Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Summary

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Abstract

Metástase do cancro é conhecido por causar a 90% de letalidade do câncer. Metástase é um processo de várias fases que se inicia com a penetração/invasão de células tumorais no tecido vizinho. Assim, a invasão é um passo crucial na metástase, tornando a invasão processo de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimetastáticos, altamente significativo. Para atender a essa demanda, há uma necessidade de desenvolver modelos 3D em vitro que imitam a arquitetura de tumores sólidos e seu microambiente mais estreitamente para o vivo estado por um lado, mas ao mesmo tempo ser reprodutível, robusto e apropriado para alto rendimento e altas conteúdas medições. Atualmente, a maioria dos ensaios de invasão inclinar-se em tecnologias sofisticadas microfluidic adequados para pesquisa, mas não para triagem de drogas de alto volume. Outros ensaios usando dispositivos baseados em placa com esferoides individuais isolados em cada poço estão consumindo material e tem o tamanho de amostra baixa por condição. O objetivo do protocolo atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Desenvolvemos um modelo 3D para ensaio de invasão com base na placa da imagem latente de HMCA para a pesquisa de invasão do tumor e descoberta de drogas antimetastático. Este dispositivo permite a produção de numerosos esferoides uniformes por alvéolo (tamanho da amostra alta por condição) rodeado por componentes de ECM, enquanto continuamente e simultaneamente observar e medir os esferoides em resolução de elemento único para o meio seleção da produção de drogas antimetastáticas. Esta plataforma é aqui apresentada pela produção de esferoides HeLa e MCF7 para exemplificando unicelulares e invasão coletiva. Comparamos a influência do ácido hialurônico componente ECM (HA) sobre a capacidade invasiva de colágeno ao redor HeLa esferoides. Finalmente, não apresentamos Fisetin (inibidor de invasão) para HeLa esferoides e óxido nítrico () (ativador de invasão) para MCF7 esferoides. Os resultados são analisados pelo software interno que permite a análise semiautomático, simples e rápido, que facilita a análise multiparâmetro.

Introduction

Morte por cancro é atribuído principalmente à divulgação de células metastáticas para locais distantes. Muitos esforços no tratamento do câncer enfocam segmentação ou impedindo a formação de colônias metastáticas e progressão da doença metastática sistêmica¹. Migração de células de câncer é um passo crucial no processo de metástase de tumor, assim, a pesquisa de cascata de invasão de câncer é muito importante e um pré-requisito para encontrar terapêutica antimetastática.

O uso de modelos animais como ferramentas para estudar doença metastática foi encontrado para ser muito caro e não sempre representativa do tumor em seres humanos. Além disso, a topologia do microambiente extracelular, a mecânica e a composição afetam fortemente câncer célula comportamento². Desde que na vivo modelos inerentemente faltam de capacidade para separar e controlar tais parâmetros específicos que contribuem para a invasão do câncer e metástase, há uma necessidade de biomimetic controlável em vitro modelos.

Fim de metástase para órgãos distantes, as células cancerosas devem apresentar traços fenotípicos migratórios e invasivos que podem ser direcionados para a terapia. No entanto, desde que a maioria em vitro câncer de modelos não imitar as características reais de tumores sólidos³, é muito difícil de detectar fenótipos fisiologicamente relevantes. Além disso, a heterogeneidade fenotípica que existe dentro do tumor, dita a necessidade de analisar a migração do tumor em resolução de elemento único para descobrir terapias fenótipo-dirigido, por exemplo, pela segmentação da célula de metástase-iniciando população no tumores heterogêneos⁴.

O estudo da motilidade celular e migração coletiva é realizado principalmente em culturas de monocamadas de células epiteliais em superfícies planas homogêneas. Estes modelos de celulares convencionais para a migração de células de câncer são baseados sobre a análise da população de células individuais, invadindo através das membranas e ECM componentes⁵, mas em tais sistemas, as diferenças intrínsecas entre células individuais não podem ser estudou. Geração 3D esferoides através de andaimes ou em microestruturas de andaime-livre é considerado como um superior significa estudar o tumor de células crescimento e câncer invasão^6,7,8. No entanto, mais sistemas 3D não são adequados para formatos de alta produtividade e interação inter esferoide geralmente não pode ser alcançada desde esferoides individuais isolados são gerados em cada micropoço de⁹. Estudos recentes, envolvendo a migração de câncer são baseados em microfluidic dispositivos^3,10,11,12, no entanto, estas sofisticadas microfluidic ferramentas são difíceis de produzir e não pode ser usado para alto throughput screening (HTS) de drogas anti-invasivas.

Dois principais fenótipos, migração de células individuais e coletivas, que desempenham um papel nas células tumorais, superar a barreira de ECM e invadir tecidos vizinhos, tem sido demonstrada^13,14, cada exibindo distintas morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares e genéticos. Além disso, duas formas de migração células tumorais, como fibroblasto e ameboides, são observadas em cada fenótipo. Desde ambos, invasão fenótipos e modos de migração, principalmente são definidos pelas propriedades morfológicas, há uma necessidade para celular modelos essa detecção baseada em imagem de habilitar e exame de todas as formas de invasão do tumor e a migração de células.

