En HMCA-baserat imaging tallrik presenteras för invasionen analysens prestanda. Denna platta underlättar bildningen av tredimensionella (3D) tumör spheroids och mätning av cancer cell invasion in i extracellulär matrix (ECM). Invasion assay kvantifiering uppnås genom semi-automatisk analys.
Cancer metastaser är kända för att orsaka 90% av cancer dödlighet. Metastaser är en flerstegs process som initierar med penetration/invasionen av tumörceller i närliggande vävnad. Således, invasion är ett avgörande steg i metastaser, att göra invasion process forskning och utveckling av anti metastaserande droger, mycket betydelsefullt. För att möta denna efterfrågan, det finns ett behov av att utveckla 3D i vitro modeller som imiterar arkitekturen av solida tumörer och deras närmiljön närmast till i vivo stat å ena sidan, men samtidigt vara reproducerbara, robust och passar hög avkastning och hög innehåll mätningar. För närvarande, de flesta invasion analyser luta på sofistikerade mikroflödessystem tekniker som är lämpliga för forskning men inte för hög volym drogkontroll. Andra analyser som använder plattan-baserade enheter med isolerade enskilda spheroids i varje brunn är materialet konsumerar och har låg provstorlek per tillstånd. Syftet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Vi utvecklat en 3D-modell för invasionen analys baserat på HMCA imaging plate för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande läkemedelsutveckling. Denna enhet möjliggör produktion av talrika enhetliga spheroids per brunn (höga provstorlek per skick) omgiven av ECM komponenter, medan kontinuerligt och samtidigt att observera och mäta spheroids enda element upplösning för medium Throughput screening av anti metastaserande droger. Denna plattform presenteras här genom uppvisande av HeLa och MCF7 spheroids för exemplifierar enskild cell och kollektiva invasion. Vi jämför påverkan av ECM komponent hyaluronsyra (HA) av kollagen som omger HeLa spheroids invasiv förmåga. Slutligen, vi introducerar Fisetin (invasion-hämmare) till HeLa spheroids och kväveoxid (NO) (invasion aktivare) till MCF7 spheroids. Resultaten analyseras av interna programvara som möjliggör halvautomatiska, enkel och snabb analys vilket underlättar multi-parameter undersökning.
Cancerdöd tillskrivs främst spridning av metastaserande celler till avlägsna platser. Många insatser i cancerbehandling fokuserar på inriktning eller förhindra bildandet av metastaserande kolonier och progression av systemisk metastaserande sjukdom1. Cancer cellmigration är ett avgörande steg i processen tumör metastasering, forskningen av cancer invasion kaskad är således mycket viktigt och en förutsättning att hitta anti metastaserande therapeutics.
Användning av djurmodeller som verktyg för att studera metastaserad sjukdom har visat sig vara mycket dyrt och inte alltid representativa för tumören hos människor. Dessutom påverkar extracellulära mikromiljö topologin, mekanik och sammansättning starkt cancer cell beteende2. Eftersom i vivo modeller saknar inneboende förmåga att skilja och kontrollera sådana specifika parametrar som bidrar till cancer invasion och metastasering, finns det ett behov för kontrollerbar biomimetiska in vitro- modeller.
För att metastasera till avlägsna organ, måste cancerceller uppvisar flyttande och invasiv fenotypiska drag som kan vara riktad terapi. Eftersom de flesta i vitro cancer modeller inte efterlikna riktiga funktioner av solida tumörer3, är det emellertid mycket utmanande att upptäcka fysiologiskt relevanta fenotyper. Dessutom dikterar den fenotypiska heterogenitet som finns inom tumören, behovet för att analysera tumör migration enda element upplösning för att upptäcka fenotyp-riktade terapier, till exempel genom att rikta cellen metastas-initiera befolkningen inom heterogen tumörer4.
Studien av cell motilitet och kollektiva migration genomförs främst i enskiktslager kulturer av epitelceller på homogena plana ytor. Dessa konventionella cellular-modeller för cancer cellmigration baseras på en analys av enskilda celler invaderar genom membran och ECM komponenter5, men i sådana system, till inneboende skillnader mellan enskilda celler kan inte studerade. Generera 3D spheroids antingen via ställningar eller i byggnadsställning-fri mikro-strukturer är ansedd som en överlägsen innebär att studera tumören cell tillväxt och cancer invasion6,7,8. Men mest 3D system lämpar sig inte till hög genomströmning format och Inter sfäroid interaktion vanligtvis uppnås inte eftersom isolerade enskilda spheroids genereras i varje mikro-väl9. Nyligen genomförda studier som involverar cancer migreringen är baserade på mikroflödessystem enheter3,10,11,12, dock dessa sofistikerade mikroflödessystem verktyg är svåra att tillverka och inte kan användas för hög genomströmning screening (HTS) av anti invasiva droger.
Två huvudsakliga fenotyper, kollektiva och individuella cellmigration, som spelar en roll i tumörceller att övervinna ECM barriären och invaderar angränsande vävnad, har varit visat13,14, varje visning distinkta morfologiska egenskaper, biokemiska och molekylära genetiska mekanismerna. Dessutom kan två former av migrerar tumörceller, fibroblast-liknande och amoeboid, observeras i varje fenotyp. Eftersom båda, invasion fenotyper och migration lägen, definieras främst av morfologiska egenskaper, det finns ett behov av cellular modeller att aktivera imaging-baserad detektion och granskning av alla former av tumör invasion och migrera celler.
Det övergripande målet för den nuvarande metoden är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D i vitro cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Här introducerar vi HMCA-baserade 6-väl tänkbar plattan för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande terapi. Tekniken gör det möjligt för bildandet av ett stort antal enhetliga 3D tumör spheroids (450 per brunn) i en hydrogel mikro-chambers (MC) struktur. Olika ECM komponenter läggs till i arrayen sfäroid aktivera invasionen av cellerna i den omgivande miljön. Invasionen-processen övervakas kontinuerligt av kort – och långsiktiga observationen av samma enskilda spheroids/invaderar celler och underlättar morfologisk karakterisering, fluorescerande färgning och hämtning av specifika spheroids när som helst. Eftersom många spheroids dela utrymme och medium, är interaktion via lösliga molekyler mellan enskilda spheroids och deras inverkan på varandra möjligt. Semi-automatisk bildanalys utförs med hjälp av interna MATLAB-kod som möjliggör snabbare och effektivare insamling av stora mängder data. Plattformen underlättar korrekt, samtidig mätning av många spheroids/invaderar celler på ett tidseffektivt sätt, så att medelstora throughput screening av anti invasion droger.
Det är väl dokumenterat att levande organismer, kännetecknas av sin komplexa 3D multicellulär organisation skiljer sig helt från vanliga 2D enskiktslager odlade celler, betonar avgörande behovet av att använda cellular-modeller som bättre efterliknar funktionerna och processer i den levande organismen för drug screening. Nyligen, flercelliga spheroids, organotypic kulturer, organoids och organ-på-ett-chip har varit införda8 för användning av standardiserade läkemedelsutveckling. Dock…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bequest Moshe Shimon och Judith Weisbrodt.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |