Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58359
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Bar-Ilan University

Summary

צלחת הדמיה המבוססת על HMCA מוצג לביצועים assay הפלישה. הצלחת הזו מקלה על היווצרות הגידול תלת מימדי (3D) spheroids והמידה של סרטן תאים פלישת מטריצות (ECM). כימות assay הפלישה מושגת על ידי ניתוח חצי-אוטומטי.

Abstract

גרורות סרטן ידוע כגורם 90% של סרטן קטלני. גרורות הוא תהליך רב מדרגתיות אשר יוזם עם הפלישה/החדירה של תאים סרטניים לתוך רקמות שכנות. לפיכך, הפלישה היא שלב קריטי גרורות, שהופך את הפלישה תהליך מחקר ופיתוח של תרופות אנטי גרורתי, משמעותית ביותר. כדי לטפל דרישה זו, יש צורך לפתח מודלים 3D במבחנה אשר לחקות את הארכיטקטורה של גידולים מוצקים, microenvironment שלהם בצורה הקרובה ביותר למצב ויוו מצד אחד, אך בו זמנית להיות מתאים, חזקים הדירים תשואה גבוהה ומדידות תוכן גבוהה. כיום, רוב מבחני הפלישה להישען על טכנולוגיות מתוחכמות microfluidic אשר מתאימות למחקר, אבל לא בשביל נפח גבוה והתרופות הקרנה. מבחני אחרים באמצעות מכשירים מבוססי צלחת עם spheroids בודדים מבודדת היטב כל חומר רב, יש גודל המדגם נמוך לכל תנאי. המטרה של הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק מבוססת תא 3D ביונים פשוט וניתן לשחזור מערכת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. פיתחנו דגם תלת-ממד עבור assay הפלישה בהתבסס על צלחת הדמיה HMCA למחקר של הגידול הפלישה, גילוי תרופות אנטי גרורתי. התקן זה מאפשר הייצור של רבים spheroids אחיד לכל טוב (גודל המדגם גבוהה לכל תנאי) מוקף רכיבים ECM, תוך התבוננות ללא הרף, בו זמנית מדידה של spheroids ברזולוציה רכיב בודד בינוני הקרנת תפוקה של תרופות אנטי גרורתי. פלטפורמה זו מוצגת כאן על-ידי הייצור של הלה, MCF7 spheroids עבור המשמשים תא בודד ופלישה קולקטיבית. אנו משווים את השפעת חומצה היאלורונית רכיב ה-ECM (HA) על היכולת פולשנית של קולגן סביב הלה spheroids. בסופו של דבר, אנחנו מציגים Fisetin (מעכב הפלישה) הלה spheroids, תחמוצת החנקן (אין) (activator הפלישה) כדי MCF7 spheroids. התוצאות מנותחות על-ידי תוכנה פנימית המאפשרת ניתוח חצי אוטומטי, פשוטה ומהירה המאפשרת בדיקה multi-parameter.

Introduction

מקרי המוות מסרטן מיוחס בעיקר להפצת גרורתי לתאים מקומות מרוחקים. מאמצים רבים בטיפול בסרטן להתמקד מיקוד או מניעת היווצרות של מושבות גרורתי והתקדמות של מחלה גרורתית מערכתית1. נדידת תאים סרטן היא שלב חיוני בתהליך גרורות הגידול, לפיכך, המחקר של המפל הפלישה סרטן הוא מאוד חשוב ומפשעה תנאי הכרחי למציאת הרפוי אנטי גרורתי.

השימוש במודלים כלי לימוד במחלה גרורתית נמצאה להיות מאוד יקר, לא תמיד נציג של הגידול ב בני אדם. יתר על כן, הטופולוגיה microenvironment חוץ-תאית, מכניקה והרכב להשפיע על סרטן התא התנהגות2. מאז ויוו מודלים מטבעו חוסר היכולת להפריד בין ולשלוט פרמטרים ספציפיים כגון, אשר תורמים הפלישה סרטן, גרורות, יש צורך ביונים לשליטה במבחנה מודלים.

על מנת גרורות לאיברים מרוחקים, תאים סרטניים חייב להפגין תכונות פנוטיפי נודדות ופולשני אשר ניתן לפלח לטיפול. עם זאת, מאז רוב במבחנה הדגמים סרטן מחקה את התכונות בפועל של גידולים מוצקים3, זה מאתגר מאוד לזהות פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, הטרוגניות פנוטיפי שקיים בתוך הגידול, מכתיב את הצורך בניתוח הגידול ההעברה ברזולוציה רכיב אחד כדי לגלות מכוון פנוטיפ טיפולים, למשל, על ידי מיקוד התא. מתחילה גרורות אוכלוסייה בתוך גידולים הטרוגנית4.

המחקר של תנועתיות תאי והעברה קולקטיבית מתנהל בעיקר בתרבויות טפט של תאים אפיתל על משטחים מישוריים הומוגנית. אלה דגמי הסלולר המקובלת על נדידת תאים סרטן מבוססים על ניתוח האוכלוסייה של תאים בודדים פולשים דרך ממברנות ECM רכיבים5, אבל במערכות כאלה, לא יכול להיות הבדלים מהותיים בין תאים בודדים למד. ביצירת spheroids תלת-ממד באמצעות פיגומים או מיקרו-מבנים לגרדום ללא נחשב ממונה פירושו ללמוד את הגידול התא סרטן וצמיחה של הפלישה6,7,8. עם זאת, ביותר תלת-ממד מערכות אינם מתאימים לתבניות תפוקה גבוהה, בדרך כלל אינה יכולה להיות מושגת האינטראקציה הבין-ספרואיד מאז spheroids בודדים מבודדת נוצרים כל מיקרו-ובכן9. מחקרים שנעשו לאחרונה המערבים את ההעברה סרטן מבוססים על microfluidic התקנים3,10,11,12, אולם, אלה מתוחכמים microfluidic כלים קשה לייצר, לא ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) של תרופות אנטי-פולשנית.

שני ראשי פנוטיפים, נדידת תאים קיבוציים ואישיים, אשר ממלאים תפקיד תאים סרטניים להתגבר על המכשול ECM פולשים רקמות שכנות, כבר הפגינו13,14, כל הצגת ברורים מורפולוגי המאפיינים, מנגנונים ביוכימיים, המולקולריים והגנטיים. בנוסף, שתי צורות של העברת תאים סרטניים, כמו פיברובלסט ו- amoeboid, הם נצפו כל פנוטיפ. מאז, הפלישה פנוטיפים and מצבי העברה, בעיקר המוגדרים על-ידי מאפיינים מורפולוגיים, יש צורך הסלולר מודלים זיהוי מבוסס-הדמיה זה לזמין, בחינת כל צורות גידול הפלישה ושל העברת תאים.

המטרה הכוללת של השיטה הנוכחית היא לספק ביונים לשחזור ופשוט 3D במבחנה תא מערכת מבוססת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. כאן, אנחנו מציגים מבוסס-HMCA 6-ובכן הדמיה הצלחת עבור המחקר של הפלישה גידול וטיפול אנטי גרורתי. הטכנולוגיה מאפשרת היווצרות של מספרים גדולים של הגידול תלת-ממד אחיד spheroids (450 לכל טוב) בתוך מבנה תאי-מיקרו (MC) הידרוג. רכיבי ה-ECM שונים נוספים למערך ספרואיד כדי לאפשר את הפלישה של התאים לתוך הסביבה. הפלישה תהליך ללא הרף מנוטרת על ידי קצר - ארוכת התבוננות לאותם תאים בודדים spheroids/פולש ואסטמה ומקילה על אפיון מורפולוגי, צביעת פלורסנט ולאחזור של spheroids ספציפי בשלב כלשהו. מאז spheroids רבים חולקים חלל בינוני, אינטראקציה באמצעות מולקולות מסיסים בין הבודדים spheroids והשפעתם על אחד לשני אפשרי. ניתוח תמונות חצי אוטומטי מתבצע על ידי שימוש בקוד MATLAB שבאתר המאפשרת אוסף יעילה ומהירה של כמות גדולה של נתונים. פלטפורמת מקל מדידה מדויקים, בו זמנית של תאים spheroids/פולש רבים בצורה היעילה, המאפשר הקרנה תפוקה בינונית של תרופות נגד הפלישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HMCA לוחית הבלטה

הערה: התהליך המלא על העיצוב ועל פבריקציה נוספת של polydimethylsiloxane (PDMS) חותמת וצלחת הדמיה HMCA בשימוש פרוטוקול זה מתואר בפירוט שלנו15,הקודם מאמרים16. חותמת PDMS (הצורה השלילית) משמש הבלטה של HMCA (צורה חיובית) אשר מורכב של MCs בערך 450 לכל טוב (איור 1 א'). כפי שמתואר ב איור 1B, כל אחד MCs יש צורה של פירמידה קטומה בצורת ריבוע הפוך (גובה: 190 מיקרומטר, באזור בסיס קטן: 90 מיקרומטר x 90 מיקרומטר, שטח הבסיס גדול: 370 מיקרומטר x 370 מיקרומטר). הצלחת HMCA משמשת עבור הכנת ו culturing של הגידול 3D spheroids לאחר מכן, הפלישה וזמינותו. לחלופין, חותמת מסחרי יכול לשמש לייצור HMCA.

  1. להכין פתרון של 6% agarose ההיתוך נמוכה (LMA). להוסיף את אבקת LMA, תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS) (0.6 גרם של LMA לכל 10 מ"ל של PBS) לתוך בקבוק זכוכית עם פגים. הניחו את הבקבוק על צלחת חימום ומערבבים את הפתרון תוך כדי חימום עד 80 ° C לכמה שעות עד פתרון אחיד מושגת. לשמור את הפתרון ב 70 ° C עד השימוש.
  2. מחממים מראש את חותמת PDMS עד 70 ° צלזיוס בתנור. לחמם אותו עד השימוש. לחלופין, השתמש חותמת מסחרי ופעל לפי ההוראה.
  3. במקום את צלחות זכוכית 6-ובכן מסחרי-התחתון על אמבט יבש מחומם מראש ל 75 מעלות צלזיוס. המתן מספר דקות עד הצלחת חם לגמרי.
  4. יוצקים טיפה (400 µL) של LMA מחומם מראש על גבי רצפת הזכוכית של כל אחד מן הבארות בצלחת. הנח בעדינות את חותמת PDMS מחומם מראש על הירידה agarose. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 – 10 דקות וקירור מראש ג'לי מראש. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להשיג agarose מלא gelation. ואז, בעדינות לקלף את PDMS, עוזב את הג'ל agarose האיאט MCs.
    הערה: שלב זה מתבצע בו זמנית ב כל הבארות.
  5. מקם את הצלחת מובלטת באור לריפוי למערך עם מנורת אולטרה סגול (UV), ולאחר תקופת דגירה של 3 דקות.
    הערה: עכשיו הצלחת HMCA הוא עיקור UV.
  6. למלא את המאקרו-הבארות PBS סטרילי כדי להבטיח כי הם נשמרים לחים, ואז לכסות את הצלחת, לעטוף את זה עם מצלמות-מיקרוסקופים ואחסן אותו ב 4 ° C עד השימוש.
  7. לפני השימוש, רוקן PBS תמלוגים מהצלחת HMCA. למקם אותו בשכונה ביולוגי.

2. טעינת תאים ויצירת ספרואיד

  1. לאסוף את התאים כדלקמן: הסר בינוני כל טפט תא צלחת 10 ס מ תרבות, לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS להיפטר סרום תמלוגים, הוסף 5 מ של טריפסין (טרום התחמם עד 37 ° C), תקופת דגירה של 3 דקות בחממה ב 37 º C. לאחר מכן, לנער את הצלחת בעדינות כדי להבטיח ניתוק חד שכבתי, להוסיף 10 מ של שלם בינוני (טרום התחמם עד 37 ° C), פיפטה למעלה ולמטה עד תא הומוגנית ההשעיה מושגת. צנטריפוגה לשטוף התליה תא עם 15 מ"ל בינוני טריים ואז, להשעות בריכוזים המתאימים בינוני מלא טריים.
  2. בעדינות לטעון התליה תא (µL 50, 150 – 360 x 103 תאים למ"ל בינוני, ~ 16-40 תאים לכל MC) על גבי HMCA ולאפשר את התאים להתיישב על ידי הכבידה למשך 15 דקות.
  3. בעדינות להוסיף 6-8 aliquots µL 500 טרי בינוני (סה כ 3-4 מ"ל) בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק בחוץ הטבעת של הידרוג המערך.
  4. דגירה הלה תאים עבור 72 h ותאים MCF7 עבור h 48-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, באווירה humidified של הקמת spheroids.

