Summary
HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.
Abstract
암 전이 암 치의 90% 원인으로 알려져 있다. 전이 인접 조직으로 종양 세포의 침투/침공과는 다단계 프로세스입니다. 따라서, 침략 전이, 매우 중요 한 침공 과정 연구와 반대로 전이성 약물의 개발을 하는 중요 한 단계입니다. 이 수요를 해결 하기 위해 단단한 종양의 구조를 모방 하는 3 차원 생체 외에서 모델을 개발할 필요가 있다 그리고 vivo에서 상태 한 손으로, 하지만 동시에 가장 밀접 하 게 그들의 microenvironment 재현, 강력 하 고 적합 고수익 고 높은 콘텐츠 측정입니다. 현재, 대부분 침공 분석 적절 한 정교한 미세 기술을 의지할 연구 하지만 대량 약물 검사. 각 잘에서 격리 된 개별 spheroids와 플레이트 기반 장치를 사용 하 여 다른 분석 실험 자료 소모 고 조건 당 낮은 샘플 크기. 현재 프로토콜의 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 우리는 종양 침입과 반대로 전이성 신약의 연구에 대 한 HMCA 이미징 플레이트에 따라 침입 분석 결과 대 한 3D 모델을 개발 했다. 이 장치는 지속적으로 하 고 동시에 관찰 하 고 측정 하는 매체에 대 한 단일 요소 해상도에서 spheroids 동안 ECM 구성 요소에 의해 포위 잘 (조건 당 높은 샘플 크기) 당 수많은 균일 한 spheroids의 생산 수 있습니다. 반대로 전이성 약물의 처리량 심사입니다. 이 플랫폼 여기 헬러와 MCF7 예증 단일 셀 및 집단의 침략에 대 한 spheroids의 생산에 의해 제공 됩니다. 우리는 헬러 spheroids 주위의 콜라겐의 침략 적 용량에 ECM 성분 히 알루 론 산 (HA)의 영향을 비교 합니다. 마지막으로, 우리 소개 Fisetin (침공 억제제) 헬러 spheroids 및 산화 질소 (NO) (침공 활성 제) MCF7 spheroids. 결과 다중 매개 변수 검사를 용이 하 게 하는 반자동, 간단 하 고 빠른 분석을 가능 하 게 사내 소프트웨어에 의해 분석 된다.
Introduction
암 사망은 먼 위치에 전이성 세포의 보급에 주로 기인 합니다. 암 치료에 많은 노력 대상 또는 전이성 식민지의 형성과 조직의 전이성 질환1의 진행 방지에 초점. 암 세포 마이그레이션 종양 전이 과정에서 중요 한 단계 이다, 따라서, 암 침입 캐스케이드의 연구는 매우 중요 하 고 필수 안티 전이성 치료제를 찾는 데는.
전이성 질환 연구 도구로 동물 모델의 사용은 매우 비싼 고 하지 항상 인간의 종양의 대표적인 발견 되었습니다. 또한, 세포 외 microenvironment 토폴로지, 역학 및 구성 강하게 영향을 암 세포 행동2. Vivo에서 모델은 본질적으로 분리 및 암 내 습 및 전이에 공헌 하는 같은 특정 매개 변수를 제어 하는 능력 부족, 이후 제어 생체 모방 체 외에서 모델에 대 한 필요가 있다.
먼 장기에 전이 하기 위해서는 암 세포 치료에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 철새와 침략 phenotypic 특성 전시 한다. 그러나, 때문에 대부분의 시험관에 암 모델 고체 종양3의 실제 기능을 모방 하지 않는, 순수 관련 고기 감지 하 매우 도전 이다. 또한, 종양, 내 존재 하는 phenotypic이 지시 형 감독 요법, 예를 들어, 전이 시작 셀을 대상으로 검색 하려면 단일 요소 해상도 종양 마이그레이션 분석 필요 다른 유형의 종양4내의 인구입니다.
세포 운동 성 및 집단의 연구는 주로 균질 평면 표면에 상피 세포의 단층 문화에서 실시 됩니다. 암 세포 마이그레이션에 대 한 이러한 기존의 셀룰러 모델 막과 ECM의 구성 요소5를 통해 침입 하는 개별 셀의 인구 분석을 기반으로 하지만 이러한 시스템에서 개별 셀 사이의 본질적인 차이점 수 없습니다. 공부. 건설 기계를 통해 또는 비 계 없는 마이크로 구조에서 우수한 종양 연구 수단으로 간주 됩니다 생성 3D spheroids 세포 성장과 암 침공6,,78. 그러나, 가장 3D 시스템은 높은 처리량 형식에 적합 하 고 격리 된 개별 spheroids 각 마이크로 잘9에서 생성 되므로 간 회전 타원 체 상호 작용 달성 일반적으로 수 없습니다. 그러나 암 마이그레이션 관련 된 최근 연구는 미세 장치3,10,,1112에 근거 하,, 이러한 정교한 미세 도구 생산 하기 어려운 고 수 없습니다. 반 침략 적 약물의 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량에 사용할 수 있습니다.
두 가지 주요 고기, 집단 및 개별 셀 마이그레이션, ECM 장벽을 극복 하는 종양 세포에서 역할을 하 고 주변 조직 침입 되어 시연된13,14, 각 고유 표시 형태학 특성, 생화학, 분자 및 유전적 메커니즘입니다. 또한, 두 가지 형태의 마이그레이션 종양 세포, 섬유 아 세포와 같은 및 amoeboid, 각 표현 형에서 관찰 된다. 둘 다, 이후 침공 고기 및 마이그레이션 모드, 주로 형태학 속성에 의해 정의 됩니다, 그리고 휴대에 대 한 필요 모델 그 사용 영상 기반 탐지와 종양 내 습 및 마이그레이션 모든 형태의 시험 세포.
현재 방법의 전반적인 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 체 외에서 세포 기반 시스템을 제공 하는입니다. 여기, 종양 침입과 반대로 전이성 치료의 연구에 대 한 HMCA 기반 6-잘 이미징 플레이트를 소개합니다. 기술은 균일 한 3D 종양 spheroids (우물 당 450) 히드로 마이크로-챔버 (MC) 구조에서 다 수의 형성 수 있습니다. 다양 한 ECM 구성 요소는 주변 환경에 셀의 침공 수 있도록 회전 타원 체 배열에 추가 됩니다. 침공 과정 같은 개별 spheroids/침입 세포의 단기 및 장기 관찰에 의해 지속적으로 모니터링 하 고 형태학 상 특성, 형광 얼룩이 지 고 언제 든 지 특정 spheroids의 검색을 용이 하 게. 수많은 spheroids 공유 공간과 매체, 개별 spheroids와 그들의 영향을 서로 사이 용 해 분자를 통해 상호 작용 가능 하다. 자동 이미지 분석은 많은 양의 데이터 빠르고 효율적 컬렉션을 가능 하 게 사내 MATLAB 코드를 사용 하 여 수행 됩니다. 플랫폼 안티 침공 마약의 중간 처리량 심사 허용 시간 효율적인 방식으로 수많은 spheroids/침입 셀의 정확한, 동시 측정을 쉽게 합니다.
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Protocol
1. HMCA 플레이트 엠보싱
참고: 완전 한 프로세스 설계 및 제조입니다 (PDMS) 스탬프 및 HMCA 이미징 플레이트가이 프로토콜에 사용에 대 한 우리의 이전 기사15,16에 자세하게 설명 되어 있습니다. PDMS 스탬프 (부정적인 모양)는 잘 (그림 1A) 당 약 450 MCs를 이루어져 있는 HMCA (긍정적인 모양)을 돋을새김 하는 데 사용 됩니다. 그림 1B에서처럼 MCs의 마다 잘린된 거꾸로 사각형 모양의 피라미드의 모양 (높이: 190 µ m, 작은 기본 영역: 90 µ m x 90 µ m, 그리고 큰 기본 영역: 370 µ m x 370 µ m). HMCA 판 준비 및 3D 종양 spheroids의 배양과 그 후, 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 또는, 상업 스탬프 HMCA 생산 사용 될 수 있습니다.
- 6% 낮은 녹는 agarose (LMA)의 솔루션을 준비 합니다. LMA 분말 및 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) PBS의 10 mL 당 LMA (0.6 g) 유리 병에는 자력으로 삽입 합니다. 난방 접시에 병을 배치 하 고 균일 한 솔루션 달성 될 때까지 몇 시간 동안 80 ° C에가 열 하는 동안 솔루션을 저 어. 70 ° C에서 솔루션을 계속 사용까지.
- 미리 70 ° c 오븐에서 PDMS 스탬프 열. 그것은 따뜻한까지 계속 사용. 또는 상업 스탬프 사용 하 고 지시를 따르십시오.
- 미리 75 ° c가 열 건조 목욕 상업 6 잘 유리 하단 플레이트 위에 접시는 완전히 따뜻한 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
- 접시에 우물의 각자의 유리 하단에 미리가 열된 LMA (400 µ L) 한 방울을 붓는 다. 부드럽게 agarose 드롭 사전 온수 PDMS 스탬프 장소. 중 고 및 사전 냉각에 대 한 5-10 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어. 전체 agarose 겔 화를 달성 하기 위해 20 분에 4 ° C에서 품 어. 그런 다음, 부드럽게 mcs 꽃무늬 agarose 젤 떠나 PDMS를 벗기십시오.
참고:이 단계는 동시에 모든 웰 스에서 수행 됩니다. - 자외선 (UV) 램프를 장착 하는 시스템을 치료 하는 빛에 양각된 접시를 놓고 3 분 동안 품 어.
참고: 지금 HMCA 플레이트는 UV 살 균입니다. - 되도록 그들은 습 한, 지켜진다 다음 접시 커버, parafilm 포장 사용까지 4 ° C에서 저장 살 균 PBS로 매크로 웰 스를 채우십시오.
- 사용 하기 전에 빈 HMCA 접시에서 PBS 오차. 생물 학적 후드에 배치.
2. 로드 셀 및 회전 타원 체 형성
- 다음과 같이 셀을 수집: 10 cm 문화 접시 셀 단층에서 모든 매체를 제거, 혈 청 오차의 처리, 트립 신 (37 ° C에 미리 예 열)의 5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 3 분 동안 품 어에 PBS의 10 mL로 두 번 씻어 그런 다음 접시 단층 분리, 동종 세포 현 탁 액 달성 될 때까지 완전 한 매체 (37 ° C에 미리 예 열)와 여기저기 피 펫의 10 mL를 추가를 부드럽게 흔들어. 원심 신선한 매체의 15 mL로 세포 현 탁 액을 씻어 그리고, 신선한 완전 한 매체에 적절 한 농도에서 일시 중단.
- 부드럽게 로드 셀 서 스 펜 션 (50 µ L, 매체, 103 셀/mL x 150-360 ~ 16-40 MC 당 세포)는 HMCA의 위에 허용 15 분 동안 중력에 의해 침전 하는 세포.
- 부드럽게 외부 링과 히드로 배열 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 500 µ L 신선한 매체 (총 3-4 mL)의 6-8 aliquots를 추가 합니다.
- 72 h에 대 한 HeLa 세포와 spheroids의 대형을 위한 습도 분위기에서 37 ° C, 5% CO2, 48 h에 대 한 MCF7 세포를 품 어.
3. 생존 Propidium 요오드 화물 (PI) 얼룩에 의해 검출
- PI의 재고 솔루션을 준비 (500 µ g PI의 PBS의 1 mL 당). 4 ° C에서 약 6 개월 동안 그것을 유지. 갓 6 잘 HMCA 플레이트 (2 mL 잘 당)에 대 한 페 놀 레드, 없이 완전 한 매체의 12 mL 재고의 6 µ L의 추가 의해 1:2,000 (0.25 µ g/mL), 희석을 준비 합니다.
- 생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 합니다. 팁 끝 히드로 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 기대 여는 HMCA에서 모든 매체를 제거, 매체 가득한 배열 탱크를 떠나.
- 부드럽게 PI 희석의 2 mL 단계 3.1에서 각 잘 하 여 추가 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 합니다. 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 1 h HMCA 접시를 품 어. 7 단계로 계속.
참고: 다른 염료 사용할 수 여기 뿐만 아니라, 예: 핵 얼룩에 Hoechst 얼룩, fluorescein diacetate (FDA) 라이브 셀 검출, apoptosis Annexin V에 대 한 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대 한 tetramethylrhodamine 메 틸 에스테 르 (TMRM) 탐지 그리고 다른 사람입니다.
4. 콜라겐 혼합물 준비
- 압력솥과 1m NaOH 필터 살 균 솔루션의 100 mL의 주식에 의해 살 균 두 배 증류수 (DDW)을 준비 합니다. RT, 그리고 사용까지-20 ° C에서 냉동 콜라겐 혼합 준비를 위해 사용 하는 팁에 있는 자료를 유지 한다.
- 사용 하기 전에 10-20 분 배치 등 모든 intergrades: 살 균 DDW, 1 M NaOH 살 균 솔루션, 메 마른 10 PBS, x 나 완전히 냉각 될 때까지 얼음 양동이에 쥐 꼬리 (3-개월 동안 4 ℃에서 저장)와 무 균 튜브에서 콜라겐을 입력. 생물 학적 후드 안에 얼음 양동이 놓습니다.
- 다음과 같이 6 잘 HMCA 침공 분석 결과 플레이트 (잘 당 300 µ L) 1800 µ L 3 mg/mL의 최종 농도에 콜라겐 혼합물의 준비. 다음 순서에 따라 냉각된 튜브에 intergrades를 추가: DDW, 1 M NaOH의 24.8 µ L와 10 x PBS의 180 µ L의 515 µ L. 얼음에 다시 소용돌이 및 장소에 의해 잘 믹스. 마지막으로, 혼합물, 다시 소용돌이에 콜라겐의 1080 µ L을 추가 하 고 다시 얼음에 넣어.
5. 하 고 콜라겐 혼합물 준비
- 2 ml의 멸 균 DDW HA의 10 mg을 디졸브. 품 어 RT에서 혼합 몇 분 및 소용돌이 부드럽게 가루 완전히 녹아 때까지. 최대 2 년 동안 4 ° C에서 재고 솔루션을 저장 합니다.
- 바로 사용 하기 전에 생물 후드 안에 얼음 양동이에 하 재고 솔루션을 놓습니다.
- 준비 3 mg/mL 콜라겐 혼합 4 단계에에서 설명 된 대로. 20 µ g/mL의 최종 농도 대 한 콜라겐 혼합물을 사용할 준비가의 1800 μ로 하의 36 µ g (7.2 µ L)를 추가 합니다. 다음, 다시 짧게 소용돌이 그리고 다시 얼음에 넣어.
6. ECM 혼합물 추가
- 생물 학적 후드에 인큐베이터에서 48-72 h spheroids와 HMCA 접시를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 접시는 냉각 될 때까지 10 분 동안 품 어. 예약에 1%의 솔루션 열 물 욕조에 37 ° C에 LMA.
- 하이드로 겔 배열 옆에 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 HMCA, 주위에서 모든 매체를 제거 합니다. 다음, 매우 신중 하 게, 모든 매체에서에서 제거 배열 탱크 좋은 팁/젤 팁 끝 배열 가장자리, 부드럽게 그리고 천천히 빨 아 밖으로 모든 매체에 기대 여 팁, 로드 합니다.
참고: 히드로 배열 주위에서 모든 매체를 제거 후 배열 탱크 여전히 채워집니다 매체. 이 매체는 히드로 MC의 파괴와 spheroids의 전위를 방지 하기 위해 매우 부드럽게 제거할 수 있다. - 좋은 팁을 미리 냉동 하 고 콜라겐 혼합 (ECM 혼합물) 또는 콜라겐 혼합물의 150 µ L 고 배열 가장자리 끝을 연결 하 여 배열 탱크에 추가. 천천히 회전 타원 체 전위를 피하려고 혼합물을 놓습니다. 잘 당 총 300 µ L에 대 한 150 µ L의 다른 약 수와 함께이 단계를 반복 합니다. 모든 우물 가득 때까지 각 잘 동일한 절차를 따릅니다. 다음 ECM의 전체 겔 화에 대 한 1 시간을 위한 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- ECM의 완전 겔 화 달성 된 후에 미리 데워 진된 1%의 400 µ L 플라스틱 ECM 젤 위에 LMA. 커버는 뚜껑 접시, 접시 RT에 5-7 분 후 agarose 겔 화에 대 한 4 ° C에서 2 분 동안 품 어. 마지막으로, 부드럽게 매크로 잘 플라스틱 바닥의 가장자리에 팁 끝을 기대 하 여 완전 한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고: agarose 레이어는 HMCA에서 콜라겐 젤 매트릭스의 분리를 방지합니다.
7. 침입 분석 결과 수집 및 분석
- 부하는 동력에 HMCA 플레이트 장착 인큐베이터, 37 ° C, 5% CO2 와 습도 분위기를 미리 조정 된 현미경 단계 반전.
- 미리 각 이미지 수집을 위한 위치 전체 배열 영역을 커버 하기 위하여 잘 하 고 10 배 또는 4 X 목표를 사용 하 여 결정 (이 단계는 여기에 사용 되는 이미지 수집 소프트웨어에 대 한 필요, 자세한 내용은 아래의 재료 표 참조). 또는 어떤 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 선택 하 여 전체 필요 면적의 자동 검색을 용이 하 게 하는 "Stich" 옵션.
- 취득 밝은 필드 (BF) 이미지 마다 2-4 h 총 24-72 h 동안 주변 ECM에 셀의 침공 회전 타원 체 몸에서 따라 하기.
- (여기 필터 530-550 nm, dichroic 거울 565 nm 긴 패스와 방출 필터 600-660 nm) 전용된 형광 큐브를 사용 하 여 PI 검출을 위한 형광 이미지를 취득 합니다.
- 이미지 수집 소프트웨어에서 시간 경과 BF/형광 이미지를 내보내고 전용된 폴더를 도구 모음 및 다음 "레코드 파일 내보내기" 버튼의 "데이터베이스" 탭을 사용 하 여 태그 이미지 파일 형식 (TIFF)에 저장.
참고: 우리는 침략에 분석 실행 될 수 있습니다 빠르고 쉽게 디자인 된 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 하는 MATLAB 소프트웨어에서 특별 한 사내 분석 코드를 개발 했다. 이 분석 코드에서는 spheroids 및 내 습 지역 세분화 반자동 형태학 연산자 침식과 팽창 뒤 소블 필터를 사용 하 여 이루어집니다. 자동 분할 영역의 후 정확도 높이기 위해 필요한 수동 수정 되었다. 분할 완료 후 매개 변수 집합이 자동으로 소프트웨어에 의해 계산 되었고 추가 조작에 대 한 excel 파일에 수출. 매개 변수 목록이: 시간에 기본 회전 타원 체 단면적 = 0, 회전 타원 체 몸에 연결 된 셀의 침공 지역 = 주요 내 습 지역, 지역, 주요 내 습 지역에서 분리 된 셀의 셀의 수의 평균 거리, 주요 내 습 지역에서 분리 주요 내 습 지역 및 분리 된 세포 집단 침공 거리 매개 변수의 둘레에는 기본 회전 타원 체의 질량 중심에서에서 침략 = d (d = √ (2 -1X) (X2 + (Y2 -Y1)2)의 밖으로 X와 Y 회전 타원 체의 질량 중심 좌표, 전에 (X1, Y1) 후 (X2, Y2) 집단 침공 과정). 또는, 이미지 분석은 다른 전문된 소프트웨어와 함께 할 수 있었다. - GUI를 열고 "BF 로드" 버튼을 밀어 합니다. 이미지를 연 후 분할 매개 변수를 조정 (최소 크기: > 1과 반경 닫습니다: > 1) 회전 타원 체 및 그것의 내 습의 정확한 세분화를 위해 다음, 실행에 대 한 "관심 (ROI) 세분화의 영역" 단추를 눌러 및 테두리는 각 회전 타원 체 주위에 표시 됩니다. 자동 분할 올바르지 않으면, "삭제" 또는 "추가" 버튼을 누르고 수동으로 요청한 수정. 다음 이미지에 대 한 동일한 단계를 반복 합니다.
- 번호는 spheroids "추적" 버튼 누르고 소프트웨어 시간 경과 이미지의 각 각 회전 타원 체에 대 한 동일한 번호를 할당 합니다. 그런 다음 모든 매개 변수와 함께 스프레드시트 생성 됩니다 "측정" 버튼을 누릅니다. 결과 처리에 사용 하 고 excel 소프트웨어에서 통계에 대 한 excel 파일로이 스프레드시트를 저장 합니다.
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Representative Results
영상 판 독특한 HMCA 3D 종양 spheroids의 침공 분석 결과 대 한 사용 됩니다. 전체 분석 결과, 회전 타원 체 형성으로 시작 하 고 침공 과정과 추가 조작으로 끝나는 같은 접시에 내에서 수행 됩니다. 회전 타원 체 형성에 대 한 HeLa 세포 배열 분 지에 로드 되 고 중력에 의해 히드로 MCs에 정착. 하이드로 겔 부착/저 첨부 파일 특성 있는 MCs 세포 세포 상호 작용 및 3D 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다. 그림 2A 에서는 150 x 103 셀/mL 로드 솔루션의 사용에 따라 MCs에 정착 하는 셀 (즉., MC 당 ~ 16 셀 값 계산). 그것은 분명 MC 당 셀 인 배열을, 균등 하 게 배포 되지 및 평균 취득된 통계 분포는 MC 당 14.78 ± 3.60 셀. 그림 2b에서 테이블 전체 HMCA 접시 MC 당 셀 배포 요약 되어 있습니다. 매크로 잘 내 세포 분포의 편차 (CV)의 평균 계수는 43.33% 매크로 웰 스 사이 그것은 24.37%. 셀 인 차이 중요 한 고 spheroids 형성 및 접시에 걸쳐 그들의 동질성의 크기를 직접 지시. 감소/엠씨 당 셀의 수에 의해 만들어진 변화 최소화, 결과의 분석은 단일 요소 해상도에서 수행 됩니다. 그림 2C-D 플롯 3-하루 spheroids의 크기 (단면적) 배포를 보여 줍니다. 그것은 명확 하 게 각 회전 타원 체 (하루 3/day 2 단면적)의 성장 비율을 계산 하는 것이 이력서 15.48% 및 52.80%의 저조한 절대 크기 분포 (그림 2C), 보다 더 균질 분포는 그림 2d exemplified 각각. 3-하루 spheroids의 회전 타원 체 직경 분포 산출 24.52%의 이력서 그리고 성장 비율 (지름 day3/day2) 7.45%. 이러한 CV 값은 비슷합니다-17 또는18 다른 보고 중력에 의해 로드 달성 셀 보다 더 높은. MC 당 초기 시드 휴대폰 번호의 변화에서 결과 측정된 매개 변수 편차를 제거 하기 위해 그것은 초기 휴대폰 번호 또는 동일한 개체의 다른 측정된 매개 변수로 선택한 매개 변수를 정규화 하는 것이 좋습니다 같은 각 회전 타원 체는 그것의 내부 제어. 이 접근은 HMCA 이미징 접시에는 개체를 추적 하 여 쉽게 적용할 수 있습니다.
