på HMCA imaging plade der indeholder 24 h HeLa celler aggregater og de respektive billede af moden, 5-dag 3D flercellede objekter, som er blevet mere sfæriske og tættere. Det er klart vist, at de fleste objekter beholder deres placering i perioden 5-dages inkubation. Analysen af figur (kugleform) og størrelse (tværsnitsareal) under klumpformet dannelsen er præsenteret i figur 3 c. Scatter plot viser stigninger i begge parametre fra dag 1 til dag 5; 0.544 ±0.020 a.u. 0.684± 0,016 a.u. for kugleform (p < 0,05) og 0.00356± 0.00013 mm2 til 0.00538 ± 0.00015 mm2 til tværsnitsareal (p < 0,05), henholdsvis. Mens 24-h aggregater er små og har ikke-regelmæssig form, de respektive 5-dages spheroids er større og erhverve sfærisk form.
Påvisning af klumpformet cellernes levedygtighed er udført ved hjælp af lav koncentration PI til farvning19 som omgår behovet for dye vask. PI trænger cellemembranen og derefter intercalates i DNA af ikke-levedygtige celler. Figur 4A viser 5-dages HeLa spheroids farves med PI (i rødt). Analyse af procentdelen af rødt område (der repræsenterer døde celler) ud af hver klumpformet tværsnitsareal er sammenfattet i figur 4B. Histogrammet viser, at 85% af klumpformet befolkning har en maksimal værdi på 5% rød farvet område og gennemsnittet er 3.01 ± 2.34% (venstre histogram). Tværsnitsareal af spheroids (højre histogram) viser en normalfordeling med gennemsnittet af 0.02447 ± 0.00487 mm2.
Efter at producere 3-dages modne HeLa spheroids, er invasion analysen udført inden for den HMCA imaging plade. Effekten af variabler, såsom ECM sammensætning, inhibitorer og aktivatorer, på 3D tumor klumpformet invasion proces kunne undersøges. Invasion assay ydeevne, er mediet forsigtigt fjernes og erstattes med ECM løsning pipette over spheroids i MC array bassin. Efter den fulde gellation af ECM-løsningen føjes komplet medium i makro-brønden. (1) for at undersøge HA indflydelse på HeLa klumpformet spontan invasion proces, spheroids var dækket med kollagen og HA blanding løsning (figur 5A) og i forhold til de omfattede med kollagen eneste løsning (figur 5 c), og BF billeder blev erhvervet ret efter ECM gellation (t = 0 h). Den kinetiske invasionen forløb blev efterfulgt af imaging de samme regioner hver 5 h for en periode af 63 Hansen. Efter 50 h inkubation, spheroids indlejret i kollagen og HA (figur 5B) viste lavere celle spredning til omkringliggende ECM i forhold til spheroids indlejret i kollagen kun (fig. 5 d). Analyse af området invasion kinetic over tid, for 99 spheroids på single-klumpformet opløsning er sammenfattet i figur 5E. Figur 5E observationsområder betyder/gennemsnit invasion område over tid for de to grupper, og viser tydeligt at tilføjelsen af HA til kollagen hæmmer celle spredningen af sfæroide, resulterer i mindre invasion områder. Gennemsnittet af skråninger som følge af lineær regression justeringen Kurver for hver af de spheroids indlejret i kollagen (0.001973 ± 0.000894 mm2h) i forhold til kollagen og HA løsning (0.001410 ± 0.000941 mm2h) er betydeligt forskellige (p = 0,003, t-test: to stikprøver med ens varians). (2) for at undersøge indflydelsen af Fisetin (en bioaktive flavonoid findes i flere frugter og grøntsager, som viser cytostatiske og migrastatic aktiviteter ved at handle på adskillige molekylære mål herunder phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / Akt/c-Jun N-terminal kinaser (JNK) signalering og Wnt/β-catenin signaling downregulates matrix metalloproteinases (MMPs) og andre20) på HeLa klumpformet spontan invasion proces, stigende koncentrationer af stoffet blev føjet til den fuldstændige medium og BF billeder blev erhvervet ved t = 0 (figur 6A) og 24 timer senere (fig. 6B-C). Som det fremgår, hæmmer 10 µM af Fisetin (figur 6 c) spredning af celler omkring spheroids i forhold til ubehandlede HeLa spheroids (fig. 6B). Invasion området analyse af en dosis svar eksperiment (figur 6D) udviser betydelig hæmning på 10-40 µM af Fisetin (p < 0,003), at nå mætning på koncentrationen af 10 µM og højere. (3) det har været vist, nej, på en nano-molar plan, bidrager til en mere aggressiv bryst kræft fænotype af stimulerende tumor ekspansion og migration16. For at undersøge indflydelsen fra NO på kollektive invasion processen af MCF7 spheroids indlejret i kollagen, 1 µM af diethylenetriamine/nitrogenoxid donorer (DETA/nej) blev føjet til komplet næringssubstratet og BF billeder blev erhvervet ved t = 0 og t = 20 h. Dramatic ændringer i morfologi og placeringen af 3D spheroids under eksponering til ingen donor er klart (figur 7A-B). Spheroids mister deres kugleform og bliver mere aflange erhverve amoeboid vandrende fænotype. Samtidig, blev forøget translokation af spheroids inden for de omkringliggende kollagen matrix observeret (figur 7C). Den gennemsnitlige brudforlængelse værdi steget betydeligt fra 1.305 ± 0.193 a.u. til 1.477 ± 0,298 a.u., (p < 0.0006). Den gennemsnitlige migration afstand målt for de samme spheroids blev betydeligt udvidet, 0.0788 ± 0.0575 mm og 0.3164 ± 0.3365 mm i fravær eller tilstedeværelse af DETA/nej, henholdsvis (p < 4 x 10-6).
Billedanalyse af den sfæroide invasion blev opnået ved halvautomatiske in-house MATLAB software. Erhvervede time lapse billeder af klumpformet dannelse og invasion i HMCA består af talrige spheroids i ét billede (4-6 spheroids på 10 X Forstørrelse og 25-30 spheroids på 4 X forstørrelse). Analyse af klumpformet dannelse, vækst og invasionen blev samtidig udført på alle spheroids i billedet. Nøgleparametrene udvindes for klumpformet invasion er præsenteret i figur 8A, som viser et repræsentativt billedsegmentering af 4 spheroids på et enkelt tidspunkt (t = 16 h). Vigtigste invasion afgrænsede af en rød kant, samt de adskilte celler, der frakobles og spredt omkring det (angivet med sorte pile), blev sporet og nummererede til hver klumpformet over tid. Klumpformet størrelse før invasionen i t = 0 er defineret af en blå kant. Betyder/gennemsnit invasion afstanden fra klumpformet center of mass invasion området omkreds herunder adskilte celler er beregnet ud fra de omringede røde segmentering og angivet med gule pile. Data udvundet fra denne time-lapse eksperiment er sammenfattet i fig. 8B-D. Figur 8B udstiller elevation af den gennemsnitlige invasion afstand fra hver klumpformet center over tid. Figur 8 c udstiller elevation af total invasion området i hver af spheroids over tid (herunder de vigtigste invasion område og adskilt, frakobles-celle område). Figur 8 d 1-4 viser omfanget af adskilt celle område i forhold til området total invasion af hver klumpformet (over tid). Det kumulative antal uengagerede celler er 33, 7, 4 og 5 for spheroids #1, #2, #3 og #4, henholdsvis. Analyse af kumulative tal af uengagerede celler over 20 h invasion fra 126 HeLa spheroids indlejret i kollagen er vist i figur 8E. Det fremgår her, at der er en bred distribution i antallet af uengagerede celler i den undersøgte population og den gennemsnitlige værdi er 12,3 ± 12,8 celler.
Figur 1: The HMCA imaging plade. (A) billede af en makro-godt præget med HMCA. (B) et tværsnit af en MC i HMCA imaging plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: homogenitet af celle distribution og klumpformet vækst forholdet i HMCA imaging plade. (A) en overlejring af BF og fluorescerende billeder af HMCA fyldt med HeLa celler pre farves med Hoechst 33342 1 µg/mL (lastning koncentration 150 x 103 celler pr. mL). Billeder blev erhvervet ret efter den celle bosættelse i MC. Image forstørrelse 4 X skalalinjen = 500 µm. (B) tabel en oversigt over fordelingen af HeLa celler inden for HMCA-6-godt imaging plade. Cellerne blev talt fra op til 90 MC/makro-godt. Resultaterne er præsenteret som betyder ± standardafvigelse (SD), CV (SD/mean100) beregnes inden for og mellem makro-brønde. (C) Distribution histogram af tværsnitsareal af 3 dages spheroids, n = 418, bestemt ud fra BF billeder. (D) Distribution histogram af klumpformet vækst ratio (tværsnitsareal på dag 3/2). Vækst ratio beregnes på ét element opløsning for hver af de 418 spheroids. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tracking klumpformet dannelse i HMCA imaging plade. BF billede af HeLa celler (lastning koncentration 120 x 103 celler pr. mL) inkuberes i HMCA for 1 dag (A) og 5 dage (B). Billede forstørrelse 4 X skalalinjen = 500 μm. (C) Scatter plot af 3D-objektet kugleform som en funktion af dens tværsnitsareal, efter 1 dag (blå diamanter) og 5 dage (brun firkanter) af inkubation post celle lastning. Hvert datamærke repræsenterer de analyserede data fra en enkelt sfæroide, n = 83. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: påvisning af cellernes levedygtighed i modne spheroids. En overlejring af BF og fluorescerende billeder af 5 dages spheroids (lastning koncentration 360 x 103 celler pr. mL) farves med PI 0,25 µg/mL (A). Billede forstørrelse 4 X skalalinjen = 500 µm. (B) Distribution histogram af procent af PI område i forhold til tværsnitsareal af klumpformet (venstre panel) og distribution histogram af tværsnitsareal (højre panel), n = 84. Procent af PI område er beregnet på ét element opløsning for hver af de 84 spheroids. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: indflydelse af ECM sammensætning på klumpformet invasion proces. BF billeder af 3 dages HeLa spheroids indlejret i en blanding af 3 mg/mL kollagen og 20 µg/mL HA (A) og 3 mg/mL kollagen (C), ved t = 0 h og efter 50 h inkubation (B) og (D), henholdsvis. Billede forstørrelse 10 X skalalinjen = 200 µm. HMCA imaging plade blev indlæst på scenen af inverteret mikroskop udstyret med inkubator. Billeder blev erhvervet hver 5 h og kinetisk analyse er præsenteret i plot (E), n = 99. Hver kurve repræsenterer den gennemsnit ± SD i invasion området stigning over tid, for kollagen og HA (blå diamanter) og kollagen kun (brun firkanter). Gennemsnitlige lineær regression kurve og dens ligning og R-kvadrerede værdi er anført ovenfor kurver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fisetin hæmmer spontan invasion af HeLa spheroids. BF billeder af 3 dages HeLa spheroids, indlejret i en blanding af 3 mg/mL kollagen (A) ved t = 0 og derefter 24 timer efter tilsætning af 0 µM (B) og 10 µM Fisetin (C) til komplet næringssubstratet. Billede forstørrelse 4 X skalalinjen = 500 µm. analyse af invasion området for hver klumpformet på slutpunktet (t = 24 h) præsenteres i plot (D), n = 488. Kurven repræsenterer gennemsnit ± SD i invasion området som en funktion af 0-40 µM Fisetin. Fisetin behandling betydeligt hæmmer invasion på 10 µM (P = 4,65 x 10-6), 20 µM (P = 0.0021) og 40 µM (P = 4,86 x 10-8), ved hjælp af t-test: to stikprøver med ens varians. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: NO inducerer kollektive invasion i MCF-7 bryst kræft spheroids. BF billeder af 2 dage MCF-7 bryst kræft spheroids, indlejret i kollagen (A) på (t = 0) og (B) efter 20 h eksponering for 1 µM DETA/nej Klumpformet ROI segmentering er defineret af rød kant, overlejret og nummereret i rødt på BF billeder A og B. ROIs defineret af blå kant, overlejret på BF billede B repræsenterer klumpformet størrelse og placering på t = 0. Forstørrelse 4 X, skalalinjen = 500 µm. (C) A scatter plot af sammenhængen mellem brudforlængelse faktor og migration afstand af individuelle bryst kræft spheroids ved udsættelse for 1 µM DETA/ingen (brun firkanter) som i forhold til kontrol (blå diamanter) til t = 20 h, n = 54. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: HeLa celler spontan invasion billedanalyse. BF billeder af 3 dages HeLa spheroids, 16 h efter indlejring i kollagen (A). Forstørrelse 10 X. Klumpformet invasion området og uengagerede celler defineres af rød kant, klumpformet størrelse på t = 0 er defineret af blå kant, gennemsnitlige invasion afstand fra klumpformet centrum af massen er angivet med gule pile og uengagerede celler er angivet med sorte pile. Plottet stigning over tid for den gennemsnitlige invasion afstand fra klumpformet center of mass (B) og total invasion området (C). Kurverne repræsenterer klumpformet #1 (blå diamanter), klumpformet #2 (brun firkanter), klumpformet #3 (grønne trekanter) og klumpformet #4 (lilla Xs). (D) Bar diagram af main (blå) og adskilt celle (brun) invasion området stigning over tid. (E) Distribution histogram af det kumulative antal adskilte celler pr. klumpformet under 20 h invasion proces, n = 126. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er veldokumenteret, at levende organismer, kendetegnet ved deres komplekse 3D flercellede organisation er helt adskilt fra almindeligt anvendte 2D éncellelag kulturperler celler, understreger det påtrængende behov for at bruge cellulære modeller, som bedre efterligner funktioner og processer i den levende organisme for stof screening. For nylig, flercellede spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer-on-a-chip har været indført8 til brug i standardiseret drug discovery. Dog truer den 3D flercellede model stor kompleksitet markant dens robusthed, parallelization og analyse af data, som er afgørende for assay effektivitet.
Kvantitative evaluering af invasion kapacitet måler typisk bevægelse af celler gennem hydrogel materialer. For at måle den tumor invasion ved hjælp af traditionelle mikro-godt plader, store tal af kræftceller er seedet i runde bundplade og tvunget til aggregat ved centrifugering21,22. Disse plader begrænse celle/klumpformet interaktion i tilstødende wells, mens den rund bund hindrer den optiske kvalitet og komplicerer billedet erhvervelse. I andre metoder, individuelle celler tilfældigt indkapslet i hydrogel, vokse og fungere i et 3D miljø men ikke nødvendigvis udvikler sig i modne spheroids23,24. Derudover er komplicerede procedurer for celle positionering indenfor hydrogel påkrævet, ligesom magnetisk kraft-baseret celle mønstre25 eller to-foton laser bestråling af bioaktive hydrogels26.
HMCA-baseret teknologi præsenteres heri viser sig for at være en fordel over de ovenfor nævnte metoder: celle positionering, spontane sammenlægning og oprettelsen af spheroids fra få spredte celler kan nemt opnås, at brugen af værdifulde begrænset cellulære prøven (fx., kræft stamceller-lignende celler eller primærelementer stammer fra patient prøver). Systemet har kontrol over både arten af de celler, der komponerer spheroids samt over deres nøjagtige geografiske position under lang sigt forsøg. Desuden den flade bund af MC letter generation af talrige spheroids på samme fokale planen, derfor hurtig belysning og image erhvervelse af store områder via et bredt felt mikroskop er muligt, hvilket eliminerer behovet for kompliceret tidskrævende Konfokal mikroskopi. Systemet er let at håndtere og dens praktisk gennemførlige. Ved at anvende simple procedurer, opnåede vi høj belægning af klumpformet populationer, hvor ca. 50% af spheroids har tilsvarende størrelse og en pålidelig analyse af kræft celle invasion kapacitet. Desuden, kan effekten af lægemidler på invasion kapacitet analyseres samtidig med deres cytostatiske og/eller cytotoksiske virkninger ved hjælp af high-indholdsanalyse tilgang samt HMCA enhed kulturperler med talrige spheroids. Desuden, i HMCA, alle cellulære elementer deler de samme plads og medium, hvilket gør det muligt at undersøge klumpformet-klumpformet interaktion, som sædvanligvis er medieret via celle-udskilles cytokiner, kemokiner, hormoner og ECM27. Denne cross-talk letter overlevelse og funktionen af individuelle celler/lille celle klynger i makro-og volumen.
Et afgørende skridt i gennemførelsen af protokollen er tilføjelsen af ECM blanding på toppen af spheroids og validere sine ordentlig polymerisering. Spheroids vil ikke vise vandrende adfærd, selv om de er indlejret i ECM, medmindre forsamling og danne tvaerbindinger forekomme, og passende kollagen fibre er dannet. Kollagen fibre kan observeres af BF belysning, og vi råder kontrol plade under et mikroskop for at bekræfte oprettelsen af kollagen fibre ved udgangen af denne fase. Da antallet af spheroids er afhængig af oprindelige celle koncentration og procent af besatte MCs, array bør kontrolleres efter første celle lastning, og hvis cellen belægning ikke er optimal, re såning af den samme array kan udføres. Faktisk var størrelse og geometri af HMCA beskrevet heri designet til at rumme relativt lille celle klynger (op til 150 µm i diameter). Dette kunne blive betragtet som en begrænsning da designe en ny type af matrix vil være nødvendige for at analysere celle migration fra større cellestrukturer.
Den aktuelle platform udnytter minimal celle nummer og små reagens volumen, samtidig med at de leverer en stor stikprøvestørrelse (tusindvis af spheroids pr. plade). For at analysere 12 forskellige forbindelser for anti-metastatisk aktivitet, ville 2 enkelt 6-godt HMCA baseret plader være påkrævet, giver resultaterne fra ca. 5.000 spheroids, mens mindst 50 96-brønd plader ville være nødvendige for at opnå de samme resultater. Evnen til at analysere migration på individ-objekt opløsning i HMCA giver en høj grad af statistiske robusthed og nøjagtighed, gør det muligt for studiet af strukturelle og funktionelle invasion heterogenitet i talrige spheroids.
Denne undersøgelse viser entydigt den kollektive invasion af bryst kræft klumpformet befolkninger ved udsættelse for DETA/nej. Celle klynger af MCF7 celler Vis amoeboid vandrende fænotype, og kvantitative ændringer i morfologi og placering af hver klumpformet kan nås automatisk. Til bedste af vores viden er dette den første klædt system, der letter overvågning og analyse af kollektive invasion i adskillige 3D konstruktioner. Ved at analysere de relative retninger og invasion distancen for hver sfæroide, er det muligt at studere den gensidige interaktion mellem spheroids i befolkningen. Derudover er etablerede indflydelse af ekstracellulære mikromiljø faktorer på kræft celle adfærd28 illustreret her. Blandt disse faktorer har vist stivhed og sammensætningen af mikromiljø at påvirke kraftigt celle migration. HMCA teknologi giver en defineret, biomimetiske, in vitro- platform, hvor disse egenskaber af ECM kan let tilgås og kontrolleres. Stivhed af ren kollagen type I-hydrogel på koncentrationen af 3 mg/mL, som blev brugt i denne undersøgelse, er rapporteret at være cirka 50-600 Pa29,30,31 og tilsætning af HA (20 µg/mL, 0,4 wt %) ikke ændre stivhed af hydrogel betydeligt32,33. Således, den undertrykkende effekt af medium molekylvægt (MMW)-HA på invasion af 3D HeLa spheroids, som blev demonstreret her er ikke på grund af stivhed ændringer. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, som viste en bimodal effekt af HA på kræft celle invasion med høj afhængighed HA molekylvægt34,35,36,37.
Fremtidige anvendelser af metoderne, der omfatter side om side multi celle type dyrkning af tumor og stromale celler i forskellige regioner inden for makro-godt og hentning af specifikke spheroids for downstream Molekylær analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af arv af Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