3. הכדאיות זיהוי על-ידי Propidium יודיד (PI) מכתים

  1. להכין פתרון מניות של PI (500 µg של פאי לכל 1 מ"ל של PBS). לשמור את זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ- 6 חודשים. טרי להכין לדילול 1:2,000 (0.25 µg/mL), על ידי התוספת של 6 µL של מניות 12 מ של מדיום מלאה ללא פנול אדום, הצלחת HMCA 6-טוב (2 מ"ל לכל טוב).
  2. להעביר לצלחת HMCA עם 48-72 h spheroids, החממה מכסה המנוע ביולוגי. להסיר כל בינוני HMCA על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק לצד המערך הידרוג, עוזב את הטנק מערך מלא בינוני.
  3. בעדינות להוסיף מ 2 ל- PI דילול מ 3.1 שלב בכל טוב, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון פלסטיק מאקרו-. טוב. דגירה את הצלחת HMCA עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, באווירה humidified. המשך לשלב 7.
    הערה: צבעים אחרים יכול לשמש כאן גם, לדוגמה, Hoechst עבור גרעין מכתים, tetramethylrhodamine מתיל אסטר (TMRM) עבור פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי מכתים, fluorescein diacetate (FDA) לגילוי תאים חיים, Annexin V עבור אפופטוזיס זיהוי ואחרים.

4. הכנת התערובת קולגן

  1. הכן סטרילי כפול מים מזוקקים (DDW) על ידי החיטוי, מלאי של 100 מ של 1 מ' NaOH מחוטא-מסנן פתרון. לשמור על החומרים RT, ועל העצות המשמש עבור הכנת התערובת קולגן קפוא ב-20 ° C, עד לשימוש.
  2. 10 – 20 דקות לפני השימוש, במקום כל intergrades כולל: DDW סטרילי, M NaOH 1 פתרון סטרילי, סטרילי 10 x PBS, מסוג קולגן זנב החולדה (מאוחסן ב 4 ° C 3-חודשים), צינור סטרילי לתוך הדלי קרח עד לגמרי מקורר. המקום דלי קרח בתוך המנוע ביולוגי.
  3. להכין µL 1,800 תערובת קולגן-ריכוז הסופי של 3 מ"ג/מ"ל, 6-ובכן HMCA הפלישה assay צלחת (300 µL לכל טוב) כפי שמוצג להלן. הוסף את intergrades לתוך הצינור מקורר לפי הסדר הבא: 515 µL של DDW, µL 24.8 של 1 M NaOH ו- 180 µL של 10 x PBS. לערבב היטב על ידי מערבולת ומקום חזרה לתוך הקרח. לבסוף להוסיף התערובת, מערבולת שוב 1080 µL של קולגן, להחזיר לתוך הקרח.

5. הא, הכנת התערובת קולגן

  1. להמיס 10 מ ג של HA ב 2 מיליליטר DDW סטרילי. דגירה התערובת ב RT במשך כמה דקות, מערבולת בעדינות עד התפרקה לחלוטין האבקה. אחסן את הפתרון מניות ב 4 ° C עד שנתיים.
  2. ממש לפני השימוש, מקום הפתרון מניות HA בדלי הקרח בתוך המנוע ביולוגי.
  3. להכין 3 מ"ג למ"ל תערובת קולגן כפי שמתואר בשלב 4. להוסיף 36 µg (7.2 µL) של HA לתוך μL 1,800 של תערובת מוכנה לשימוש קולגן, עבור ריכוז סופי של 20 µg/mL. ואז, מערבולת שוב בקצרה ולשים בחזרה לתוך הקרח.

6. תוספת ECM תערובת

  1. להעביר את הצלחת HMCA, עם 48-72 h spheroids, החממה וחטף ביולוגי ומניחים אותו על הקרח. תקופת דגירה של 10 דקות עד הצלחת הוא מקורר. מראש בחום פתרון של 1% LMA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
  2. הסר בינוני כל מ מסביב HMCA, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון מאקרו-ובכן פלסטיק לצד המערך הידרוג. . אז, בזהירות רבה, הסר בינוני כל למיכל מערך עם בסדר עצה/ג'ל טעינת עצה, על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה המערך, ובאיטיות יניקה בינוני כל החוצה.
    הערה: לאחר הסרת כל האמצעי סביב המערך הידרוג, הטנק מערך עדיין מלא בינוני. בינוני יש להסיר בעדינות על מנת למנוע הרס הידרוג MC, שיבוש spheroids.
  3. לקחת 150 µL של קולגן התערובת או תערובת HA קולגן (תערובת ECM) עם קצה בסדר מראש קפואים ולהוסיף לתוך הטנק המערך על-ידי הצמדת הקצה לקצה המערך. שחרר את התערובת לאט כדי להימנע ספרואיד פריקה. חזור על צעד זה עם aliquot אחרת של 150 µL, µL 300 סה כ כל טוב. בצע את ההליך עבור כל טוב עד כל בארות מלאים. ואז למקם את הצלחת לתוך החממה עבור 1h לציון gelation המלא של ה-ECM.
  4. פיפטה לאחר gelation המלא של ה-ECM השיגה, µL 400% 1 מראש ומחוממת LMA על גבי הג'ל ECM. כיסוי לצלחת עם המכסה, דגירה לצלחת-RT למשך 5-7 דקות ולאחר מכן למשך 2 דקות ב 4 ° C, עבור agarose gelation. לבסוף, בעדינות להוסיף 2 מיליליטר בינוני מלא על-ידי הישענות הסוף עצה בקצה התחתון פלסטיק מאקרו-. טוב.
    הערה: השכבה agarose מונע בניתוק של המטריקס קולגן-ג'ל מ HMCA.

7. הפלישה Assay רכישה וניתוח

  1. טען הצלחת HMCA אל ממונע הפוך הבמה מיקרוסקופ מצויד אינקובטור, להתאים מראש ל- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 והאווירה humidified.
  2. לקבוע מראש העמדות עבור רכישת התמונה בכל טוב כדי לכסות את האזור מערך שלם, ולהשתמש 10 X או מטרות X 4 (השלב זה נדרש עבור התוכנה רכישת התמונה המשמש כאן, חומרים בטבלה להלן לקבלת פרטים). לחלופין, להשתמש בכל תוכנה רכישת התמונה כדי להקל על סריקה אוטומטית של כל האזור הנדרש, על-ידי בחירה "Stich" אפשרות.
  3. לרכוש תמונות שדה בהיר (BF) כל h 2 – 4 לתקופה כוללת של 24-72 h לעקוב הפלישה של תאים מהגוף ספרואיד לתוך ה-ECM שמסביב.
  4. לרכוש תמונות פלורסנט לגילוי PI באמצעות קוביה פלורסנט ייעודי (עירור מסנן 530 – 550 ננומטר, מראה ודיקרואיק זוהר 565 nm ארוך פליטה ותעודת מסנן 600 – 660 ננומטר).
  5. ייצוא תמונות בצילום מואץ BF/פלורסנט מתוך התוכנה רכישת התמונה ולשמור אותם בתבנית קובץ (TIFF) של תמונות מתויגות לתיקיה ייעודית באמצעות הכרטיסייה "מסד נתונים" הכלים, ולאחר מכן על הלחצן "ייצוא רשום קבצים" .
    הערה: פיתחנו קוד מיוחד ניתוח ללא צורך במיקור חוץ בתוכנת MATLAB הכוללת ממשק משתמש גרפי מעוצב (GUI) באילו הפלישה ניתוח יכול להתבצע ביתר מהירות וקלות. קוד זה ניתוח, פילוח של spheroids, באזור הפלישה נעשית באופן אוטומטי למחצה באמצעות מסנן סובול ואחריו באופרטורים מורפולוגיים שחיקה, התארכות. לאחר פילוח אוטומטי של האזורים, נעשו תיקונים ידניים במידת הצורך על דיוק טוב יותר. לאחר השלמת פילוח, סט של פרמטרים היו באופן אוטומטי המחושב על-ידי התוכנה, מיוצאים לקובץ excel עבור מניפולציה נוספת. רשימת הפרמטרים הם: אזור סקציות ספרואיד בסיסיים בזמן = 0, הפלישה אזור של תאים מחוברת לגוף ספרואיד = הפלישה הראשי לאזור, אזור של תאים מופרדים מאזור הפלישה הראשי, מספר התאים מופרדים מאזור הפלישה הראשי, המרחק הממוצע של הפלישה מן ספרואיד בסיסי אל מרכז המסה על ההיקף של הפלישה הראשי באזור, תאים מופרדים הפלישה קולקטיבית מרחק פרמטר = d (d = כהן ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) מתוך קואורדינטות X ו- Y ספרואיד מרכז מסה, לפני (X1, Y1) ואחרי (X2, Y2) תהליך הפלישה קולקטיבית). לחלופין, ניתוח תמונות יכולה להתבצע עם תוכנות מיוחדות אחרות.
  6. פתח GUI, לחצו על הכפתור "טען BF" . לאחר שהתמונה פתוח, להתאים את הפרמטרים פילוח (גודל מינימלי: > 1 וסגור רדיוס: > 1) כדי להשיג של פילוח מדויק של ספרואיד ואזור הפלישה שלה, ולאחר מכן, לחץ לחצן "אזור של הריבית (ROI) פילוח" לביצוע, גבול יופיעו סביב כל ספרואיד. אם פילוח אוטומטית שגוי, לחצו על כפתור "מחק" או "להוסיף" ולעשות את התיקונים המבוקשים באופן ידני. חזור על הפעולות עבור תמונות עוקבות.
  7. לחץ על לחצן "מעקב" כדי למספר את spheroids ותקצה התוכנה מספר זהה עבור כל ספרואיד בכל אחת מהתמונות זמן לשגות. לאחר מכן, לחץ על לחצן "מדידה" , אשר תיצור גיליון אלקטרוני עם כל הפרמטרים. שמור גיליון אלקטרוני זה כקובץ excel עבור שימוש נוסף עיבוד תוצאות וסטטיסטיקות בתוכנת excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HMCA ייחודי הדמיה לצלחת משמש וזמינותו הפלישה של הגידול 3D spheroids. וזמינותו כולו, החל עם הקמתה ספרואיד וכלה עם הפלישה תהליך, מניפולציות נוספות, מבוצע בתוך באותה הצלחת. על היווצרות ספרואיד, הלה תאים מוטענים לתוך האגן מערך ולהתיישב בארץ את הידרוג MCs על ידי הכבידה. הידרוג MCs, אשר יש מאפייני קובץ מצורף ללא-חסיד/נמוך, להקל על האינטראקציה תא התא ואת היווצרות הגידול 3D spheroids. איור 2A ממחיש את התאים התיישבו MCs, בעקבות השימוש 150 x 103 תאים למ"ל טעינת פתרון (כלומר., ערך מחושב ~ 16 תאים לכל MC). ברור כי והתפוסה של תאים לכל MC לא מופץ באופן שווה באמצעות המערך, התפלגות ממוצע סטטיסטי שהושג הוא 14.78 ± 3.60 תאים לכל MC. הטבלה באיור 2B מסכמת את התפלגות התא לכל MC HMCA צלחת מלאה. המקדם הממוצע של וריאציה (CV) של התפלגות התא בתוך מאקרו-באר נמצא 43.33%, בעוד בין הבארות המאקרו הוא 24.37%. הבדלי תא תפוסת מכריעים ולהכתיב ישירות בגודל של spheroids נוצר שלהם הומוגניות ברחבי הבסיס. על מנת להפחית/לצמצם ההשתנות שנוצרו על-ידי מספר התאים לכל MC, הניתוח של התוצאות מתבצע ברזולוציה רכיב בודד. החלקות איור 2C-D ממחישים את ההפצה (אזור ומדפים) גודל של 3 ימים spheroids. זה הוא בבירור שהודגם ב איור דו-ממדי כי חישוב היחס הצמיחה של כל ספרואיד (חתך אזור ביום ביום 3/2) יש התפלגות הומוגנית יותר התפלגות גודל מוחלט (איור 2C), קורות חיים של 15.48% ל- 52.80%, תנובה בהתאמה. ספרואיד הפצה בקוטר של 3 ימים spheroids מניב קורות חיים של 24.52%, היחס צמיחה (קוטר-day3/day2) 7.45%. ערכים אלה קורות חיים הם הדומה17 או גבוה יותר18 אחרים מדווח תא להגיע טעינה על-ידי כוח הכבידה. כדי לסלק את השונות פרמטר נמדד הנובע ההשתנות במספר תא הזריעה הראשונית לכל MC, עדיף לנרמל את הפרמטרים שנבחרו מספר התא הראשוני או כל פרמטר נמדד אחרת של אותו אובייקט, כזה כי כל ספרואיד יש בקרה פנימית שלה. גישה זו יכול להיות מיושם בקלות על-ידי מעקב אחר האובייקט בצלחת הדמיה HMCA.

התהליך של ספרואיד ההיווצרות והגידול יכול להיות אחריו בקלות על HMCA הדמיה צלחת. איור 3 א-ב מציג תמונת BF של אזור אחד על HMCA הדמיה צלחת המכיל 24 שעות הלה תא אגרגטים, התמונה בהתאמה של בוגר, 5–יום עצמים תלת-ממדיים multicellular, אשר הופכים להיות יותר כדורית, צפופה. זה מוצג בבירור כי רוב האובייקטים שומרים על מיקומם במהלך תקופת הדגירה 5 ימים. הניתוח של צורה (sphericity) וגודל (אזור המודולרית) במהלך היווצרות ספרואיד מוצג באיור 3C. העלילה פיזור מדגים את העלאות שני הפרמטרים מיום 1 ליום 5; א"א ±0.020 0.544 0.684± א"א 0.016 עבור sphericity (p < 0.05), 0.00356± 0.00013 מ מ2 ל 0.00538 מ מ 0.00015 ±2 לאזור סקציוניות (p < 0.05), בהתאמה. בעוד 24 שעות ביממה אגרגטים קטנים ויש צורה בלתי-רגיל, spheroids 5 ימים בהתאמה גדולים יותר ולרכוש צורה כדורית.

הגילוי של הכדאיות תא ספרואיד מבוצע באמצעות ריכוז PI עבור צביעת19 אשר עוקף את הצורך צבע הכביסה. PI חודר קרום התא, ואז intercalates לתוך ה-DNA של תאים כלכלית. איור 4A מציג 5 ימים הלה spheroids צבעונית עם PI (באדום). ניתוח של האחוז של אזור אדום (ייצוג תאים מתים) מתוך כל אזור סקציות ספרואיד מסוכם ב- 4B איור. ההיסטוגרמה מציגה כי 85% מאוכלוסיית ספרואיד כולל אזור ערך מקסימלי של 5% אדום צבעונית, הממוצע ויש 3.01 ± 2.34% (היסטוגרמה השמאלי). שטח חתך של spheroids (היסטוגרמה נכון) מציג את התפלגות נורמלית עם ממוצע של 0.02447 ± 0.00487 מ מ2.

לאחר הפקת spheroids הלה בוגר 3 ימים, וזמינותו הפלישה מתבצעת בתוך HMCA הדמיה צלחת. ההשפעה של משתנים, כגון ECM קומפוזיציה, מעכבי, מפעילים, על תהליך הגידול 3D ספרואיד הפלישה יכול להבדק. לביצועים assay הפלישה, המדיום הוא בעדינות הוסר והוחלף פיפטה פתרון ה-ECM מעל spheroids לתוך האגן מערך MC. לאחר gelation מלאה של פתרון ה-ECM, בינוני שלם נוסף לתוך הבאר המאקרו. (1) על מנת לבחון את השפעת HA על תהליך ספונטני הפלישה ספרואיד הלה, spheroids היו מכוסים קולגן והפתרון תערובת HA (איור 5A), בהשוואה לאלו מכוסה שהפתרון היחיד קולגן (איור 5C), ו תמונות BF נרכשו מיד אחרי ECM gelation (t = 0 h). קינטי של תהליך הפלישה בעקבות הדמיה את האזורים זהה כל 5 שעות במשך תקופה של 63 h. לאחר זובידאת של דגירה, spheroids נעוץ קולגן, HA (איור 5B) הראה פיזור נמוך תא לתוך ECM שמסביב לעומת spheroids נעוץ קולגן בלבד (איור 5D). הניתוח של האזור הפלישה קינטי לאורך זמן, עבור spheroids 99 ברזולוציה יחיד-ספרואיד מסוכם ב איור 5E. איור 5E מגרשים באזור הפלישה אומר/הממוצע לאורך זמן של שתי הקבוצות ומדגים בבהירות כי התוספת של HA קולגן מעכב את פיזור התא החוצה ספרואיד, וכתוצאה מכך אזורים קטנים הפלישה. הממוצע של המדרונות הנובע רגרסיה ליניארית התאמת עקומות עבור כל אחד spheroids נעוץ קולגן (0.001973 ± 0.000894 מ מ2/h) לעומת הקולגן והפתרון HA (0.001410 ± 0.000941 מ מ2/h) הן באופן משמעותי שונות (p = 0.003, מבחן t: שני מדגמים בהנחה שונויות שוות). (2) כדי לבחון את השפעת Fisetin (פלבנואיד ביואקטיביות נמצאו מספר פירות וירקות המציגה פעילויות cytostatic ו- migrastatic על ידי משחק על מספר מטרות מולקולריות כולל phosphatidylinositol 3-קינאז (PI3K) / Akt/c-יוני N-terminal kinases (JNK) איתות, ונ ט/β-catenin איתות downregulates מטריקס metalloproteinases (MMPs) ואחרים20) על הלה ספרואיד תהליך ספונטני הפלישה, הגדלת ריכוזים של הסם נוספו המדיום מלאה ו תמונות BF נרכשו ב- t = 0 (איור 6A) ו- 24 שעות מאוחר יותר (איור 6B-C). כפי שמתואר, 10 מיקרומטר של Fisetin (איור 6C) מעכב את הפיזור של תאים סביב spheroids לעומת spheroids שאינם מטופלים הלה (איור 6B). הניתוח באזור הפלישה של ניסוי תגובת המינון (איור 6D) המוצגים משמעותי עיכוב ב- 10-40 מיקרומטר של Fisetin (p < 0.003), השגת רוויה-הריכוז של מיקרומטר 10 ומעלה. (3) הוכח, ברמה ננו-טוחנת, תורם הפנוטיפ אגרסיבי יותר של סרטן השד על ידי גירוי הגידול הרחבה והעברה16. כדי לבחון את השפעת לא על תהליך הפלישה קולקטיבית של spheroids MCF7 נעוץ קולגן, 1 מיקרומטר של תחמוצת חנקתית/diethylenetriamine התורם (DETA/לא) נוספה בינוני תרבות שלמה ו BF תמונות נרכשו ב- t = 0 ו- t = 20 ה' דרמטית שינויים המורפולוגיה והמיקומים של תלת-ממד spheroids במהלך חשיפה לא תורם ניכרות (איור 7 א-ב). Spheroids לאבד את sphericity שלהם, להיות יותר מאורך רכישת פנוטיפ נודדות amoeboid. / ת, רוברטסונית משופרת של spheroids בתוך המטריצה קולגן שמסביב נצפתה (איור 7C). הערך הממוצע התארכות גדל באופן משמעותי מ- 1.305 ± 0.193 א"א כדי 1.477 ± 0.298 א"א, (p < 0.0006). המרחק הממוצע ההעברה נמדד את spheroids אותו באופן משמעותי הוארך, 0.0788 ± 0.0575 מ"מ ו 0.3164 ± 0.3365 מ"מ בהיעדרו, הנוכחות של DETA/לא, בהתאמה (p < 4 x 10-6).