회전 타원 체 형성 및 성장 과정 HMCA 이미징 플레이트에 쉽게 지켜질 수 있습니다. 그림 3A-B 표시 한 영역의 BF 이미지는 HMCA에 이미징 접시 24 h 헬러 셀 집계를 포함 하 고 해당 이미지의 성숙, 5-일 3D 다세포 개체를 더 구형이 고 밀도가 되고있다. 대부분의 개체는 5 일 잠복기 동안 그들의 위치 유지 명확 하 게 표시 됩니다. 모양 (구형) 및 회전 타원 체 형성 동안 크기 (단면적)의 분석은 그림 3C에서 제공 됩니다. 점도 5; 데 하루 1에서에서 두 매개 변수에서 증가 보여 줍니다. 0.684± 구형 (p < 0.05)에 대 한 0.016 거리 및 0.00356± 0.544 ±0.020 거리 0.00013 m m2 0.00538 ± 0.00015 m m2 단면적 (p < 0.05), 각각. 24 h 집계 작은 고 비정규 모양, 각각 5 일 spheroids 큰 하 고 둥근 형태를 확보.
회전 타원 체 세포 생존 능력의 감지 염료 세척에 대 한 필요를 circumvents19 얼룩에 대 한 낮은 농도 PI를 사용 하 여 실행 됩니다. PI는 세포 막 관통 하 고 비-가능한 세포의 DNA로 intercalates. 그림 4A 5 일 헬러 spheroids (레드)에 PI로 얼룩진 보여줍니다. 각 회전 타원 체 단면적에서 붉은 영역 (죽은 세포를 대표 하는) 비율의 분석은 그림 4B에서 요약 됩니다. 히스토그램 표시는 회전 타원 체 인구의 85%는 최대한 가치의 5% 레드 스테인드 지역 이며 평균 3.01 ± 2.34% (왼쪽된 히스토그램). Spheroids (오른쪽 히스토그램)의 단면적 0.02447 ± 0.00487 m m2의 평균을 가진 정규 분포를 보여 줍니다.
3 일 성숙한 헬러 spheroids 생산, 후 침공 분석 결과 접시 이미징 HMCA 내에서 수행 됩니다. 3D 종양 회전 타원 체 침략 과정에서 ECM 구성, 저 해제 및 활성, 같은 변수의 효과 시험 될 수 있었다. 침공 분석 결과 성능에 대 한 매체는 부드럽게 제거 하 고 MC 배열 분 지에는 spheroids를 통해 ECM 솔루션 피 펫으로 바뀝니다. ECM 솔루션의 전체 겔 화 후 완전 한 매체 매크로-우물에 추가 됩니다. (1) 헬러 회전 타원 체 자발적인 침공 과정에서 하의 영향을 검사 하기 위하여는 spheroids 콜라겐과 하 혼합 솔루션 (그림 5A)로 덮여 있었고 덮여 콜라겐 유일한 해결책 (그림 5C), 그에 비해 고 BF 이미지 ECM 겔 화 후 바로 취득 되었다 (t = 0 h). 침공 과정의 운동 같은 지역 마다 5 h 63 h의 기간에 대 한 이미징에 선행 되었다. 외피의 50 시간 후는 spheroids 콜라겐에 포함 하 고 HA (그림 5B) 콜라겐만 (그림 5D)에 포함 된 spheroids에 비해 주변 ECM으로 낮은 셀 분산을 보여주었다. 단일 회전 타원 체 해상도 99 spheroids에 대 한 시간이 지남에 키네틱 침공 영역의 분석은 그림 5E에 요약 됩니다. 그림 5E 동안 두 그룹의 평균/평균 침공 영역을 플롯 하 고 명확 하 게 보여주는 콜라겐 HA의 추가 회전 타원 체의 셀 분산 억제 작은 내 습 지역에서 발생. 콜라겐와 HA 솔루션 (0.001410 ± 0.000941 mm2/h) 콜라겐 (0.001973 ± 0.000894 m m2/h)에 포함 된 spheroids의 각각에 대 한 선형 회귀 조정 곡선에서 결과의 평균을 크게는 다른 (p = 0.003, t-검정: 2 표본 등분산 가정). (2) Fisetin의 영향을 검사 하기 위해 (생리 flavonoid 여러 과일과 야채 phosphatidylinositol 3-키 (PI3K)를 포함 한 여러 분자 표적 행동에 의해 cytostatic migrastatic 활동을 보여주는 발견/Akt/c-6 월 N-terminal kinases (설립) 신호 및 Wnt/β-catenin 신호 downregulates 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 등20) 헬러 회전 타원 체 자발적인 침공 과정, 약물의 농도가 증가 완전 한 매체에 추가 하 고 BF 이미지 t 인수 했다 = 0 (그림 6A) 및 24 시간 후 (그림 6B-C). 같이, 10 µ M Fisetin (그림 6 c)의 치료 비 헬러 spheroids (그림 6B)에 비해 spheroids 주위 세포의 분산을 억제. 복용량 응답 실험 (그림 6D)의 내 습 지역 분석 전시 중요 한 10 ~ 40 µ M에서의 저해 Fisetin (p < 0.003), 10 µ M의 그리고 높은 농도에서 채도 달성. (3) 그것은 보였다 그 아니, 나노-모 랄 수준에 기여 더 적극적인 유 방 암 형 자극 종양 확장 및 마이그레이션16. MCF7 spheroids 콜라겐, diethylenetriamine/질소 산화물 기증자의 1 µ M에에서 포함 된 집단 침공 과정에 영향을 시험 하기 위하여 (만/NO) 추가 되었다 완전 한 문화 매체 및 BF 이미지 t 인수 했다 = 0, t = 20 h. 연극 형태학에 아무 기증자에 게 노출 하는 동안 3D spheroids의 위치 변화는 분명 (그림 7A-B). spheroids 그들의 구형을 잃게 되 고 amoeboid 철새 형 인수 길쭉한 더 된다. 수반, 주변의 콜라겐 매트릭스 내에서 spheroids의 향상 된 전 좌 (그림 ℃) 관찰 되었다. 1.477 ± 0.298 거리, (p < 0.0006) 1.305 ± 0.193 거리에서에서 크게 증가 하는 평균 신장 값입니다. 같은 spheroids에 대 한 측정 된 평균 이동 거리 크게 확장 되었다, 0.0788 ± 0.0575 m m와 0.3164 ± 0.3365 mm만 / 아니의 존재와 부재에 각각 (p < 4 x 10-6).
회전 타원 체의 이미지 분석 반자동 사내 MATLAB 소프트웨어에 의해 달성 되었다. 하나의 이미지 (10 배 확대 및 4 배 확대에서 25-30 spheroids spheroids 4-6)에 수많은 spheroids 회전 타원 체 형성과 HMCA에서 침공의 획득된 시간 경과 이미지에 의하여 이루어져 있다. 회전 타원 체 형성, 성장 및 침략의 분석 수반 이미지에서 모든 spheroids에서 수행 되었다. 회전 타원 체 침략에 대 한 추출 키 매개 변수는 그림 8A를 한 번에 4 spheroids의 대표 이미지 세분화를 보여주는 제시 (t = 16 h). 빨간색 테두리가 분리 된 세포를 회피 (검은 화살표 표시) 주위 분산, 추적 그리고 시간이 지남에 따라 각 회전 타원 체에 대 한 번호에 의해 정의 된 주요 내 습 지역. T에 침공 하기 전에 회전 타원 체 크기 = 0 파란색 테두리에 의해 정의 됩니다. 분리 된 세포를 포함 하 여 침공 영역 둘레에 회전 타원 체의 질량 중심에서에서 의미/평균 침공 거리 원된 빨간 세분화에서 계산 하 고 노란색 화살표로 표시 된. 그림 8B-D시간 경과 실험에서 추출 된 데이터는 요약. 그림 8B 시간이 지남에 따라 각 회전 타원 체 센터에서 평균 침공 거리의 해발 고도 전시 한다. 그림 8C 전시 시간 (를 포함 하 여 주요 내 습 지역 및 구분/버너-셀 영역)에 spheroids의 각 총 내 습 지역 상승 한다. 그림 8D 1-4 (시간) 동안 각 회전 타원 체의 총 내 습 지역에 비해 분리 된 셀 영역의 크기를 보여 줍니다. 버너 셀의 누적 수는 각각 spheroids #1, #2, #3, #4, 5, 4, 7, 33. 이상 20 h 126 헬러 spheroids에서 얻은 침공의 콜라겐에 포함 된 버너 셀의 누적 숫자의 분석 그림 8E에 표시 됩니다. 그것은 시험된 인구에 버너 셀의 수에는 광대 한 분포 이며 평균 값은 12.3 ± 12.8 셀 여기 시연 이다.
그림 1: 이미징 격판덮개는 HMCA. (A)의 한 매크로-HMCA와 양각 이미지. (B) 이미징 접시 HMCA 내 한 MC의 횡단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: HMCA 이미징 플레이트에에서 셀 유통 및 회전 타원 체 성장 비율의. (A) BF의 오버레이 및 로드 미리 Hoechst 33342 1 µ g/mL (mL 당 농도 150 x 103 셀 로드)로 얼룩진 HeLa 세포와 HMCA의 형광 이미지. 이미지 X, 눈금 막대 MC. 이미지 확대 4에서에서 셀 합의 직후 인수 했다 = 500 µ m. (B) 테이블 HMCA-6-잘 이미징 배지 내의 HeLa 세포의 분포를 요약 한 것입니다. 셀 최대 90 명 철/매크로-우물에서 계산 했다. 결과 ± 표준 편차 (SD), 이력서 (SD/mean100) 내에서 계산 하는 것을 의미 하 고 매크로 웰 스 사이 표시 됩니다. (C) 3 일 spheroids, n의 단면적의 배포 히스토그램 = 418, BF 이미지에서 결정. (D) 회전 타원 체 성장 비율 (단면적 일 3/2 일에)의 배포 히스토그램. 성장 비율은 각각 418 spheroids의 단일 요소 해상도에서 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 회전 타원 체 형성 판 이미지 HMCA에 추적. BF 이미지 HeLa 세포 (mL 당 농도 120 x 103 셀 로드)의 1 일 (A)과 5 일 (B) HMCA에서 인 큐베이 팅. 이미지 배율 눈금 막대 X 4 = 500 μ m. (C) 분산형 플롯의 단면적, 1 일 (블루 다이아몬드) 후와 인큐베이션 게시물 셀 로드의 5 일 (갈색 사각형)의 기능으로 3D 개체 구형. 각 마커는 단일 회전 타원 체, n에서 분석 된 데이터를 나타냅니다 83 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 성숙 spheroids에서 세포 생존 능력의 탐지. BF의 오버레이 및 5 일 spheroids (mL 당 농도 360 x 103 셀 로드)의 형광 이미지 PI와 스테인드 0.25 µ g/mL (A). 이미지 배율 눈금 막대 X 4 = 500 µ m. (B) 회전 타원 체 (왼쪽된 패널)의 단면적을 기준으로 PI 영역의 %의 분포 히스토그램 및 배포 히스토그램 단면적 (오른쪽 패널)의 n = 84. PI의 %는 84 spheroids의 각 단일 요소 해상도에서 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 회전 타원 체 침략 과정에서 ECM 구성의 영향. 3 일간 헬러 spheroids의 BF 이미지 3 mg/mL 콜라겐과 20 µ g/mL의 혼합물에 포함 하 (A) 및 3 mg/mL 콜라겐 (C), t = 0 h 전후 50 h 인큐베이션 (B)의 (D), 각각. 배율 10 배, 스케일 바 이미지 = 200 µ m. HMCA 플레이트 이미징 인큐베이터를 갖춘 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 로드 되었습니다. 이미지 마다 5 h 인수 했다 고 운동 분석은 플롯 (E), n = 99. 각 곡선은 시간, 콜라겐과 HA (블루 다이아몬드)와 콜라겐만 (갈색 사각형)에 대 한 침공 지역 증가의 평균 ±를 SD를 나타냅니다. 평균 선형 회귀 곡선 방정식 및 R-제곱 값은 곡선 위에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Fisetin 억제 헬러 spheroids의 자발적인 침공. 3 일간 헬러 spheroids의 BF 이미지 3 mg/mL 콜라겐 (A) t의 혼합물에 포함 된 0 µ M (B)의 추가 후에 0 그리고, 24 h = 10 µ m Fisetin (C) 완전 한 문화 매체를. 이미지 배율 4 배, 스케일 바 = 500 µ m. 끝점에서 각 회전 타원 체에 대 한 침입 영역의 분석 (t = 24 h) 플롯 (D)에 n = 488. 곡선 0-40 µ M의 기능으로 침입 영역의 평균 ± SD 나타냅니다 Fisetin. Fisetin 치료는 크게 10 µ M에서 침공을 억제 (P = 10-6x 4.65), 20 µ M (P = 0.0021) 40 µ m (P = 10-8x 4.86), t-검정을 사용 하 여: 등분산 가정 두 표본. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 아니오 MCF-7 유 방 암 spheroids 집단 침공을 유도 한다. 2 일 MCF 7의 BF 이미지에 암 spheroids, 콜라겐 (A)에 포함 된 유 (t = 0)와 (B) 1 개의 µ M만 20 h 노출 후/아니요 회전 타원 체 ROI 세분화 빨간색 테두리에 의해 정의 된 중첩 및 BF 이미지 A와 B. ROIs 파란색 테두리, BF 이미지 B 대표 회전 타원 체 크기와 t에 위치에 중첩에 의해 정의 된에 빨간색 번호 = 0. 4 배 확대, 눈금 막대 = 500 µ m. (C) A 점도 1 µ m만 노출 시 개별 유 방 암 spheroids의 신장 요인 및 마이그레이션 거리 사이 상호 관계의 아무 (갈색 사각형)로 제어 (블루 다이아몬드)에 비해/t = 20 h, n = 54. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 헬러 세포 자발적인 침공 이미지 분석. 3 일간 헬러 spheroids, 콜라겐 (A)에 포함 한 후 16 h의 BF 이미지. 배율 10 배. 회전 타원 체 내 습 지역 및 버너 셀 빨간색 테두리, t에서 회전 타원 체 크기에 의해 정의 됩니다 = 0 파란색 테두리에 의해 정의 됩니다, 회전 타원 체의 질량 중심에서에서 의미 침공 거리 노란색 화살표로 표시 됩니다 및 버너 셀 검은색 화살표로 표시 됩니다. 플롯 회전 타원 체의 질량 중심 (B)와 (C) 총 내 습 지역에서 평균 침공 거리의 시간이 지남에 따라 증가 합니다. 곡선 회전 타원 체 #1 (블루 다이아몬드), 회전 타원 체 #2 (갈색 사각형), 회전 타원 체 #3 (녹색 삼각형) 및 회전 타원 체 #4 (퍼플 Xs)를 나타냅니다. (D) 메인 (파란색)의 차트를 막대 및 셀 (브라운) 시간이 지남에 내 습 지역 증가 분리. (E) 침공 과정, n의 20 h 동안 회전 타원 체 당 분리 된 세포의 누적 숫자의 분포 히스토그램 = 126. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 잘 문서화 살아있는 유기 체, 그들의 복잡 한 3D 다세포 조직이 특징으로하는 꽤 다른 일반적으로 사용 되 2 차원 단층 배양 세포, 더 나은 기능을 모방 하는 휴대 전화 모델을 사용 하는 중요 한 필요를 강조 그리고 마약에 대 한 생명체의 프로세스 심사. 최근, 다세포 spheroids, organotypic, organoids 문화와 장기 온 칩 도입된8 표준화 된 약물 발견에 사용 되었습니다. 그러나, 3D 다세포 모델의 위대한 복잡성 크게 그것의 견고성, 병렬화 및 분석 결과 효율성에 대 한 중요 한 데이터 분석을 위태롭게.
침공 용량의 정량적 인 평가 일반적으로 히드로 자료를 통해 세포의 움직임을 측정합니다. 전통적인 마이크로-잘 접시를 사용 하 여 종양 침입을 측정, 암 세포의 큰 숫자는 하단 플레이트 라운드에서 시드 고 강제로 원심21,22에 의해 집계 하. 이 접시 둥근 바닥 광학 품질을 방해 하는 동안 이미지 수집을 복잡 하 게 인접 하는 웰 스에 셀/회전 타원 체 상호 작용을 제한 합니다. 다른 방법에서 개별 셀 무작위로 캡슐화는 히드로, 성장 및 3D 환경에서 작동 하지만 반드시 성숙 spheroids23,24에 개발 하지 마십시오. 또한, 셀 하이드로 겔 내에서 위치에 대 한 복잡 한 절차는 자력 기반 셀 패턴25 또는 생리 hydrogels26의 2 광자 레이저 조사 필요 합니다.
여기에 소개 하는 HMCA 기반 기술 위의 방법에 비해 유리한 것을 입증 한다: 세포 위치, 자연 집계 및 몇 가지 분산 된 세포에서 spheroids의 창조 달성 될 수 있다 쉽게, 귀중 한 제한 휴대 사용 하도록 설정 하면 샘플 (예., 암 줄기 같은 셀 또는 1 차 셀 환자 표본에서 파생). 시스템 장기 실험 하는 동안 제어는 spheroids를 구성 하는 셀의 두는 성격 뿐만 아니라 정확한 공간 위치에 있다. 또한, MC의 편평한 바닥 같은 초점 계획에 수많은 spheroids의 생성을 용이 하 게, 따라서 넓은 필드 현미경을 통해 큰 분야의 급속 한 조명 및 이미지 수집 가능, 복잡 한에 대 한 필요성을 제거 시간이 걸리는 confocal 현미경 검사 법. 시스템 핸들 및 그것의 실용성 실현 하기 쉽습니다. 단순한 운영 절차를 적용 하 여 우리는 spheroids의 대략 50% 대 등 한 크기를가지고 있는 회전 타원 체 인구의 높은 점령 및 암 세포 침공 용량에 대 한 신뢰할 수 있는 분석 달성. 또한, 침공 용량에 약물의 효과 분석할 수 있습니다 동시에 그들의 cytostatic 또는 세포 독성 효과 함께 수많은 spheroids를 경작 하는 HMCA 장치 함께 하이 콘텐츠 분석 방법을 사용 하 여. 또한, HMCA에서 모든 세포 요소 같은 공간과 매체, 회전 타원 체-회전 타원 체 상호 작용은 일반적으로 세포 분 비 cytokines, 발산, 호르몬 및 ECM27를 통해 중재를 조사 수를 공유 합니다. 이 잡담 생존과 매크로 잘 볼륨에서 개별 셀/작은 셀 클러스터의 기능을 촉진 한다.
프로토콜의 실행에 중요 한 단계는 spheroids와 그것의 적당 한 중 합을 확인 ECM 혼합물의 추가 이다. spheroids 어셈블리와 cross-linking 발생, 그리고 적절 한 콜라겐 섬유 형성 하지 않는 한 그들은 ECM, 내 포함 된 경우에 철새 행동을 표시 되지 않습니다. 콜라겐 섬유 BF 조명에 의해 관찰 될 수 있다 그리고이 단계의 끝에서 콜라겐 섬유의 생성을 확인 하는 현미경 아래 접시를 확인 하는 것이 좋습니다. Spheroids의 수 이므로 초기 세포 농도의 비율에 따라 MCs, 배열, 초기 셀 후 확인 하 여야 한다 및 점령 셀 인 최적의 없으면 다시 같은 배열의 시드 수행할 수 있습니다. 실제로, 크기와 형상을 여기서 설명 하는 HMCA의 상대적으로 작은 세포 클러스터 (최대 150 µ m 직경에서)에 맞게 설계 되었습니다. 이후 새로운 유형의 배열 설계 큰 셀 구조에서 셀 마이그레이션 분석에 필요한 것이 제한 간주 될 수 있습니다.
현재 플랫폼 최소한의 휴대폰 번호와 큰 샘플 크기 (접시 당 spheroids의 수천)를 제공 하는 동시에 작은 시 볼륨을 사용 합니다. 반대로 전이성 활동 12 다른 화합물을 분석 하기 위해 2 단일 6 잘 HMCA 기반 접시 적어도 50 96 잘 접시 동일한 결과 달성 하는 데 필요한 것 하는 동안 약 5000 spheroids에서 결과 생성 하는 데 필요한 것입니다. 개인 개체 해상도 HMCA에서 마이그레이션 분석 기능 통계 견고성 및 정확도, 수많은 spheroids이 질 구조 및 기능 침공의 연구 활성화의 높은 수준을 제공 합니다.
이 연구는 만/번호를 노출 시 유 방 암 회전 타원 체 인구 집단 침공에 고유 하 게 보여 줍니다. MCF7 셀의 셀 클러스터 표시 amoeboid 철새 형, 그리고 양적 변화는 형태학 및 각 회전 타원 체의 위치에 자동으로 달성 될 수 있다. 우리의 지식 최선을 다 해 모니터링 및 분석 집단의 수많은 3D 구조에서 첫 번째 기준점과 시스템입니다. 분석 함으로써 상대적 방향 및 각 회전 타원 체에 대 한 침공 거리, 인구 내의 spheroids 사이 상호 상호 작용 연구 가능 하다. 또한, 암 세포 행동28 에 extracellular microenvironment 요인의 설립된 영향은 여기 나와 있습니다. 이러한 요인 들 중 강성과는 microenvironment의 구성 강하게 셀 마이그레이션에 영향을 보여줘 왔다. HMCA 기술은 정의 biomimetic를 플랫폼 체 외에 있는 ECM의 이러한 속성 수 있습니다 쉽게 액세스 하 고 제어를 제공 합니다. 순수 콜라겐의 강성 유형 I에 하이드로 겔이이 연구에 사용 된 3 mg/mL의 농도 약 50-600 Pa29,,3031 보고 및 HA (20 µ g/mL, 0.4 wt %)의 추가 변경 되지 않았다 히드로의 강성 크게32,33. 따라서, 중간 분자량 (MMW)의 진압 효과-하 시연 했다 3D 헬러 spheroids의 침공에 여기 아니다 강성 변경. 이러한 결과 높은 의존 하 분자량34,35,,3637와 함께 암 세포 침공에 HA의 모달 효과 보여준 이전 연구와.
방법의 미래 응용 프로그램 나란히 멀티 셀 유형 종양 및 매크로-글쎄, 내 다른 지역에서 stromal 세포 및 다운스트림 분자 분석에 대 한 특정 spheroids의 검색의 경작을 포함 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 쉐 시몬과 주 디스 Weisbrodt의 유 증에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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