O objectivo geral do método atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D em vitro baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Aqui, apresentamos a baseado no HMCA 6 imagem placa para a investigação de invasão do tumor e terapia antimetastática. A tecnologia permite a formação de um grande número de esferoides uniforme tumor 3D (450 por alvéolo) em uma estrutura de microcâmaras (MC) de hidrogel. Vários componentes de ECM são adicionados para a matriz de esferoide para permitir a invasão das células para o meio ambiente. Processo de invasão é continuamente monitorado pela observação de curto e longo prazo das células individuais de esferoides/invadir mesmo e facilita a caracterização morfológica, coloração fluorescente e recuperação de esferoides específicos em qualquer ponto. Desde numerosos esferoides compartilham o espaço e meio, interação através de moléculas solúveis esferoides individuais e seu impacto na outra é possível. Análise de imagem semiautomática é executada usando in-house código MATLAB que possibilita mais rápida e eficiente coleta de grande quantidade de dados. A plataforma facilita a medição exata, simultânea de numerosas células esferoides/invadindo de forma tempo-eficiente, permitindo o rastreio com throughput médio de drogas anti-invasão.

Protocol

1. HMCA placa de gravação

Nota: O processo completo para a concepção e fabricação de polidimetilsiloxano (PDMS) carimbo e placa de imagem HMCA, utilizados neste protocolo é descrito em detalhes em nossos artigos anteriores de^15,16. O carimbo PDMS (forma negativa) é usado para imprimir o HMCA (forma positiva), que consiste de cerca de 450 MCs por alvéolo (figura 1A). Conforme demonstrado na figura 1B, cada um dos MCs tem uma forma de uma pirâmide truncada de quadrada de cabeça para baixo (altura: 190 µm, pequena área de base: 90 µm x 90 µm e grande área de base: 370 µm x 370 µm). A placa do HMCA é usada para a preparação e cultivo de esferoides tumor 3D e, posteriormente, para o ensaio da invasão. Alternativamente, um selo comercial poderia ser usado para a produção de HMCA.

1. Prepare uma solução de 6% de agarose de derretimento baixo (LMA). Inserir a LMA pó e soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) em um frasco de vidro com um agitador magnético. Coloque a garrafa em um prato de aquecimento e agitar a solução durante o aquecimento a 80º C por algumas horas até que seja alcançada uma solução uniforme. Manter a solução a 70 ° C até o uso.
2. Pré-aquece o carimbo PDMS para 70 ° C no forno. Mantê-lo aquecido até o uso. Como alternativa, usar um carimbo comercial e siga as instruções.
3. Colocar as placas de comercial baixo vidro 6-poços em um banho seco, pre-aquecido a 75 ° C. Aguarde alguns minutos até que a placa esteja totalmente quente.
4. Despeje uma gota (400 µ l) de LMA pré-aquecido no fundo de cada um dos poços da placa de vidro. Coloque delicadamente o carimbo PDMS pré-aquecido durante a queda de agarose. Incube a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para pre-coagulação e pré-resfriamento. Incube a 4 ° C por 20 min alcançar a gelificação de agarose completo. Em seguida, delicadamente Retire o PDMS, deixando o gel de agarose estampado com MCs.
   Nota: Este passo é feito simultaneamente em todos os poços.
5. Colocar a placa em alto-relevo em um sistema equipado com lâmpada de ultravioleta (UV) de fotopolimerização e incube por 3 min.
   Nota: Agora a placa HMCA é UV esterilizado.
6. Preencha os macropoços com PBS estéril para garantir que eles são mantidos úmidos, em seguida, cobrem a placa, envolvê-la com parafilm e armazená-lo em 4 ° C até o uso.
7. Antes da utilização, vazios residuais de PBS da placa HMCA. Coloque a capota biológica.

2. carregar células e formação de esferoide

1. Coletar as células da seguinte forma: remover todas as médias de uma monocamada de células 10 cm placa de cultura, duas lavagens com 10 mL de PBS para descarte de resíduos de soro, adicionar 5 mL de tripsina (pré aquecida a 37 ° C) e incube por 3 min em incubação a 37 ° C. Em seguida, agite a placa suavemente para garantir destacamento monocamada, adicionar 10 mL de meio completo (pré aquecido a 37 ° C) e pipeta acima e para baixo até alcançar a suspensão homogênea de células. Centrifugar e lavar a suspensão de células com 15 mL de meio fresco, então, suspender em concentrações adequadas no meio fresco completa.
2. Delicadamente, carregar a suspensão de eritrócitos (50 µ l, 150 – 360 x 10³ células/mL, em média, 40 – ~ 16 células por MC) em cima do HMCA e permitir que as células a se contentar com 15 min pela gravidade.
3. Delicadamente adicione 6 – 8 alíquotas de meio fresco 500 µ l (total 3 – 4 mL) até a borda do plástico macropoço fundo fora do anel e hidrogel array.
4. Incube as células HeLa por 72 h e as células MCF7 por 48 h a 37 ° C e 5% CO_2, em um ambiente umidificado para a formação de esferoides.

3. viabilidade deteção pelo iodeto de Propidium (PI) de coloração

1. Prepare uma solução stock de PI (500 µ g de PI por 1 mL de PBS). Mantê-lo em 4 ° C por cerca de 6 meses. Recentemente, prepare uma diluição de 1:2,000 (0,25 µ g/mL), pela adição de 6 µ l de estoque para 12 mL de meio completo sem vermelho de fenol, para placa HMCA o 6 (2 mL por bem).
2. Transfira a placa HMCA com esferoides de 48-72 h, da incubadora biológica capota. Remova o HMCA médio todos apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel, deixar o tanque de matriz repleta de médio.
3. Delicadamente adicione 2 mL de diluição de PI de passo 3.1 para cada poço, apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo. Incube a placa HMCA para 1 h a 37 ° C e 5% CO₂, em um ambiente umidificado. Vá para a etapa 7.
   Nota: Outros corantes poderiam ser usados aqui, bem como, por exemplo, Hoechst para coloração do núcleo, diversos éster metílico (TMRM) para o potencial de membrana mitocondrial, coloração, diacetato de fluoresceína (FDA) para a deteção de células vivas, anexina V para apoptose detecção e outros.

4. preparação de mistura de colágeno

1. Prepare água bidestilada estéril (DDW), autoclave e um estoque de 100 mL de solução de filtro-esterilizados de NaOH 1 M. Manter os materiais em RT e as pontas, usadas para a preparação de mistura de colágeno congelada a-20 ° C, até o uso.
2. 10 – 20 min antes do uso, coloque qual todos incluindo: DDW estéril, 1 M NaOH solução estéril, estéril 10 x PBS, colágeno tipo I de rabo de rato (armazenadas a 4 ° C, por 3-meses) e um tubo estéril para o balde de gelo até totalmente refrigerado. Coloque o balde de gelo dentro do capô biológico.
3. Prepare-se 1.800 µ l da mistura de colágeno em uma concentração final de 3 mg/mL, para 6 HMCA invasão ensaio placa (300 µ l por alvéolo) como se segue. Adicionar o qual o tubo de refrigeração na seguinte ordem: 515 µ l de DDW, 24,8 µ l de 1 M de NaOH e 180 µ l de PBS 10x. Mistura bem pelo vórtice e lugar para o gelo. Finalmente, adicione 1080 µ l de colágeno à mistura, vórtice novamente e volte a colocar no gelo.

5. HA e preparação de mistura de colágeno

1. Dissolva 10 mg de HA em 2 mL de DDW estéril. Incube a mistura a RT por alguns minutos e vórtice suavemente até que o pó é totalmente dissolvido. Armazene a solução a 4 ° C por até dois anos.
2. Bem antes de usar, coloca a solução estoque HA no balde de gelo dentro do capô biológico.
3. Prepare um 3 mg/mL de mistura de colágeno conforme descrito na etapa 4. Adicione 36 µ g (7.2 µ l) de HA em 1.800 μL de pronto a usar mistura de colágeno, para uma concentração final de 20 µ g/mL. Então, vórtice novamente brevemente e colocar de volta no gelo.

6. ECM mistura adição

1. Transferir a placa do HMCA, com esferoides de 48-72 h, da incubadora ao subúrbio biológica e colocá-lo no gelo. Incube durante 10 minutos até que a placa é resfriada. Pré-aquecer uma solução de 1% LMA a 37 ° C em banho-maria.
2. Remova todos os meio ao redor do HMCA, apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel. Então, cuidadosamente, remova todos os meio do tanque de matriz com um ponta bem/gel carregando ponta, apoiando a ponta na borda da matriz, suavemente e lentamente sugando tudo meio fora.
   Nota: Depois de remover todos os meio ao redor da matriz de hidrogel, o tanque de matriz ainda está cheio de médio. Este meio tem que ser removido muito suavemente para evitar a destruição do hidrogel MC e luxação de esferoides.
3. Leve 150 µ l da mistura de colágeno ou mistura HA e de colágeno (mistura de ECM) com a ponta fina pre-congelada e adicionar no tanque de matriz, anexando a ponta para a borda da matriz. Libere a mistura lentamente para evitar luxação esferoide. Repita este passo com outra alíquota de 150 µ l, para um total de 300 µ-l por bem. Siga o mesmo procedimento para cada poço, até que todos os poços estão cheios. Em seguida coloque a placa na incubadora para 1 h para a gelificação completa de ECM.
4. Depois de alcançada a gelificação completa de ECM, pipete 400 µ l de pré-aquecido 1% LMA em cima do gel de ECM. Cubra o prato com a sua tampa, incube a placa na RT por 5 – 7 min e depois por 2 min a 4 ° C, para gelificação de agarose. Finalmente, suavemente adicione 2 mL de meio completo apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo.
   Nota: A camada de agarose impede o desprendimento da matriz do colágeno-gel do HMCA.

7. invasão ensaio aquisição e análise

1. Carga a placa HMCA sobre uma motorizada invertido palco microscópio equipado com uma incubadora, pré-ajustada para 37 ° C, 5% de CO₂ e atmosfera umidificada.
2. Pré-determinar as posições para aquisição de imagem em cada bem a fim de cobrir a área de matriz inteira e usam 10. X ou 4 X de objectivos (esta etapa é necessária para o software de aquisição de imagem usado aqui, consulte a Tabela de materiais abaixo para detalhes). Como alternativa, usar qualquer software de aquisição de imagem para facilitar a varredura automática de toda a área necessária, escolhendo o "Stich" opção.
3. Adquirir imagens de campo brilhante (BF) cada 2-4 h por um período total de 24-72 h para seguir a invasão das células do corpo esferoide em ECM circundante.
4. Adquira imagens fluorescentes para a deteção de PI, usando um cubo fluorescente dedicado (excitação filtro 530 – 550 nm, espelho dicroico 565 nm longa passagem e emissão de filtro 600-660 nm).
5. Exportar imagens BF/fluorescente lapso de tempo a partir do software de aquisição de imagem e salvá-los no formato de arquivo tagged-image (TIFF) para uma pasta usando a guia de "Banco de dados" na barra de ferramentas e, em seguida, no botão "Exportar arquivos de registro" .
   Nota: Nós desenvolvemos um código especial análise interna no software MATLAB que inclui uma interface de usuário gráfica projetada (GUI), no qual invasão análise poderia ser executado mais rápido e mais fácil. Neste código de análise, a segmentação da área de invasão e esferoides é feita semi-automaticamente usando filtro Sobel, seguido pelos operadores morfológicos erosão e dilatação. Após a segmentação automática das áreas, manuais correções foram feitas quando necessário para melhor precisão. Após a conclusão de segmentação, um conjunto de parâmetros foram automaticamente calculada pelo software e exportados para um arquivo do excel para manipulação adicional. A lista de parâmetros são: área seccional esferoide básica no tempo = 0, área de invasão de células conectadas ao corpo de esferoide = invasão principal, área de células separado da área de invasão principal, número de células separado da área de invasão principal, distância média de invasão do centro de massa do esferoide básica para a circunferência da área de invasão principal e células separadas e parâmetro de distância de invasão coletiva = d (d = √ ((X₂ -_X1)² + (Y₂ Y₁)²) do Coordenadas X e Y esferoide centro de massa, antes (X₁, Y₁) e depois (X₂, Y₂) processo de invasão coletiva). Alternativamente, a análise de imagem poderia ser feito com qualquer outro software especializado.
6. Abra o GUI e aperte o botão "Load BF" . Depois que a imagem é aberta, ajustar os parâmetros de segmentação (tamanho mínimo: > 1 e raio perto: > 1) para alcançar uma segmentação precisa do esferoide e sua área de invasão, em seguida, pressione o botão "Região de segmentação de interesse (ROI)" para execução e uma borda aparecerá ao redor de cada esferoide. Se a segmentação automática estiver incorreta, pressione o botão "Excluir" ou "Adicionar" e faça as correções solicitadas manualmente. Repita os mesmos passos para as imagens subsequentes.
7. Pressione o botão "Rastreamento" para o número de esferoides e o software irá atribuir o mesmo número para cada spheroid em cada uma das imagens de lapso de tempo. Em seguida, pressione o botão "Medição" , que irá gerar uma planilha com todos os parâmetros. Salve esta planilha como um arquivo do excel para uso no processamento de resultados e estatísticas no software excel.

Representative Results

O único HMCA placa de imagem é usado para o ensaio de invasão de esferoides tumor 3D. O ensaio inteiro, começando com a formação de esferoide e terminando com o processo de invasão e manipulações adicionais, é realizado dentro do mesmo prato. Para a formação de esferoide, as células HeLa são carregadas para a bacia de matriz e ambientar o hidrogel MCs pela gravidade. O hidrogel de MCs, que têm características de fixação não-aderente/low, facilitar a interação célula-célula e a formação de esferoides tumor 3D. Figura 2A ilustra as células que se estabeleceram em MCs, após o uso de 150 x 10³ células/mL solução de carregamento (i. e., ~ 16 células por MC calculado valor). É claro que a ocupação de células por MC não é uniformemente distribuída através da matriz, e a distribuição da média estatística obtidos é 14,78 células de ± 3.60 por MC. A tabela na Figura 2B resume a distribuição celular por MC para a placa inteira do HMCA. O coeficiente médio de variação (CV) da distribuição celular dentro de um macropoço é 43,33%, enquanto entre os macropoços é 24.37%. As diferenças na ocupação de célula são cruciais e ditam diretamente o tamanho de esferoides formados e sua homogeneidade em toda a placa. A fim de reduzir/minimizar a variabilidade criada pelo número de células por MC, a análise dos resultados é realizada em resolução de elemento único. As parcelas em Figura 2-D ilustram a distribuição do tamanho (área seccional) de esferoides de 3 dias. É claramente exemplificado na Figura 2D que calcula a proporção de crescimento de cada esferoide (área seccional no dia 3/dia 2) tem uma distribuição mais homogénea do que a distribuição de tamanho absoluto (Figura 2), rendendo um CV de 15,48% e 52,80%, respectivamente. Distribuição de diâmetro esferoide de esferoides 3 dias produz um CV de 24.52% e a taxa de crescimento (diâmetro no Dia3/dia2) é de 7,45%. Esses valores de CV são semelhantes a¹⁷ ou maior do que¹⁸ outros relatórios atingir célula de carga por gravidade. A fim de eliminar a variação do parâmetro medido resultando da variabilidade do número inicial célula semeado por MC, é preferível para normalizar os parâmetros selecionados para o número de células iniciais ou qualquer outro parâmetro medido do mesmo objeto, tais que cada esferoide tem seu controlo interno. Esta abordagem poderia ser facilmente aplicada pelo rastreamento o objeto sobre a placa de imagem HMCA.