ניתוח תמונות של הפלישה ספרואיד הושג על-ידי תוכנת MATLAB ללא צורך במיקור חוץ חצי-אוטומטי. רכשה זמן לשגות תמונות של היווצרות ספרואיד ופלישה בתוך HMCA מורכב spheroids רבים בתמונה אחת (spheroids 4-6-10 X הגדלה ו- 25-30 spheroids בהגדלה X 4). הניתוח של היווצרות ספרואיד, צמיחה, הפלישה בוצעה/ת על כל spheroids בתמונה. הפרמטרים מפתח שחולצו לפלישה ספרואיד מוצגים באיור 8A, אשר מראה של סגמנטציה נציג של 4 spheroids בנקודת זמן אחת (t = 16 h). האזור הפלישה הראשי המוגדר על-ידי גבול אדום, כמו גם את התאים מופרדים אשר מנותק, התפזרו מסביב (המסומנים על ידי חצים שחורים), היו מסומנים, ממוספרות כל ספרואיד לאורך זמן. ספרואיד גודל לפני הפלישה ב t = 0 מוגדרת על-ידי גבול כחול. המרחק אומר/ממוצע הפלישה ספרואיד מרכז מסה על היקף שטח הפלישה כולל תאים מופרדים שמחושבים את פילוח אדום שהינכם מטיילים, המסומנים על ידי חצים צהובים. סיכום הנתונים שחולצו מן בניסוי זמן לשגות איור 8 ב'-D. איור 8 ב' המוצגים על העלאת רמת המרחק הפלישה מרושע כל מרכז ספרואיד לאורך זמן. איור 8C תערוכות גובה של האזור הכולל הפלישה בכל אחד spheroids לאורך זמן (כולל את הפלישה הראשי אזור ואזור מופרדים/מנותק-cell). איור 8D 1-4 מראה את סדר הגודל של אזור תאים מופרדים בהשוואה לאזור הפלישה הכולל של כל ספרואיד (לאורך זמן). מספר התאים מנותקים המצטבר הוא 33, 7, 4 ו- 5 עבור spheroids #1, #2, #3 ו #4, בהתאמה. הניתוח של מספר מצטבר של תאים מנותק מעל 20 h הפלישה המתקבל 126 הלה spheroids נעוץ קולגן מוצג באיור 8E. הוכח כאן כי יש התפלגות העצום במספר התאים מנותקים האוכלוסייה שנבדקו, הערך הממוצע הוא 12.3 תאים 12.8 ±.

Figure 1
איור 1: HMCA הדמיה צלחת- (א) תמונה של אחד מאקרו-ובכן שנחרטו HMCA. (B) חתך רוחב של MC אחד בתוך HMCA הדמיה צלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הומוגניות היחס תא הפצה, ספרואיד הצמיחה ב HMCA הדמיה צלחת- (א) כיסוי של BF ותמונות פלורסנט HMCA טעון עם הלה תאים טרום מוכתם Hoechst 33342 1 µg/mL (טעינת תאי3 ריכוז 150 x 10 מ ל). תמונות נרכשו מיד אחרי הישוב תא ההגדלה MC-תמונה 4 X, גודל בר = 500 מיקרומטר. (B) הטבלה מסכמת את ההפצה של הלה תאים בתוך הצלחת הדמיה HMCA-6-טוב. התאים נספרו מן עד 90 MC/מאקרו-הבאר. התוצאות מוצגים אומר ± סטיית תקן (SD), CV (SD/mean100) מחושבת בתוך ובין הבארות המאקרו. (ג) הפצה היסטוגרמה של אזור המודולרית של 3 יום spheroids, n = 418, נחוש מתמונות BF. (ד) הפצה היסטוגרמה של היחס צמיחה ספרואיד (חתך אזור ביום ביום 3/2). יחס הצמיחה מחושב ברזולוציה רכיב אחד עבור כל אחד spheroids 418. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מעקב ספרואיד-צורה HMCA הדמיה צלחת- BF תמונה של תאים הלה (טעינת ריכוז תאי 120 x 103 מ"ל) מודגרות ב HMCA ליום 1 (א) ו- 5 ימים (B). תמונה ההגדלה 4 X, גודל בר = 500 μm. (ג) פיזור התוויה של עצם תלת-ממדי sphericity כפונקציה של אזור סקציות שלו, לאחר יום 1 (יהלומים כחולים) ו- 5 ימים (ריבועים חומים) הדגירה פוסט תא הטעינה. כל סמן מייצג הנתונים ספרואיד יחיד, n = 83. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זיהוי של התא הכדאיות ב spheroids בוגרת. כיסוי של BF ותמונות פלורסנט של חמישה ימים spheroids (טעינת ריכוז תאי 360 x 103 מ"ל) צבעונית עם PI 0.25 µg/mL (A). תמונה ההגדלה 4 X, גודל בר = 500 מיקרומטר. (B) הפצה היסטוגרמה של האחוזים של PI אזור יחסית באזור המודולרית של ספרואיד (החלונית הימנית) והיסטוגרמה הפצה של אזור סקציוניות (לוח נכון), n = 84. אחוז משטח PI מחושבת ברזולוציה רכיב אחד עבור כל אחד spheroids 84. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: השפעת ECM הרכב על תהליך הפלישה ספרואיד. BF תמונות של 3 יום הלה spheroids נעוץ תערובת של 3 מ"ג/מ"ל קולגן µg 20/mL HA (A) ו- 3 מ"ג/מ"ל קולגן (C), ב- t = 0 h ואחרי זובידאת של דגירה (B) (D), בהתאמה. תמונה ההגדלה 10 X, סולם בר = 200 מיקרומטר. HMCA הדמיה צלחת נטען לבמה של המיקרוסקופ הפוכה מצויד עם חממה. תמונות נרכשו כל 5 שעות, הניתוח קינטי מוצג מגרש (E), n = 99. כל עקומה מייצג זאת אומרת ± SD של הפלישה אזור גידול לאורך זמן, קולגן ו HA (יהלומים כחולים) וכן קולגן בלבד (ריבועים חומים). עקומת הממוצע רגרסיה ליניארית, משוואת והאטרקציות ערך R בריבוע נקובים מעל העיקולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: Fisetin מעכב הפלישה ספונטנית של הלה spheroids. BF תמונות של 3 יום הלה spheroids, מוטבעות בתערובת של קולגן 3 מ"ג/מ"ל (א) ב- t = 0, ולאחר מכן, 24 שעות לאחר תוספת של 0 מיקרומטר (B) ו- 10 מיקרומטר Fisetin (ג) למדיום תרבות שלמה. תמונה ההגדלה 4 X, גודל בר = 500 מיקרומטר. ניתוח של הפלישה אזור עבור כל ספרואיד בנקודת הסיום (t = 24 שעות ביממה) מוצג מגרש (D), n = 488. העקומה מייצג זאת אומרת ± SD שטח הפלישה כפונקציה של 0-40 µM Fisetin. טיפול Fisetin מעכב משמעותית את הפלישה ב- 10 מיקרומטר (P = 4.65 x 10-6), 20 מיקרומטר (P = 0.0021) ו- 40 µM (P = 4.86 x 10-8), באמצעות מבחן t: שני מדגמים בהנחה שונויות שוות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: לא המניע קולקטיבית הפלישה ב- MCF-7 spheroids סרטן השד- BF תמונות של 2 יום MCF-7 השד סרטן spheroids, המוטבעות קולגן () (t = 0) ו- (B) לאחר חשיפה 20 h 1 מיקרומטר DETA/לא פילוח רועי ספרואיד הוא שהוגדרו על-ידי גבול אדום, בשכבות וממוספר באדום על BF תמונות A ו- B. ROIs שהוגדרו על-ידי גבול כחול, על גודל ספרואיד לייצג תמונה B BF ומיקום -t = 0. הגדלה 4 X, גודל בר = 500 מיקרומטר. (ג) A פיזור מגרש של המתאם בין המרחק גורם והעברה התארכות של spheroids סרטן השד בודדים על החשיפה 1 מיקרומטר DETA/אין (ריבועים חומים) כמו לעומת שליטה (יהלומים כחולים) ב- t = 20. ה n = 54. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: ניתוח תמונות הפלישה ספונטנית הלה תא. BF תמונות של spheroids הלה לשלושה ימים, 16 שעות לאחר הטמעת ב קולגן (A). ההגדלה 10 X. שטח הפלישה ספרואיד ותאים מנותקים מוגדרים על-ידי גבול אדום, ספרואיד גודל ב t = 0 מוגדרת על-ידי גבול כחול, הפלישה אומר שהמרחק ספרואיד מרכז מסה הוא המסומנים על ידי חצים צהובים, התאים מנותקים המסומנים על ידי חצים שחורים. מגרש להגדלה במשך הזמן של המרחק הפלישה רשע ספרואיד מרכז מסה (B) ומאזור הפלישה הכולל (C). העקומות מייצגים ספרואיד #1 (יהלומים כחולים), ספרואיד #2 (ריבועים חום), ספרואיד #3 (משולשים ירוקים), ספרואיד #4 (Xs סגול). (ד) בר התרשים הראשי (כחול) ומופרדים תא (חום) הפלישה לאזור להגדלה במשך הזמן. (E) הפצה היסטוגרמה של המספר המצטבר של תאים מופרדים לכל ספרואיד במהלך 20 h מתהליך הפלישה, n = 126. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה מתועד היטב כי היצורים החיים, מאופיין על ידי הארגון multicellular תלת-ממדיים מורכבים שלהם הם ברורים למדי את התאים נפוץ טפט 2D תרבותי, תוך הדגשת הצורך קריטי להשתמש דגמי הסלולר אשר כדאי לחקות את הפונקציות . וסינון תהליכים של האורגניזם החי על סמים. לאחרונה, multicellular spheroids, תרבויות organotypic, organoids, איברים-על-שבב כבר הציג8 עבור השימוש בגילוי תרופות סטנדרטית. עם זאת, מהמורכבות הרבה של הדגם multicellular 3D מסכנת באופן משמעותי, parallelization בחוסנו ניתוח נתונים אשר הם קריטיים ליעילות וזמינותו.

הערכה כמותית של הפלישה קיבולת בדרך כלל מודד את התנועה של תאים דרך הידרוג חומרים. על מנת למדוד את הפלישה הגידול באמצעות צלחות מיקרו-ובכן מסורתי, מספר גדול של תאים סרטניים נמצאים נזרע ב סביב לוחות והכריחו להפעיל עליה פונקציית צבירה על ידי צנטריפוגה21,22. הצלחות האלה להגביל את התא/ספרואיד אינטראקציה סמוכים וולס, בעוד החלק התחתון עגול מונעת את איכות אופטית מסבך ייבוא תמונות. בשיטות אחרות, תאים בודדים באופן אקראי אנקפסולציה בתוך הידרוג, גדלים, לתפקד בסביבת 3D אבל לא בהכרח להתפתח בוגרת spheroids23,24. יתר על כן, פרוצדורות מסובכות התא למיקום בתוך הידרוג נדרשים, המבוסס על כוח מגנטי תא המתבנת25 או שני הפוטונים לייזר הקרנה של ביו hydrogels26.

הטכנולוגיה מבוססת על HMCA שהוצגו במסמך זה מוכיחה להיות יתרון על פני השיטות שהוזכרו לעיל: תא צבירת מיקום, ספונטנית, יצירה של spheroids מתאי התפזרו כמה יכולה להיות מושגת בקלות, ומאפשר שימוש נייד מוגבל יקר לדוגמה (למשל., תאי גזע, כמו סרטן או ראשי תאים שמקורם דגימות מטופלים). המערכת יש שליטה מעל הטבע בשני התאים שמרכיבים את spheroids, כמו גם על המיקום המרחבי המדויק שלהם במהלך הניסויים לטווח ארוך. בנוסף, בתחתית שטוח של המועדון מקלה על הדור של רבים spheroids על אותה תוכנית נקודתית, ומכאן תאורה מהירה ורכישת תמונות של שטחים גדולים באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב הוא אפשרי, ומבטל את הצורך עבור מסובך מיקרוסקופיה קונפוקלית גוזלת זמן. המערכת קל ידית ומעשיות שלה ריאלי. על ידי יישום נהלים תפעוליים פשוטים, השגנו תפוסה גבוהה של אוכלוסיות ספרואיד שבה יש כ 50% spheroids גודל דומה וניתוח אמינים של סרטן תאים הפלישה קיבולת. בנוסף, השפעת תרופות על הפלישה קיבולת ניתן לנתח בו-זמנית עם ההשפעות שלהם cytostatic ו/או ציטוטוקסיות באמצעות גישה ניתוחית גבוהה-תוכן יחד עם המכשיר HMCA תרבותי עם spheroids רבים. יתר על כן, ב, HMCA כל האלמנטים הסלולר לשתף באותו מקום ובאותה בינוני, מאפשר לחקור את האינטראקציה ספרואיד-ספרואיד אשר בדרך כלל מתווך באמצעות ציטוקינים מופרש התא, ביולוגיה מולקולרית-ראגנטים, הורמונים, ECM27. זה צולבות לדבר מקלה על ההישרדות והפונקציה של תאים בודדים/קטן אשכולות תא בכרך מאקרו-. טוב.

שלב קריטי בביצוע של הפרוטוקול הוא התוספת של תערובת ECM מעל את spheroids ואימות הפילמור שלו תקין. Spheroids לא יציג להתנהגות הנדידה, אפילו אם הן מוטבעות בתוך ECM, אלא אם כן הרכבה ו- cross-linking להתרחש, סיבי קולגן המתאים נוצרות. סיבי הקולגן יכול להיות שנצפו על ידי תאורה BF, אנו ממליצים לבדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את יצירת סיבי קולגן בסופו של שלב זה. מאז מספר spheroids הוא תלוי על ריכוז תא הראשונית ואת האחוזים של השטחים MCs, המערך צריך להיבדק לאחר הטעינה הראשונית תא, אם התא התפוסה אינה אופטימלית, זריעה מחדש של המערך אותו ניתן לבצע. ואכן, גודל ואת הגיאומטריה של HMCA המתוארים בזאת תוכננו כדי להכיל את אשכולות תאים קטנים יחסית (עד 150 מיקרומטר בקוטר). זה יכול להיחשב מגבלה מאז עיצוב סוג חדש של מערך יהיה צורך לניתוח נדידת תאים של מבנים התא גדול יותר.

הפלטפורמה הנוכחית מנצל המספר מינימלי ונפח קטן ריאגנט, בזמן בו זמנית מתן גודל דגימה גדולה (אלפי spheroids לכל צלחת). על מנת לנתח 12 תרכובות שונות לפעילות אנטי גרורתי, שתי צלחות HMCA המבוסס על יחידה של 6-ובכן יהיה צורך, מניב את התוצאות כ-5,000 spheroids, ואילו הצלחות 96-ובכן לפחות חמישים יהיה צורך להשיג את התוצאה זהה. היכולת לנתח את ההעברה ברזולוציה הפרט-אובייקט ב- HMCA מספק רמה גבוהה של חוסן סטטיסטי ודיוק, המאפשרת לימוד הטרוגניות פונקציונלי מבניים הפלישה ב spheroids רבים.

מחקר זה מדגים באופן ייחודי את הפלישה קולקטיבית של אוכלוסיות ספרואיד סרטן השד על החשיפה DETA/כלא האשכולות התא של תאי MCF7 להראות amoeboid פנוטיפ נודדות, שינויים כמותיים מורפולוגיה ובמיקום של ספרואיד כל השגה באופן אוטומטי. למיטב ידיעתנו, זה המערכת ערוכים הראשונה המאפשרת ניטור וניתוח של הפלישה קולקטיבית ב- 3D מבנים רבים. על ידי ניתוח הכיוונים היחסי ואת המרחק הפלישה עבור כל ספרואיד, זה אפשרי ללמוד את האינטראקציה הדדית בין spheroids בתוך האוכלוסייה. בנוסף, השפעת גורמים חוץ-תאית microenvironment הוקמה על סרטן התא התנהגות28 מודגם כאן. בין גורמים אלה, נוקשות של הרכב microenvironment הוכח משפיעים מאוד על נדידת תאים. HMCA טכנולוגיות מספקת ביונים מוגדרת, של, במבחנה פלטפורמה, שבו מאפיינים אלה של ECM יכול להיות בקלות לגשת ומבוקר. הנוקשות של טהור קולגן מסוג I הידרוג-הריכוז של 3 מ"ג/מ"ל ששימש במחקר זה, הוא דיווח כי כ 50-600 פא29,30,31 , התוספת של HA (20 µg/mL; 0.4 wt %) לא השתנה הנוקשות של הידרוג באופן משמעותי32,33. לפיכך, אפקט המדכא של בינוני משקל מולקולרי (MMW)-HA על הפלישה spheroids הלה 3D אשר הדגימו כאן אינה עקב שינויים נוקשות. תוצאות אלו הם מסכים עם מחקרים קודמים הראו תופעת דו-אופנית HA הפלישה התא סרטן עם תלות גבוהה ב- HA משקל מולקולרי34,35,36,37.

יישומים עתידיים של השיטות כוללות לצד רב תא סוג culturing של גידול תאי סטרומה אזורים שונים בתוך הבאר המאקרו, ואני אחזור של spheroids ספציפי לניתוח מולקולרית במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי עזבון משה שמעון, ג'ודית Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

Tags

חקר הסרטן בעיה 140 עצמים תלת-ממדיים multicellular ספרואיד הידרוג מיקרו-הקאמרית הפלישה assay ECM תמונה ניתוח הפלישה קולקטיבית דגם תלת-ממד תרבות
ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N.,… More

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter