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Cancer Research

Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58359
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Bar-Ilan University

Summary

Un piatto di imaging basata su HMCA è presentato per prestazioni di test di invasione. Questa piastra facilita la formazione di sferoidi tridimensionali (3D) del tumore e la misurazione dell'invasione della cellula tumorale nella matrice extracellulare (ECM). La quantificazione di dosaggio di invasione avviene mediante analisi semi-automatica.

Abstract

Metastasi del cancro è conosciuta per causare il 90% della mortalità del cancro. La metastasi è un processo a più stadi che inizia con la penetrazione/invasione delle cellule del tumore nei tessuti vicini. Così, l'invasione è un passo cruciale nella metastasi, rendendo l'invasione processo ricerca e sviluppo di farmaci anti-metastatici, altamente significativo. Per rispondere a questa domanda, c'è una necessità di sviluppare modelli 3D in vitro che imitano l'architettura dei tumori solidi e loro microambiente maggiormente allo stato di in vivo su una mano, ma allo stesso tempo essere riproducibile, robusto e adatto per ad alto rendimento e alta misura del contenuto. Attualmente, la maggior parte delle analisi di invasione appoggiano microfluidici sofisticate tecnologie che sono sufficienti per la ricerca, ma non per lo screening di stupefacenti ad alto volume. Altre analisi utilizzando dispositivi basati su piastra con sferoidi isolati individuali in ciascun pozzetto sono materiale che consumano e hanno le dimensioni campione basso condizione. L'obiettivo del protocollo attuale è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D basati su cellule per l'analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Abbiamo sviluppato un modello 3D per analisi di invasione basato sul HMCA piatto imaging per la ricerca di invasione del tumore e di scoperta della droga anti-metastatica. Questo dispositivo consente la produzione di numerose sferoidi uniforme per pozzetto (dimensione del campione di alta condizione) circondato da componenti della MEC, mentre continuamente e contemporaneamente osservare e misurare le sferoidi a elemento singolo risoluzione per mezzo screening di resa di farmaci anti-metastatiche. Questa piattaforma è presentata qui dalla produzione di sferoidi HeLa e MCF7 per esemplificando la cella singola e collettiva invasione. Mettiamo a confronto l'influenza dell'ECM componente acido ialuronico (HA) sulla capacità invasiva del collagene circostante HeLa sferoidi. Infine, vi non presentiamo Fisetin (inibitore di invasione) a HeLa sferoidi e ossido nitrico () (attivatore di invasione) di MCF7 sferoidi. I risultati sono analizzati dal software interno che consente l'analisi semi-automatica, semplice e veloce che facilita l'esame multi-parametro.

Introduction

Morte per cancro è attribuita principalmente alla diffusione delle cellule metastatiche in luoghi distanti. Molti sforzi nel trattamento del cancro concentrano sul targeting o prevenire la formazione di colonie metastatiche e la progressione della malattia metastatica sistemica1. Migrazione delle cellule di cancro è un passo cruciale nel processo di metastasi del tumore, così, la ricerca della cascata di invasione del tumore è molto importante e un prerequisito per trovare terapie anti-metastatica.

L'uso di modelli animali come strumenti per lo studio della malattia metastatica è stato trovato per essere molto costoso e non sempre rappresentativo del tumore in esseri umani. Inoltre, la topologia del microambiente extracellulare, la meccanica e la composizione possono influenzare fortemente cancro cella comportamento2. Dato che in vivo modelli intrinsecamente mancano la capacità di separare e controllare tali parametri specifici che contribuiscono alla invasione tumorale e metastasi, c'è un'esigenza biomimetici controllabile in vitro modelli.

Per riprodurrsi per metastasi agli organi distanti, le cellule tumorali devono esibire tratti fenotipici migratori e invasivi che possono essere mirati per la terapia. Tuttavia, poiché la maggior parte dei modelli in vitro del cancro non imitare le effettive caratteristiche di tumori solidi3, è molto difficile da rilevare fenotipi fisiologicamente rilevanti. Inoltre, l'eterogeneità fenotipica che esiste all'interno del tumore, impone la necessità per l'analisi di migrazione di tumore a elemento singolo risoluzione al fine di scoprire terapie fenotipo-diretto, per esempio, prendendo di mira la cella d'inizio metastasi popolazione all'interno di tumori eterogenei4.

Lo studio della motilità cellulare e migrazione collettiva avviene principalmente in colture monostrato di cellule epiteliali su superfici piane omogenee. Questi modelli di cellulari convenzionali per migrazione delle cellule di cancro sono basati sull'analisi della popolazione delle singole cellule che invadono attraverso le membrane ed ECM componenti5, ma in tali sistemi, le differenze intrinseche tra le singole celle non possono essere ha studiato. Sferoidi 3D generazione tramite impalcature o in micro-strutture senza impalcatura è considerato come superior significa studiare il tumore delle cellule di cancro e crescita invasione6,7,8. Tuttavia, più sistemi 3D non sono adatti ad elevato throughput formati e interazione inter-sferoide solitamente non può essere realizzato poiché isolati sferoidi individuali vengono generati in ogni micro-pozzo9. Gli studi recenti che coinvolgono la migrazione di cancro si basano su microfluidic dispositivi3,10,11,12, tuttavia, questi sofisticati microfluidici strumenti sono difficili da produrre e non può essere utilizzato per high throughput screening (HTS) di farmaci anti-dilaganti.

Due fenotipi principali, migrazione cellulare collettiva e individuale, che svolgono un ruolo in cellule del tumore, superando la barriera di ECM e invadendo il tessuto vicino, sono stati dimostrati13,14, ogni visualizzazione distinte morfologica caratteristiche, meccanismi biochimici, molecolari e genetici. Inoltre, due forme di migrazione delle cellule del tumore, fibroblasto-come e ameboidi, sono osservate in ogni fenotipo. Dato che entrambi, fenotipi di invasione e le modalità di migrazione, principalmente sono definiti da proprietà morfologiche, c'è una necessità per cellulari modelli che attiva la rilevazione basata su formazione immagine e l'esame di tutte le forme di invasione del tumore e la migrazione di cellule.

L'obiettivo generale del metodo corrente è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D in vitro basati su cellule per l'analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Qui, presentiamo la piastra di imaging 6 pozzetti HMCA-based per la ricerca di invasione del tumore e la terapia anti-metastatica. La tecnologia consente la formazione di un gran numero di sferoidi tumore 3D uniforme (450 per pozzetto) in una struttura di micro-chambers (MC) di idrogel. Vari componenti della ECM vengono aggiunti alla matrice sferoide per abilitare l'invasione delle cellule nell'ambiente circostante. Processo di invasione è costantemente monitorato tramite l'osservazione a breve e a lungo termine delle stesse cellule individuali degli sferoidi che invade e facilita la caratterizzazione morfologica, colorazione fluorescente e il recupero di specifici sferoidi in qualsiasi punto. Poiché numerose sferoidi condividono spazi e medio, è possibile interagire tramite molecole solubili tra sferoidi individuali e il loro impatto su un altro. Analisi semi-automatica dell'immagine viene eseguita utilizzando il codice MATLAB in-House che consente la raccolta più veloce ed efficiente di grandi quantità di dati. La piattaforma facilita la misurazione accurata, simultanea di numerose cellule di sferoidi/invadendo in maniera efficiente, consentendo di screening su vasta scala medio di farmaci anti-invasione.

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Protocol

1. HMCA piastra goffratura

Nota: Il processo completo per la progettazione e la fabbricazione di polidimetilsilossano (PDMS) timbro e piastra imaging HMCA utilizzato in questo protocollo è descritto in dettaglio nel nostro precedente articoli15,16. Il timbro PDMS (forma negativa) viene utilizzato per imprimere il HMCA (forma positiva) che consiste di circa 450 MCs per pozzetto (Figura 1A). Come dimostrato in Figura 1B, ciascuno di MCs ha la forma di un tronco di piramide capovolto forma quadrata (altezza: 190 µm, piccola area base: 90 µm x 90 µm e grande superficie di base: 370 µm x 370 µm). La piastra HMCA viene utilizzata per la preparazione e la coltura di sferoidi 3D del tumore e da allora in poi, per analisi di invasione. In alternativa, un timbro commerciale potrebbe essere utilizzato per la produzione di HMCA.

  1. Preparare una soluzione di 6% di agarosio bassa fusione (LMA). Inserire la LMA polvere e soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) (0,6 g di LMA per 10 mL di PBS) in una bottiglia di vetro con un agitatore magnetico. Collocare il flacone su una piastra riscaldante e agitare la soluzione durante il riscaldamento a 80 ° C per alcune ore finché non si ottiene una soluzione uniforme. Mantenere la soluzione a 70 ° C fino all'utilizzo.
  2. Pre-riscaldare il timbro PDMS a 70 ° C in forno. Tenere in caldo fino all'utilizzo. In alternativa, utilizzare un timbro commerciale e seguire le istruzioni.
  3. Posizionare le piastre commerciale 6-pozzetti con fondo di vetro su un bagno secco pre-riscaldato a 75 ° C. Attendere alcuni minuti fino a quando la piastra è totalmente calda.
  4. Versare una goccia (400 µ l) di LMA pre-riscaldato sul fondo del bicchiere di ciascuno dei pozzetti della piastra. Posizionare delicatamente il timbro PDMS pre-riscaldato sopra la goccia di agarosio. Incubare a temperatura ambiente (TA) per 5 – 10 min per pre-gelificazione e pre-raffreddamento. Incubare a 4 ° C per 20 min raggiungere completo dell'agarosi gelificazione. Quindi, staccare delicatamente il PDMS, lasciando il gel di agarosio modellato con MCs.
    Nota: Questo passaggio avviene simultaneamente in tutti i pozzetti.
  5. Posizionare la piastra in rilievo in un sistema dotato di raggi ultravioletti (UV) lampada di polimerizzazione e incubare per 3 min.
    Nota: Ora la piastra HMCA è UV sterilizzato.
  6. Riempire i macro-pozzetti con PBS sterile per garantire che essi sono mantenuti umidi, quindi coprire la piastra, avvolgerlo con parafilm e conservarlo a 4 ° C fino all'utilizzo.
  7. Prima dell'uso, svuotare residui dalla piastra HMCA di PBS. Posizionarlo nella cappa biologica.

2. le cellule e la formazione della sferoide di carico

  1. Raccogliere le cellule come segue: rimuovere tutte le medie da un monostrato di cellule di 10cm cultura piastra, lavare due volte con 10 mL di PBS per smaltire i residui di siero, aggiungere 5 mL di tripsina (pre-riscaldata a 37 ° C) e incubare per 3 min in incubatore a 37 ° C. Quindi, agitare la piastra delicatamente per garantire il distacco dello strato monomolecolare, aggiungere 10 mL di terreno completo (pre-riscaldato a 37 ° C) e pipetta su e giù finché non si ottiene la sospensione cellulare omogenea. Centrifugare e lavare la sospensione cellulare con 15 mL di terreno nuovo, poi la sospensione a concentrazioni appropriate in mezzo fresco completo.
  2. Caricare delicatamente la sospensione cellulare (50 µ l, 150 – 360 x 103 cellule/mL in mezzo, ~ 16 – 40 cellule per MC) sopra il HMCA e permettono alle cellule di depositarsi per gravità per 15 min.
  3. Aggiungere delicatamente le aliquote di 6 – 8 di mezzo fresco a 500 µ l (totale 3-4 mL) al bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo fuori dalla matrice anello e idrogel.
  4. Incubare le cellule HeLa per 72 h e cellule MCF7 per 48 h a 37 ° C e 5% di CO2, in atmosfera umidificata per la formazione di sferoidi.

3. sostenibilità rilevamento di ioduro di propidio (PI) colorazione

  1. Preparare una soluzione stock di PI (500 µ g di PI per 1 mL di PBS). Tenerlo a 4 ° C per circa 6 mesi. Appena preparare una diluizione di 1:2,000 (0,25 µ g/mL), con l'aggiunta di 6 µ l di brodo per 12 mL di terreno completo senza rosso fenolo, per la piastra HMCA 6 pozzetti (2 mL per pozzetto).
  2. Trasferire la piastra HMCA con sferoidi di 48-72 h, dall'incubatrice alla cappa biologica. Pendente la fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo accanto la matrice di idrogel per rimuovere tutte le medie dalla HMCA, lasciando il serbatoio di matrice riempito con il mezzo.
  3. Delicatamente aggiungere 2 mL di diluizione PI da passo 3.1 in ciascun pozzetto, piegandosi alla fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo. Incubare la piastra HMCA per 1h a 37 ° C e 5% CO2, in atmosfera umidificata. Procedere al passaggio 7.
    Nota: Altri coloranti possono essere utilizzati qui pure, per esempio, Hoechst per la colorazione del nucleo, estere metilico di tetrametilrodamina (TMRM) per il potenziale di membrana mitocondriale macchiando, diacetato di fluoresceina (FDA) per la rilevazione di cellule vive, Annexin V per apoptosi rilevamento e altri.

4. preparazione della miscela collagene

  1. Preparare l'acqua distillata doppia sterile (DDW) autoclave e uno stock di 100 mL di soluzione di filtro-sterilizzato di 1 M NaOH. Mantenere i materiali a RT e le punte utilizzate per la preparazione della miscela del collagene congelati a-20 ° C, fino all'utilizzo.
  2. 10 – 20 min prima dell'uso, inserire tutti i intergrades tra cui: DDW sterile, 1 M NaOH soluzione sterile, sterile 10 x PBS, tipo I collagene da coda di topo (conservato a 4 ° C per 3 – mesi) e un tubo sterile nel secchio di ghiaccio fino a quando completamente raffreddato. Posizionare il secchio di ghiaccio all'interno della cappa biologica.
  3. Prepararsi 1.800 µ l della miscela di collagene a una concentrazione finale di 3 mg/mL, piastra a 6 pozzetti HMCA invasione assay (300 µ l per pozzetto) come segue. Aggiungere il intergrades nel tubo raffreddato nel seguente ordine: 515 µ l di DDW, 24,8 µ l di 1 M NaOH e 180 µ l di PBS 10X. Mescolare bene vortice e porre nuovamente dentro il ghiaccio. Infine, µ l 1080 di collagene alla miscela, vortice nuovamente e rimise sul ghiaccio.

5. ettari e preparazione della miscela di collagene

  1. Sciogliere 10 mg di HA in 2 mL di DDW sterile. Incubare la miscela a temperatura ambiente per qualche minuto e vortice delicatamente fino a che la polvere sia completamente disciolta. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C fino a due anni.
  2. Proprio prima dell'utilizzo, collocare la soluzione stock HA nel secchio di ghiaccio all'interno della cappa biologica.
  3. Preparare un 3mg/mL di miscela di collagene come descritto nel passaggio 4. Riaggiungere 36 µ g (7,2 µ l) di HA 1.800 μL di miscela di collagene, pronto per una concentrazione finale di 20 µ g/mL. Poi, vortice ancora brevemente e mettere in ghiaccio.

6. ECM miscela aggiunta

  1. Trasferire la piastra HMCA, con sferoidi di 48-72 h, dall'incubatrice in cappa biologica e posizionarlo sul ghiaccio. Incubare per 10 minuti fino a quando la piastra viene raffreddata. Pre-riscaldare una soluzione di 1% LMA a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Rimuovere tutte le medie da intorno HMCA, piegandosi alla fine punta sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo accanto la matrice di idrogel. Quindi, con molta attenzione, rimuovere tutte le medie dal serbatoio di matrice con un bel suggerimento/gel carico di punta, piegandosi alla fine punta sul bordo matrice, delicatamente e lentamente succhiare tutto il mezzo fuori.
    Nota: Dopo aver rimosso tutte le medie da intorno la matrice di idrogel, il serbatoio di matrice è ancora pieno di mezzo. Questo mezzo deve essere rimosso molto delicatamente per evitare la distruzione di idrogel MC e dislocazione di sferoidi.
  3. Prendete 150 µ l di miscela di collagene o miscela HA e collagene (ECM miscela) con la punta fine pre-congelata e aggiungere nel serbatoio matrice collegando la punta verso il bordo della matrice. Rilasciare la miscela lentamente per evitare la dislocazione della sferoide. Ripetere questo passaggio con un'altra aliquota di 150 µ l, per un totale 300 µ l per pozzetto. Seguire la stessa procedura per ciascun pozzetto fino a tutti i pozzetti sono pieni. Quindi posizionare la piastra in incubatrice per 1 h per la gelificazione completo del ECM.
  4. Dopo la gelificazione completo di ECM è stato raggiunto, dispensare 400 µ l di pre-riscaldato 1% LMA sulla superficie del gel di ECM. Coprire la piastra con il suo coperchio, incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 – 7 minuti e poi per 2 min a 4 ° C, per gelificazione dell'agarosi. Infine, delicatamente aggiungere 2 mL di terreno completo si appoggia l'estremità sul bordo della parte inferiore in plastica macro-pozzo.
    Nota: Lo strato di agarosio impedisce il distacco della matrice del collagene-gel dal HMCA.

7. invasione Assay acquisizione e analisi

  1. Carico la piastra HMCA su un motorizzato invertito il tavolino del microscopio dotato di un incubatore, pre-regolato a 37 ° C, 5% CO2 e atmosfera umidificata.
  2. Pre-determinare le posizioni per acquisizione di immagini in ogni bene in modo da coprire l'area dell'intera matrice e utilizzano 10 X o 4 X obiettivi (questo passaggio è necessario per il software di acquisizione di immagine utilizzato qui, vedere la Tabella dei materiali sotto per dettagli). In alternativa, utilizzare qualsiasi software di acquisizione immagini per facilitare la scansione automatica di tutta l'area necessaria, scegliendo il "Stich" opzione.
  3. Acquisire immagini luminose del campo (BF) ogni 2 – 4 h per un periodo complessivo di 24-72 h per seguire l'invasione delle cellule dal corpo sferoide in ECM circostanti.
  4. Acquisire immagini fluorescenti per il rilevamento di PI utilizzando un cubo fluorescente dedicato (eccitazione filtro 530 – 550 nm, specchio dicroico 565 nm lungo pass ed emissione filtro 600-660 nm).
  5. Esportare immagini time-lapse di BF/fluorescente dal software di acquisizione immagini e salvarle in formato tagged image file (TIFF), a una cartella dedicata, utilizzando la scheda "Database" nella barra degli strumenti, quindi il tasto "Esporta record file" .
    Nota: Abbiamo sviluppato un codice di analisi in-House speciale nel software MATLAB che include un'interfaccia utente grafica progettata (GUI) in quale invasione analisi potrebbero essere eseguito più velocemente e facilmente. In questo codice di analisi, la segmentazione delle sferoidi e zona di invasione è fatto semi-automaticamente utilizzando il filtro di Sobel seguita dagli operatori morfologici erosione e dilatazione. Dopo la segmentazione automatica delle aree, sono state apportate correzioni manuali dove necessario per una migliore precisione. Dopo il completamento di segmentazione, un set di parametri sono stati automaticamente calcolato dal software ed esportati in un file excel per ulteriori manipolazioni. L'elenco dei parametri sono: area sezionale base sferoide a tempo = 0, zona di invasione delle cellule collegate al corpo sferoide = zona di invasione principale, zona delle cellule separate dalla zona di invasione principale, numero di cellule separata dalla zona di invasione principale, distanza media di invasione dal centro di massa della sferoide base alla circonferenza della zona di invasione principale e cellule separate e parametro distance invasione collettiva = d (d = √ ((X2 -1)2 + (Y2 – Y1)2) sul Le coordinate X e Y della sferoide centro di massa, prima (X1, Y1) e dopo (X2, Y2) processo di invasione collettiva). In alternativa, analisi dell'immagine potrebbe essere fatto con qualsiasi altro software specializzato.
  6. Aprire l'interfaccia grafica e premere il pulsante "Load BF" . Dopo avere aperto l'immagine, regolare i parametri di segmentazione (dimensione minima: > 1 e raggio chiudere: > 1) per ottenere una precisa segmentazione della sferoide e la sua area di invasione, premere quindi il tasto "Regione di segmentazione di interesse (ROI)" per l'esecuzione e verrà visualizzato un bordo intorno a ogni sferoide. Se la segmentazione automatica non è corretta, premere il pulsante "Elimina" o "Aggiungi" e apportare le correzioni richieste manualmente. Ripetere la stessa procedura per le immagini successive.
  7. Premere il pulsante "Tracking" per numerare le sferoidi e il software assegnerà lo stesso numero per ogni sferoide in ciascuna delle immagini di lasso di tempo. Quindi, premere il pulsante "Misura" , che genererà un foglio di calcolo con tutti i parametri. Salvare questo foglio di calcolo come un file di excel per ulteriore elaborazione di risultati e statistiche in excel software.

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Representative Results

L'unico HMCA piastra di imaging viene utilizzato per l'analisi di invasione di sferoidi 3D del tumore. Il test intero, inizia con la formazione della sferoide e termina con il processo di invasione e ulteriori manipolazioni, viene fatto all'interno della placca stessa. Per la formazione della sferoide, cellule HeLa sono caricate nel bacino di matrice e stabilirsi in idrogel MCs per gravità. L'idrogel MCs, che hanno caratteristiche di non-aderente/basso attaccamento, facilitare l'interazione cellula-cellula e la formazione di sferoidi 3D del tumore. Figura 2A illustra le cellule si stabilì a MCs, in seguito all'uso di 150 x 103 cellule/mL soluzione di caricamento (cioè., ~ 16 cellule per MC valore calcolato). È chiaro che l'occupazione di cellule per MC non è distribuito uniformemente attraverso la matrice, e la distribuzione di media statistica ottenuta è 14,78 ± 3,60 cellule per MC. La tabella in Figura 2B riassume la distribuzione delle cellule al MC per tutta la piastra HMCA. Il coefficiente medio di variazione (CV) della distribuzione delle cellule all'interno di un macro-pozzo è 43.33%, mentre tra i macro-pozzetti è 24.37%. Le differenze nell'occupazione di cella sono cruciali e dettano direttamente le dimensioni di sferoidi formate e la loro omogeneità in tutta la piastra. Al fine di ridurre/minimizzare la variabilità creata dal numero di cellule per MC, l'analisi dei risultati viene eseguita a singolo elemento ad alta risoluzione. Le trame in Figura 2-D illustrano la distribuzione delle dimensioni (sezione) di sferoidi di 3 giorni. Esso è chiaramente esemplificato nella Figura 2D che calcolo del rapporto di crescita di ogni sferoide (l'area sezionale al giorno 3 volte al giorno 2) ha una distribuzione più omogenea rispetto alla distribuzione di dimensione assoluta (Figura 2), producendo un CV di 15,48% e 52,80%, rispettivamente. Distribuzione dei diametri della sferoide di sferoidi 3 giorni produce un CV del 24,52% e il rapporto di crescita (diametro al day3/day2) è 7,45%. Questi valori di CV sono simili a17 o superiore a18 altri segnala il raggiungimento delle cellule di carico per gravità. Al fine di eliminare la varianza dei parametri misurati derivanti dalla variabilità del numero di teste di serie iniziale delle cellule al MC, è preferibile per normalizzare i parametri selezionati per il numero iniziale delle cellule o per qualsiasi altro parametro misurato dello stesso oggetto, tali che ogni sferoide ha suo controllo interno. Questo approccio potrebbe essere applicato facilmente tracciando l'oggetto sulla piastra imaging HMCA.

Il processo di formazione della sferoide e crescita potrebbe essere facilmente seguito su HMCA piastra di imaging. Figura 3A-B Mostra un'immagine BF di una regione sulla HMCA piastra contenenti aggregati di cellule HeLa 24h di imaging e la rispettiva immagine di maturo, 5–giorno multicellulari oggetti 3D, che stanno diventando sempre più sferica e più denso. È chiaramente indicato che la maggior parte oggetti mantengono la loro posizione durante il periodo di incubazione di 5 giorni. L'analisi di forma (sfericità) e dimensione (area sezionale) durante la formazione della sferoide è presentata in Figura 3. Il grafico a dispersione viene illustrato gli aumenti in entrambi i parametri da giorno 1 a giorno 5; 0,544 ±0.020 a.u. 0.684± a.u. 0,016 per sfericità (p < 0,05) e 0.00356± 0,00013 mm2 a 0.00538 ± 0,00015 mm2 per area sezionale (p < 0,05), rispettivamente. Mentre gli aggregati 24-h sono piccoli e hanno forma non regolare, i rispettivi sferoidi di 5 giorni sono più grandi e acquisiscono forma sferica.

La rilevazione di attuabilità delle cellule sferoide viene eseguita utilizzando bassa concentrazione PI per la macchiatura19 che aggira la necessità per il lavaggio di tintura. PI penetra la membrana cellulare e quindi si intercala nel DNA di cellule non vitali. Figura 4A Mostra sferoidi HeLa 5 giorni macchiati con PI (in rosso). Analisi della percentuale di area rossa (che rappresentano le cellule morte) fuori ogni area sezionale sferoide sono riassunto nella Figura 4B. L'istogramma mostra che l'85% della popolazione di sferoide ha un'area di valore massimo del 5% rosso macchiato e la media è di 3,01 ± 2,34% (sinistra istogramma). Area sezionale di sferoidi (istogramma destra) Mostra una distribuzione normale con media di 0.02447 ± 0,00487 mm2.

Dopo aver prodotto sferoidi HeLa maturi di 3 giorni, il test di invasione è fatto entro il HMCA piastra di imaging. L'effetto delle variabili, come ad esempio la composizione di ECM, inibitori e attivatori, sul processo di invasione del tumore 3D sferoide potrebbe essere esaminato. Per prestazioni di test di invasione, il mezzo è delicatamente rimosso e sostituito con pipetta soluzione ECM sopra sferoidi nel bacino di matrice del MC. Dopo la gelificazione completo della soluzione ECM, terreno completo viene aggiunto nel macro-bene. (1) al fine di esaminare l'influenza di HA sul processo di invasione spontanea della sferoide di HeLa, sferoidi erano coperti con collagene e soluzione di miscela HA (Figura 5A) e rispetto a quelli coperti con soluzione unica di collagene (Figura 5), e Immagini BF sono acquistate subito dopo la gelificazione ECM (t = 0 h). La cinetica del processo di invasione è stata seguita da imaging delle stesse regioni ogni 5 ore per un periodo di 63 h. Dopo 50 h di incubazione, sferoidi incorporato nel collagene e HA (figura 5B) ha mostrato minore dispersione delle cellule in ECM circostante rispetto sferoidi incorporato nel collagene solo (Figura 5). L'analisi della zona di invasione cinetica nel tempo, per 99 sferoidi a risoluzione di singolo-sferoide è riassunto nella Figura 5E. Figura 5E stampa l'area media/media invasione nel tempo dei due gruppi e dimostra chiaramente che l'aggiunta di HA a collagene inibisce la dispersione delle cellule fuori la sferoide, risultante in piccole aree di invasione. La media delle piste risultanti dalle curve di regressione lineare regolazione per ciascuna delle sferoidi incorporati in collagene (0.001973 ± 0,000894 mm2/h) rispetto al collagene e soluzione HA (0.001410 ± 0,000941 mm2/h) sono significativamente differenti (p = 0,003, test t: due campioni assumendo uguale varianza). (2) al fine di esaminare l'influenza del Fisetin (un flavonoide bioactive trovato in molti frutti e verdure che Mostra attività citostatica e migrastatic agendo su diversi bersagli molecolari tra cui fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) / Akt/c-Jun N-terminal chinasi (JNK) segnalazione di Wnt/β-catenin segnalazione dei downregulates metalloproteinasi della matrice (MMPs) e di altri20) sul processo di invasione spontanea di HeLa sferoide, aumento delle concentrazioni del farmaco sono stati aggiunti al medium completo e BF immagini sono state acquisite a t = 0 (Figura 6A) e 24 ore più tardi (Figura 6B-C). Come dimostrato, 10 µM del Fisetin (Figura 6) inibisce la dispersione delle cellule intorno sferoidi rispetto non trattata HeLa sferoidi (Figura 6B). L'analisi di zona di invasione di un esperimento di risposta dose (Figura 6) esibisce l'inibizione significativa a 10-40 µM di Fisetin (p < 0,003), raggiungendo la saturazione alla concentrazione di 10 µM e superiore. (3) è stato dimostrato che NO, a un livello di nano-molare, contribuisce a un fenotipo più aggressivo di cancro al seno da stimolante di espansione e migrazione di tumore16. Al fine di esaminare l'influenza di NO sul processo di invasione collettiva di sferoidi MCF7 incorporato nel collagene, 1 µM di donatori di ossido nitrico/dietilentriammina (DETA/NO) è stato aggiunto al terreno di coltura completa e BF immagini sono state acquisite a t = 0 e t = 20 h. drammatico cambiamenti nella morfologia e posizioni di sferoidi 3D durante l'esposizione a nessun donatore sono evidenti (figura 7A-B). Sferoidi perdono loro sfericità e diventano più allungate acquisendo ameboide fenotipo migratori. In concomitanza, traslocazione avanzata di sferoidi all'interno della matrice di collagene circostante è stata osservata (Figura 7). Il valore di allungamento medio significativamente aumentato da 1.305 ± 0,193 a.u. a 1.477 ± 0,298 a.u., (p < 0,0006). La distanza di migrazione media misurata per la stesse sferoidi era significativamente estesa, 0.0788 ± 0,0575 mm e ± 0.3164 0,3365 mm in assenza e in presenza di DETA/NO, rispettivamente (p < 4 x 10-6).

Analisi dell'immagine dell'invasione della sferoide è stata realizzata da semi-automatico software MATLAB in-House. Le immagini del lasso di tempo acquistato di formazione della sferoide e invasione entro il HMCA è costituito da numerose sferoidi in un'unica immagine (4-6 sferoidi a 10 ingrandimenti e sferoidi di 25-30 con un ingrandimento 4x). L'analisi di formazione della sferoide, la crescita e l'invasione è stata eseguita simultaneamente tutti gli sferoidi nell'immagine. I parametri chiave estratti per l'invasione della sferoide sono presentati in Figura 8A, che mostra una segmentazione di immagine rappresentativa di 4 sferoidi presso un unico punto di tempo (t = 16 h). L'area di invasione principale definita da un bordo rosso, come pure le cellule separate che disinnestata e dispersi intorno ad esso (indicato da frecce nere), sono state rilevate e numerate per ogni sferoide nel corso del tempo. Dimensione della sferoide prima invasione a t = 0 è definito da un bordo blu. La distanza media/media invasione da sferoide centro di massa alla circonferenza di zona di invasione tra cui cellule separate è calcolata dalla segmentazione rossa circondata e indicata da frecce gialle. Dati estratti da questo esperimento di time-lapse sono riassunto nella Figura 8B-D. Figura 8B esibisce l'elevazione della distanza media invasione da ogni centro di sferoide nel corso del tempo. Figura 8 esibisce l'elevazione della zona di invasione totale in ciascuna delle sferoidi nel tempo (compresa l'invasione principale area e area separata/disinserito-cella). Figura 8 1-4 Mostra l'ampiezza dell'area di celle separate rispetto all'area totale invasione di ogni sferoide (nel tempo). Il numero cumulativo di cellule disimpegnate è 33, 7, 4 e 5 per sferoidi #1, #2, #3 e #4, rispettivamente. L'analisi dei numeri cumulativi delle cellule disimpegnate oltre 20 h di invasione ottenuto da 126 HeLa sferoidi incluse in collagene è mostrato in Figura 8E. È dimostrato qui che c'è una vasta distribuzione del numero di cellule disimpegnate nella popolazione esaminata e il valore medio è di 12,3 ± 12,8 cellule.

Figure 1
Figura 1: The HMCA imaging piastra. (A) immagine di un macro-pozzetto in rilievo con HMCA. (B) una sezione trasversale di un MC entro il HMCA piastra di imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: omogeneità del rapporto delle cellule distribuzione e sferoide crescita in HMCA imaging piastra. (A) una sovvrapposizione di BF e immagini fluorescenti di HMCA caricato con cellule HeLa pre-colorate con Hoechst 33342 1 µ g/mL (concentrazione 150 x 103 cellule per mL di caricamento). Le immagini sono acquistate subito dopo l'insediamento di cella nell'ingrandimento dell'immagine MC. 4 X, barra della scala = 500 µm. (B) la tabella riassume la distribuzione delle cellule HeLa all'interno del piatto di imaging HMCA-6-bene. Le cellule sono state contate da fino a 90 MC/macro-pozzo. I risultati sono presentati come media ± deviazione standard (SD), CV (SD/mean100) viene calcolato all'interno e tra i macro-pozzetti. (C) istogramma di distribuzione dell'area sezionale di sferoidi 3 giorno, n = 418, determinata dalle immagini BF. (D) istogramma di distribuzione del rapporto di crescita sferoide (l'area sezionale al giorno 3 volte al giorno 2). Rapporto di crescita viene calcolato a elemento singolo risoluzione per ciascuno dei 418 sferoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: monitoraggio formazione della sferoide in HMCA imaging piastra. Immagine BF delle cellule HeLa (caricamento concentrazione 120 x 103 cellule / mL) incubati in HMCA per 1 giorno (A) e 5 giorni (B). Immagine ingrandimento 4 X, barra della scala = 500 μm. (C) Scatter trama di sfericità oggetto 3D in funzione della sua area sezionale, dopo 1 giorno (diamanti blu) e 5 giorni (marroni quadrati) di carico cella di incubazione post. Ogni indicatore rappresenta i dati analizzati da un singolo sferoide, n = 83. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: rilevamento di attuabilità delle cellule in sferoidi maturi. Una sovrapposizione di BF e immagini fluorescenti di sferoidi di 5 giorni (caricamento concentrazione 360 x 103 cellule / mL) macchiato con PI 0,25 µ g/mL (A). Immagine ingrandimento 4 X, barra della scala = 500 µm. (B) istogramma di distribuzione delle percentuali delle zona di PI rispetto all'area sezionale della sferoide (pannello di sinistra) e istogramma di distribuzione di area sezionale (pannello di destra), n = 84. Per cento della superficie di PI è calcolato al singolo elemento ad alta risoluzione per ognuna delle 84 sferoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: influenza della composizione di ECM sul processo di invasione della sferoide. Immagini BF di sferoidi HeLa 3day incorporato in una miscela di collagene 3 mg/mL e 20 µ g/mL HA (A) e collagene 3 mg/mL (C), a t = 0 h e dopo 50 h di incubazione (B) e (D), rispettivamente. Immagine ingrandimento 10 X, barra della scala = 200 µm. HMCA piastra di imaging è stato caricato sul palco del microscopio invertito dotato di incubatrice. Le immagini sono state acquisite ogni 5h e l'analisi cinetica è presentato nella trama (E), n = 99. Ogni curva rappresenta la media ± SD di aumento di zona di invasione nel corso del tempo, per HA (diamanti blu) e collagene e collagene solo (marrone piazze). Curva di regressione lineare medio e sua equazione e il valore R al quadrato sono indicati sopra le curve. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Fisetin inibisce l'invasione spontanea di HeLa sferoidi. Immagini BF di sferoidi di HeLa 3 giorno, incorporato in una miscela di collagene 3 mg/mL (A) a t = 0 e quindi, 24 h dopo l'aggiunta di 0 µM (B) e 10 µM Fisetin (C) al terreno di coltura completo. Immagine ingrandimento 4 X, barra della scala = 500 µm. analisi della zona di invasione per ogni sferoide al punto finale (t = 24 ore) è presentato in trama (D), n = 488. La curva rappresenta la media ± SD di zona di invasione in funzione di 0-40 µM Fisetin. Trattamento di fisetin inibisce significativamente l'invasione a 10 µM (P = 4,65 x 10-6), 20 µM (P = 0,0021) e 40 µM (P = 4.86 x 10-8), utilizzando il test t: due campioni assumendo uguale varianza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: NO induce l'invasione collettiva in sferoidi di cancro al seno MCF-7. Immagini BF 2 giornata MCF-7 del seno sferoidi cancro, incorporati nel collagene (A) a (t = 0) e (B) dopo l'esposizione di 20 h a 1 µM DETA/No. Sferoide ROI segmentazione è definito dal bordo rosso, sovrapposti e numerati in rosso su immagini BF A e B. ROIs definito dal bordo blu, sovrapposto su BF immagine B rappresentano sferoide dimensioni e la posizione a t = 0. Ingrandimento 4x, barra della scala = 500 µm. (C) A dispersione della correlazione tra distanza di migrazione e fattore di allungamento di sferoidi di cancro al seno individuale dopo l'esposizione a 1 µM DETA/n. (piazze marrone) come rispetto al controllo (diamanti blu) a t = 20 h, n = 54. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: analisi dell'immagine invasione spontanea delle cellule HeLa. Immagini BF di sferoidi HeLa di 3 giorni, 16 h dopo l'incorporamento in collagene (A). Ingrandimento 10 X. Zona di invasione della sferoide e disimpegnate cellule sono definite dal bordo rosso, dimensioni sferoide a t = 0 è definito dal bordo blu, invasione media distanza da sferoide centro di massa è indicata da frecce gialle e disimpegnate cellule sono indicate da frecce nere. Tracciare l'aumento nel tempo della distanza media invasione da sferoide centro di massa (B) e zona di invasione totale (C). Le curve rappresentano sferoide #1 (diamanti blu), sferoide #2 (marrone piazze), sferoide #3 (triangoli verdi) e sferoide #4 (viola Xs). (D) Bar grafico della conduttura (blu) e separati aumento di zona di invasione cellulare (marrone) nel corso del tempo. (E) istogramma di distribuzione del numero cumulativo di cellule separate a sferoide durante 20 h di processo di invasione, n = 126. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

È ben documentato che gli organismi viventi, caratterizzati dalla loro organizzazione pluricellulare 3D complessi sono abbastanza distinti dalle cellule comunemente usato monostrato 2D coltivata, sottolineando la necessità cruciale di utilizzare modelli cellulari che meglio imitano le funzioni e processi dell'organismo vivente per droga di screening. Recentemente, sferoidi multicellulari, colture organotipiche, organoids e organi-on-a-chip sono stati introdotti8 per l'uso nella scoperta della droga standardizzati. Tuttavia, grande complessità del modello 3D multicellulari compromette significativamente sua robustezza, parallelizzazione e analisi dei dati che sono cruciali per l'efficienza del test.

Valutazione quantitativa della capacità di invasione in genere misura il movimento delle cellule attraverso materiali idrogel. Al fine di misurare l'invasione del tumore usando micro-pozzetti tradizionali, grandi numeri delle cellule di cancro sono seminati in tondo piastre inferiori e costretto ad aggregare da centrifugazione21,22. Queste piastre limitare l'interazione cellula/sferoide in adiacenti pozzi, mentre il fondo rotondo ostruisce la qualità ottica e complica l'acquisizione di immagini. In altri metodi, singole celle in modo casuale incapsulati all'interno l'idrogel, crescere e funzionare in un ambiente 3D ma non necessariamente svilupparsi in sferoidi maturo23,24. Inoltre, procedure complicate per cella posizionamento all'interno di idrogel sono necessari, come cellula base di forza magnetica patterning25 o irradiazione del due-fotone laser di idrogeli bioattivi26.

La tecnologia basata su HMCA presentata qui si rivela vantaggiosa rispetto ai metodi di cui sopra: posizionamento, spontanea aggregazione di cella e creazione di sferoidi da poche cellule disperse può essere facilmente raggiunto, consentendo l'uso di prezioso cellulare limitato campione (ad es., cellule simil-staminali tumorali o cellule primarie derivate da campioni del paziente). Il sistema ha controllo sopra sia la natura delle cellule che compongono gli sferoidi così come sopra la loro esatta posizione spaziale durante gli esperimenti a lungo termine. Inoltre, il fondo piatto del MC facilita la generazione di numerose sferoidi sullo stesso piano focale, quindi è possibile, eliminando la necessità per complicato rapida acquisizione immagine e illuminazione di grandi aree tramite un microscopio a campo largo microscopia confocale che richiede tempo. Il sistema è facile da maneggiare e sua praticità fattibile. Applicando le procedure operative semplici, abbiamo raggiunto occupazione elevata delle popolazioni di sferoide in cui circa il 50% degli sferoidi hanno dimensioni comparabili e un'analisi attendibile delle capacità di invasione delle cellule tumorali. Inoltre, l'effetto delle droghe sulla capacità di invasione possa essere analizzato simultaneamente con i loro effetti citostatici e/o citotossici mediante approccio ad alto contenuto analisi insieme al dispositivo HMCA coltivata con numerose sferoidi. Inoltre, in HMCA, tutti gli elementi cellulari condividono lo stesso spazio e media, rendendo possibile indagare l'interazione spheroid prolate che solitamente è mediato via secreta da cellule citochine, chemochine, ormoni e l' ECM27. Questa diafonia facilita la sopravvivenza e la funzione di aggregati di cellule singole cellule piccole nel volume di macro-pozzo.

Un passo fondamentale nell'esecuzione del protocollo è l'aggiunta della miscela di ECM in cima sferoidi e convalidare la sua corretta polimerizzazione. Sferoidi non mostrerà il comportamento migratore anche se sono incorporati all'interno di ECM, a meno che l'Assemblea e cross-linking si verificano, e si formano fibre di collagene appropriato. Le fibre di collagene possono essere osservate dall'illuminazione di BF, e vi consigliamo di controllare la piastra sotto un microscopio per confermare la creazione delle fibre del collagene, alla fine di questa fase. Poiché il numero di sferoidi è dipendente dalla concentrazione iniziale delle cellule e la percentuale di occupati MCs, la matrice deve essere controllata dopo il caricamento iniziale delle cellule e se occupazione delle cellule non è ottimale, la risemina della stessa matrice può essere eseguita. Infatti, le dimensioni e la geometria di HMCA descritto nel presente documento sono stati progettati per ospitare aggregati di cellule relativamente piccole (fino a 150 µm di diametro). Questo potrebbe essere considerato una limitazione poiché progettare un nuovo tipo di matrice sarà necessario per l'analisi di migrazione delle cellule da grandi strutture cellulari.

La piattaforma corrente utilizza cellule minimal numero e volume di reagente piccolo, mentre allo stesso tempo fornire un campione di grandi dimensioni (migliaia di sferoidi per piastra). Al fine di analizzare diverse 12 composti per attività anti-metastatica, 2 piastre di HMCA basata 6 pozzetti singole sarebbe necessarie, producendo i risultati da circa 5.000 sferoidi, mentre sarebbero necessari almeno cinquanta piastre da 96 pozzetti per ottenere gli stessi risultati. La capacità di analizzare la migrazione alle risoluzioni di individuo-oggetto nel HMCA fornisce un elevato livello di robustezza statistica e precisione, consentendo lo studio dell'eterogeneità strutturale e funzionale di invasione in numerose sferoidi.

Questo studio dimostra in modo univoco l'invasione collettiva delle popolazioni di sferoide di cancro al seno dopo l'esposizione a DETA/No. I mazzi delle cellule delle cellule MCF7 mostrano fenotipo migratorio ameboide e cambiamenti quantitativi nella morfologia e posizione di ogni sferoide possono essere raggiunto automaticamente. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo sistema disposte che facilita il monitoraggio e l'analisi dell'invasione collettiva in numerose strutture 3D. Analizzando le direzioni relative e la distanza di invasione per ogni sferoide, è possibile studiare l'interazione reciproca tra sferoidi all'interno della popolazione. Inoltre, l'influenza stabilito dei fattori del microambiente extracellulare su cancro cella comportamento28 è illustrata qui. Tra questi fattori, la rigidità e la composizione del microambiente ha dimostrato di influenzare fortemente la migrazione cellulare. HMCA tecnologia fornisce un definito, biomimetici, piattaforma in vitro , in cui queste proprietà del ECM possono essere facilmente letta e controllate. La rigidità di puro collagene tipo I idrogel presso la concentrazione di 3 mg/mL, che è stato utilizzato in questo studio, è segnalato per essere circa 50-600 Pa29,30,31 e l'aggiunta di HA (20 µ g/mL; 0,4% in peso) non cambia la rigidità dell'idrogel di32,33significativamente. Così, l'effetto soppressivo di peso molecolare medio (MMW)-HA l'invasione del 3D HeLa sferoidi che è stata dimostrata qui non è a causa di cambiamenti di rigidezza. Questi risultati sono in accordo con studi precedenti che hanno mostrato un effetto bimodale di HA sull'invasione delle cellule di cancro con elevata dipendenza HA peso molecolare34,35,36,37.

Future applicazioni dei metodi sono fianco a fianco multi cella tipo coltura del tumore e cellule stromali in diverse regioni all'interno del macro-pozzetto e il recupero di sferoidi specifici per analisi molecolari a valle.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dal lascito di Moshe Shimon e Judith Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

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Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base
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Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

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