O processo de formação de esferoide e crescimento poderia ser seguido facilmente o HMCA placa de imagem. Figura 3A-B mostra uma imagem BF de uma região a HMCA imagem placa contendo agregados de células HeLa 24h e a respectiva imagem de amadurecer, 5–dia multicelulares objetos 3D, que estão se tornando mais esférica e mais denso. Isso é claramente demonstrado que a maioria dos objetos conservam sua localização durante o período de incubação de 5 dias. A análise da forma (esfericidade) e tamanho (área seccional) durante a formação de esferoide é apresentada na Figura 3. O gráfico de dispersão demonstra os aumentos em ambos os parâmetros do dia 1 a dia 5; 0.544 u.a. ±0.020 0.684± 0,016 u.a. de esfericidade (p < 0,05) e 0.00356± 0,00013 mm² para 0.00538 ± 0,00015 mm² para a área de seção transversal (p < 0,05), respectivamente. Enquanto 24h agregados são pequenas e têm forma de não-regular, os respectivos esferoides 5 dias são maiores e adquirem a forma esférica.

A detecção de viabilidade celular de esferoide é executada por meio de baixa concentração de PI para coloração de¹⁹ que contorna a necessidade de lavagem do corante. PI penetra a membrana celular e em seguida, intercala no ADN das células não viáveis. A figura 4A mostra esferoides de HeLa 5 dias manchados com PI (em vermelho). Análise da percentagem de área vermelha (que representa as células mortas) fora de cada área seccional esferoide está resumida na Figura 4B. O histograma mostra que 85% da população de esferoide possui uma área de máximo valor de 5% vermelho manchado e a média é de 3,01 ± 2,34% (histograma à esquerda). Área seccional de esferoides (histograma direita) mostra uma distribuição normal com média de 0.02447 ± 0,00487 mm².

Depois de produzir esferoides de HeLa maduros 3 dias, o ensaio de invasão é executado dentro do HMCA placa de imagem. O efeito de variáveis, tais como composição de ECM, inibidores e ativadores, sobre o processo de invasão do tumor 3D esferoide poderia ser analisado. Para o desempenho do ensaio de invasão, o meio é suavemente removido e substituído com pipeta de solução de ECM, sobre os esferoides, na bacia de matriz do MC. Após a completa gelificação da solução de ECM, meio completo é adicionado para o macropoço. (1) a fim de examinar a influência da HA sobre o processo de invasão espontânea do esferoide de HeLa, os esferoides foram cobertos com HA mistura solução (Figura 5A) e colágeno e comparadas com as cobertas com solução única de colágeno (Figura 5), e BF imagens foram adquiridas depois de gelificação de ECM (t = 0 h). A cinética do processo de invasão foi seguida pelas mesmas regiões cada 5h de imagem por um período de 63 h. Após 50 horas de incubação, os esferoides incorporado em colágeno e HA (Figura 5B) mostrou baixa dispersão de célula para o ECM circundante em comparação com os esferoides incorporado em colágeno apenas (Figura 5). A análise da área de invasão cinética ao longo do tempo, para 99 esferoides em single-esferoide resolução está resumida na Figura 5E. Figura 5E parcelas da área de invasão de média/média ao longo do tempo dos dois grupos e demonstra claramente que a adição de HA de colágeno inibe a dispersão de células fora o spheroid, resultando em menores áreas de invasão. A média das encostas, resultante de curvas de ajuste de regressão linear para cada um dos esferoides incorporados em colágeno (0.001973 ± 0,000894 mm2/h) em comparação com colágeno e HA solução (0.001410 ± 0,000941 mm²/h) são significativamente diferentes (p = 0,003, teste-t: duas amostras com variâncias iguais). (2) a fim de examinar a influência de Fisetin (um flavonoide Bioativo encontrado em várias frutas e legumes que mostra atividades citostáticos e migrastatic, agindo sobre vários alvos moleculares, incluindo fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) / Akt/c-Jun N-terminal quinases (JNK) sinalização e sinalização de Wnt/β-catenina downregulates matriz metaloproteinases (MMPs) e outros²⁰) no processo de invasão espontânea de esferoide HeLa, aumento das concentrações da droga foram adicionado ao meio de completa e BF imagens foram adquiridas em t = 0 (figura 6A) e 24 h depois (Figura 6B-C). Como demonstrado, 10 µ m de Fisetin (Figura 6) inibe a dispersão de células em torno de esferoides em comparação aos não-tratados HeLa esferoides (Figura 6B). A análise de área de invasão de um experimento de resposta de dose (Figura 6) exibe inibição significativa em 10-40 µM de Fisetin (p < 0,003), atingir a saturação na concentração de 10 µM e superior. (3) mostrou que não, a um nível de nano-molar, contribui para um fenótipo de cancro da mama mais agressivo por estimulante tumor expansão e migração¹⁶. A fim de examinar a influência do n sobre o processo de invasão coletiva de esferoides MCF7 incorporado em colágeno, 1 µM de doador de óxido nítrico/dietilenotriamina (DETA/não) foi adicionado ao meio de cultura completo e BF imagens foram adquiridas em t = 0 e t = 20 h. dramático alterações na morfologia e locais de esferoides 3D durante a exposição para nenhum doador são evidentes (Figura 7A-B). Os esferoides perdem sua esfericidade e tornar-se mais alongadas adquirindo ameboide fenótipo migratório. Concomitantemente, maior translocação dos esferoides dentro da matriz de colágeno circundante foi observada (Figura 7). O valor de alongamento médio aumentado significativamente de 1.305 ± 0,193 u.a. para 1.477 ± 0,298 u.a., (p < 0,0006). A distância de migração médio medida para as mesmas esferoides foi significativamente estendida, 0.0788 ± 0,0575 mm e 0.3164 ± 0,3365 mm na ausência e na presença de DETA/não, respectivamente (p < 4 x 10^-6).

Análise de imagens da invasão esferoide foi alcançado pelo software MATLAB in-house semiautomático. As imagens de lapso de tempo adquirida de formação esferoide e invasão dentro do HMCA consiste de esferoides numerosas em uma imagem (4-6 esferoides na ampliação de 10x e esferoides de 25-30 em ampliação de 4x). A análise da formação de esferoide, crescimento e invasão foi realizada concomitantemente em todos os esferoides na imagem. Os principais parâmetros extraídos para invasão de esferoide são apresentados na Figura 8A, que mostra uma segmentação de imagem representativa de 4 esferoides num ponto único tempo (t = 16 h). A área de invasão principal definida por uma borda vermelha, bem como as células separadas que desengatado e dispersos em torno dela (indicado por setas pretas), foram rastreadas e numeradas para cada esferoide ao longo do tempo. Tamanho de esferoide antes da invasão em t = 0 é definida por uma borda azul. A distância média/média invasão da esferoide centro de massa da circunferência de área de invasão incluindo células separadas é calculada a partir da segmentação vermelha encircled e indicada por setas amarelas. Dados extraídos de experimento este lapso de tempo estão resumidos na Figura 8B-D. Figura 8B exibe a elevação da distância de cada centro de esferoide invasão média ao longo do tempo. A Figura 8 apresenta a elevação da área de invasão total em cada um dos esferoides ao longo do tempo (incluindo a área de invasão principal e área separada/desengatado-célula). Figura 8 _1-4 mostra a magnitude da área de células separados em comparação com a área de invasão total de cada esferoide (ao longo do tempo). O número cumulativo de células desprendidas é 33, 7, 4 e 5 para esferoides #1, #2, #3 e #4, respectivamente. A análise dos números cumulativos de células desprendidas de mais de 20 h de invasão obtido de 126 HeLa esferoides incorporado em colágeno é mostrada na Figura 8E. Aqui está demonstrado que existe uma vasta distribuição do número de células desprendidas na população examinada e o valor médio é de 12,3 ± 12,8 células.

Figura 1: The HMCA placa de imagem. Imagem do (A) de uma macrobem gravado com HMCA. (B) uma seção transversal de um MC dentro do HMCA placa de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: homogeneidade da célula distribuição e esferoide crescimento relação na placa de imagem HMCA. (A) uma superposição de BF e imagens fluorescentes do HMCA carregado com as células HeLa pre-manchadas com Hoechst 33342 1 µ g/mL (concentração 150 x 10³ células por mL de carga). Imagens foram adquiridas logo após o assentamento de célula na ampliação da imagem MC. 4 X, barra de escala = 500 µm. (B), a tabela resume a distribuição das células HeLa dentro da placa de imagem HMCA-6-bem. As células foram contadas até 90 MC/macropoço. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (SD), CV (SD/mean100) é calculado dentro e entre os macropoços. (C) histograma de distribuição da área seccional de esferoides de 3 dia, n = 418, determinado a partir de imagens BF. (D) histograma de distribuição da taxa de crescimento de esferoide (área seccional no dia 3/dia 2). Taxa de crescimento é calculada em resolução de elemento único para cada um das 418 esferoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: formação de esferoide no HMCA placa de imagem de rastreamento. Imagem BF de células HeLa (concentração de 120 x 10³ células por mL de carga) incubada no HMCA para 1 dia (A) e (B) de 5 dias. Imagem de ampliação 4 X, barra de escala = 500 μm. (C) Scatter lote de esfericidade do objeto 3D em função de sua área secional, depois de 1 dia (diamantes azuis) e 5 dias (quadrados marrons) de carregamento de célula de post de incubação. Cada marcador representa os dados analisados a partir de um único esferoide, n = 83. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: deteção de viabilidade celular em maduras esferoides. Uma superposição de BF e imagens fluorescentes de esferoides dia 5 (concentração de 360 x 10³ células por mL de carga) corados com PI 0,25 µ g/mL (A). Imagem de ampliação 4 X, barra de escala = 500 µm. (B) histograma de distribuição por cento da área de PI em relação à área seccional do spheroid (painel esquerdo) e histograma de distribuição de área seccional (painel direito), n = 84. Por cento da área de PI é calculado em resolução de elemento único para cada um dos 84 esferoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: influência da composição de ECM no processo de invasão de esferoide. Imagens BF de esferoides de HeLa dia 3 incorporado em uma mistura de colágeno de 3 mg/mL e 20 µ g/mL HA (A) e o colágeno de 3 mg/mL (C), em t = 0 h e após 50 h de incubação (B) e (D), respectivamente. Ampliação 10 X, barra de escala da imagem = 200 µm. A placa de imagem HMCA foi carregado para o palco do microscópio invertido equipado com incubadora. Imagens foram adquiridas todas as 5h e a análise cinética é apresentada no enredo (E), n = 99. Cada curva representa a média ± DP de aumento da área de invasão ao longo do tempo, colágeno e HA (diamantes azuis) e colágeno só (quadrados marrons). Curva de regressão linear média e sua equação e o valor de R-quadrado são indicados acima as curvas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Fisetin inibe a invasão espontânea de HeLa esferoides. Imagens BF de esferoides de HeLa dia 3, incorporado em uma mistura de colágeno de 3 mg/mL (A) em t = 0 e, em seguida, 24 horas após a adição de 0 µM (B) e 10 µM Fisetin (C) para o meio de cultura completo. Imagem de ampliação 4 X, barra de escala = 500 µm. análise da área de invasão para cada esferoide no ponto final (t = 24 h) é apresentado no enredo (D), n = 488. A curva representa a média ± SD da área de invasão como uma função de 0-40 µM Fisetin. Tratamento de Fisetin inibe significativamente a invasão em 10 µM (P = 4,65 x 10^-6), 20 µM (P = 0,0021) e 40 µM (P = 4.86 x 10^-8), usando o teste-t: duas amostras com variâncias iguais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: não induz a invasão coletiva em esferoides de câncer de mama MCF-7. BF imagens de 2 dia MCF-7 seios esferoides de câncer, incorporados em colágeno (A) em (t = 0) e (B) após a exposição de 20 h a 1 µM DETA/não. Segmentação de ROI esferoide é definida por uma borda vermelha, sobreposta e numerada em vermelho no BF imagens A e B. ROIs definido pela borda azul, sobreposta ao BF imagem B representam esferoide tamanho e localização em t = 0. Ampliação de 4x, barra de escala = 500 µm. (C) A dispersão da correlação entre a distância de migração e fator de alongamento de esferoides de câncer de mama individuais mediante a exposição a 1 µM DETA/sem (quadrados marrons) como em relação ao controle (diamantes azuis) em t = 20 h, n = 54. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: análise de imagem de invasão espontânea de célula HeLa. Imagens BF de esferoides de HeLa dia 3, 16h após incorporação de colágeno (A). Ampliação de 10 X. Área de invasão de esferoide e desacopladas células são definidas pela borda vermelha, tamanho de esferoide em t = 0 é definido pela borda azul, invasão de média distância do esferoide centro de massa é indicada pelas setas amarelas e desacopladas células são indicadas por setas pretas. Sinopse o aumento ao longo do tempo, da distância média de invasão da esferoide centro de massa (B) e (C) da área de invasão total. As curvas representam esferoide #1 (diamantes azuis), esferoide #2 (quadrados marrons), esferoide #3 (triângulos verdes) e esferoide #4 (roxo Xs). (D) barra gráfico dos principais (azul) e separados ao longo do tempo o aumento da área invasão celular (marrom). (E) histograma de distribuição do número cumulativo de células separadas por esferoide durante 20 h do processo de invasão, n = 126. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Está bem documentado que os organismos vivos, caracterizados por sua complexa organização multicelular 3D são bastante distintos das células comumente usados monocamada 2D cultivada, enfatizando a necessidade crucial de usar modelos de celulares que melhor imitam as funções e triagem de processos do organismo vivo para drogas. Recentemente, multicelulares esferoides, culturas de organotypic, organoids e órgãos-em-um-microplaqueta foram introduzidos⁸ para o uso na descoberta de medicamentos padronizados. No entanto, grande complexidade do modelo 3D multicelulares significativamente põe em risco sua robustez, paralelização e análise de dados que são cruciais para a eficiência do ensaio.

Avaliação quantitativa da capacidade de invasão geralmente mede o movimento de células através de materiais de hidrogel. Para medir a invasão de tumor usando placas de microbem tradicionais, um grande número de células de câncer é semeado em redondo fundo placas e forçado para agregar por centrifugação^21,22. Estas placas restringem interação célula/esferoide em adjacentes poços, enquanto o fundo redondo obstrua a qualidade óptica e complica a aquisição de imagens. Em outros métodos, células individuais aleatoriamente encapsulado dentro o hidrogel, crescer e funcionar em um ambiente 3D mas não necessariamente se tornar maduro esferoides^23,24. Além disso, os procedimentos complicados para celular posicionamento dentro de hidrogel são necessários, como célula baseada em força magnética padronização²⁵ ou irradiação do laser de dois fotões de hidrogel bioativos²⁶.

A tecnologia baseada em HMCA apresentada revela-se vantajoso sobre os métodos acima: célula agregação espontânea, posicionamento e criação de esferoides de poucas células dispersas pode ser facilmente alcançada, permitindo o uso de valioso celular limitada amostra (ex., células estaminais câncer ou células primárias derivado de espécimes do pacientes). O sistema controla tanto a respeito da natureza das células que compõem os esferoides, bem como sobre sua exata localização espacial durante experimentos de longo prazo. Além disso, o fundo plano do MC facilita a geração de esferoides numerosos no mesmo plano focal, daí a rápida aquisição de imagem e iluminação de grandes áreas através de um microscópio de campo largo é possível, eliminando a necessidade para o complicado microscopia confocal demorada. O sistema é fácil de segurar e sua praticidade viável. Aplicando procedimentos operacionais simples, atingimos alta ocupação das populações de esferoide em que aproximadamente 50% dos esferoides tem tamanho comparável e uma análise confiável de capacidade de invasão de células de câncer. Além disso, o efeito das drogas sobre a capacidade de invasão pode ser analisado simultaneamente com os seus efeitos citostáticos ou citotóxicos por meio de abordagem de análise de alto teor em conjunto com dispositivo HMCA cultivada com numerosos esferoides. Além disso, o HMCA, todos os elementos celulares compartilham o mesmo espaço e médio, tornando possível investigar a interação de esferoide-esferoide que geralmente é mediada via célula-secretadas citocinas, quimiocinas, hormônios e o ECM²⁷. Esta cruz-conversa facilita a sobrevivência e a função de aglomerados de células células individuais/pequenos no volume de macrobem.

Um passo fundamental na execução do protocolo é a adição da mistura de ECM em cima os esferoides e validar sua polimerização adequada. Os esferoides não mostrará comportamento migratório, mesmo se eles são incorporados dentro de ECM, a menos que o assembly e cross-linking ocorrem, e fibras colágenas apropriado são formadas. As fibras de colágeno podem ser observadas pela iluminação de BF, e aconselhamos verificar a placa sob um microscópio para confirmar a criação das fibras de colágeno no final desta fase. Desde que o número de esferoides é dependente na concentração inicial de células e a porcentagem de ocupados MCs, a matriz deve ser verificada após o carregamento da pilha inicial e se a ocupação de célula não é o ideal, re-semeadura da mesma matriz pode ser realizada. Na verdade, o tamanho e a geometria do HMCA aqui descrito foram projetados para acomodar clusters de células relativamente pequenas (até 150 µm de diâmetro). Isso pode ser considerado uma limitação desde projetar um novo tipo de matriz será necessário para a análise de migração celular de maiores estruturas celulares.

A plataforma atual utiliza o número mínimo e volume de reagente pequeno, enquanto ao mesmo tempo proporcionando um tamanho de amostra grande (milhares de esferoides por placa). A fim de analisar 12 diferentes compostos para atividade antimetastático, 2 placas HMCA com base 6-bem simples seria necessárias, produzindo os resultados de cerca de 5.000 esferoides, enquanto pelo menos cinquenta placas de 96 poços seriam necessários para alcançar os mesmos resultados. A capacidade de analisar a migração no indivíduo-objeto de resolução no HMCA fornece um alto nível de robustez estatística e precisão, permitindo o estudo da heterogeneidade estrutural e funcional de invasão em numerosos esferoides.

Este estudo demonstra com exclusividade a invasão coletiva das populações de esferoide de câncer de mama após a exposição a DETA/n º. Os clusters de células de células MCF7 mostram fenótipo migratório ameboide e quantitativas alterações na morfologia e localização de cada esferoide podem ser alcançadas automaticamente. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro sistema de matriz que facilita o monitoramento e análise da invasão coletiva em numerosas estruturas 3D. Analisando os sentidos relativos e a distância de invasão para cada esferoide, é possível estudar a interação mútua entre esferoides no seio da população. Além disso, a influência estabelecida dos fatores do microambiente extracelular sobre câncer célula comportamento²⁸ é ilustrada aqui. Entre estes factores, a rigidez e a composição do microambiente mostrou influenciar fortemente a migração celular. HMCA tecnologia fornece um definido, biomimético, plataforma em vitro , em que essas propriedades de ECM podem ser facilmente acessadas e controladas. A rigidez de puro colágeno tipo I hidrogel na concentração de 3 mg/mL, que foi utilizado neste estudo, é relatado para ser aproximadamente 50-600 Pa^29,30,31 e a adição de HA (20 µ g/mL; 0,4% em peso) não muda a rigidez do hidrogel significativamente^32,33. Assim, o efeito supressivo de médio peso molecular (MMW)-HA por causa da invasão de 3D HeLa esferoides que foi demonstrada aqui não é devido a alterações de rigidez. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que mostraram um efeito bimodal de HA na invasão de células de câncer com alta dependência do peso molecular HA^34,35,36,de³⁷.

Futuras aplicações dos métodos incluem ao lado multi célula tipo cultivo do tumor e as células do estroma em diferentes regiões dentro do macropoço e a recuperação de esferoides específicos para análise molecular a jusante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics