Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

doi: 10.3791/58359 Published: October 25, 2018

Summary

Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.

Abstract

Uitzaaiing van kanker is bekend dat het veroorzaken van 90% van kanker letaliteit. Metastase is een meertraps proces dat met de penetratie/invasie van tumorcellen in naburige weefsel start. Invasie is dus een cruciale stap in de metastase, waardoor de invasie proces onderzoek en de ontwikkeling van anti-metastatische drugs, veelbetekenend. Om aan deze vraag, er is een noodzaak om 3D in vitro modellen die imiteren van de architectuur van solide tumoren te ontwikkelen en hun communicatie nauwst aan in vivo staat aan de ene kant, maar op hetzelfde moment worden gereproduceerd, robuust en geschikt voor hoge opbrengst en hoog inhoud metingen. Op dit moment de meeste invasie testen leunen op geavanceerde microfluidic-technologieën die geschikt zijn voor onderzoek, maar niet voor hoog volume drug screening. Andere plaat-gebaseerde apparaten met geïsoleerde individuele spheroïden in elk putje testen zijn materiaal consumeren en lage steekproefgrootte per voorwaarde. Het doel van het huidige protocol is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. We ontwikkelden een 3D-model voor invasie assay gebaseerd op HMCA imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische drugontdekking. Dit apparaat maakt de productie van talrijke uniforme spheroïden per putje (hoge steekproefgrootte per voorwaarde) omgeven door ECM-onderdelen, terwijl tegelijkertijd en continu observeren en meten van de spheroïden met één element voor medium resolutie throughput screening van anti-metastatische drugs. Dit platform wordt hier gepresenteerd door de productie van HeLa en MCF7 spheroïden voor het voorbeeldig voor eencellige en collectieve invasie. We vergelijken de invloed van de ECM component hyaluronzuur (HA) op de invasieve capaciteit van collageen rondom HeLa spheroïden. Tot slot, we kennismaken met Fisetin (invasie remmer) HeLa spheroïden en stikstofmonoxide (NO) (invasie activator) naar MCF7 spheroïden. De resultaten worden geanalyseerd door interne software waarmee semi-automatische, eenvoudige en snelle analyse die Multi-parameter onderzoek vergemakkelijkt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanker overlijden wordt toegeschreven voornamelijk aan de verspreiding van uitgezaaide cellen naar verre locaties. Vele inspanningen in de behandeling van kanker geconcentreerd op targeting of preventie van de vorming van metastatische kolonies en progressie van systemische gemetastaseerde ziekte1. Kanker cel migratie is een cruciale stap in het proces van tumor metastase, het onderzoek van de kanker invasie cascade is dus erg belangrijk en een voorwaarde voor het vinden van de anti-metastatische therapeutics.

Het gebruik van dierlijke modellen als instrumenten voor het bestuderen van gemetastaseerde ziekte is erg duur en niet altijd representatief voor de tumor bij de mens gevonden. Bovendien, de extracellulaire communicatie topologie, de mechanica en de samenstelling sterk van invloed op kanker cel gedrag2. Aangezien in vivo modellen is inherent gebrek aan de mogelijkheid om te scheiden en beheren van dergelijke specifieke parameters die aan kanker invasie en metastase bijdragen, is er behoefte aan een beheersbare biomimetische in vitro modellen.

Om het metastaseren tot verre organen, moeten de kankercellen trekkende en invasieve fenotypische eigenschappen die kunnen worden gericht voor therapie vertonen. Aangezien de meeste in vitro kanker modellen niet de feitelijke kenmerken van solide tumoren3nabootsen doen, is het echter zeer uitdagend om te detecteren fysiologisch relevante fenotypen. Bovendien, dicteert de fenotypische heterogeniteit die bestaat binnen de tumor, de noodzaak voor het analyseren van de tumor migratie op één element resolutie om te ontdekken fenotype gerichte therapieën, bijvoorbeeld door zich te richten de cel metastase-Inleiding bevolking binnen heterogene tumoren4.

De studie van de beweeglijkheid van de cel en collectieve migratie is voornamelijk uitgevoerd in enkelgelaagde culturen van epitheliale cellen op homogene vlakke oppervlakken. Deze conventionele cellulaire modellen voor kanker cel migratie zijn gebaseerd op de analyse van de bevolking van afzonderlijke cellen invasie door de membranen en ECM componenten5, maar in dergelijke systemen, de intrinsieke verschillen tussen afzonderlijke cellen kunnen niet studeerde. Genereren 3D spheroïden, hetzij via steigers of steiger-gratis micro-structuren is beschouwd als een superieure betekent om te studeren van de tumor cel groei en kanker invasie6,7,8. Echter meest 3D systemen zijn niet geschikt voor hoge doorvoer formaten, en inter sferoïde interactie meestal niet worden bereikt aangezien geïsoleerde individuele spheroïden worden gegenereerd in elk micro-well9. Recente studies met betrekking tot de migratie van kanker zijn gebaseerd op microfluidic apparaten3,10,11,12, echter deze verfijnde microfluidic tools zijn moeilijk te produceren en kan niet voor hoge throughput screening (HTS) van anti-invasieve drugs worden gebruikt.

Twee belangrijkste fenotypen, collectieve en individuele cel migratie, die een rol spelen bij de tumorcellen het overwinnen van de ECM-barrière en invasie van naburige weefsel, hebben aangetoond dat13,14, elke weergave van verschillende morfologische kenmerken, genetische, biochemische en moleculaire mechanismen. Daarnaast zijn twee vormen van migratie tumorcellen, fibroblast-achtige en Wortelpotigen, waargenomen in elke fenotype. Aangezien beide invasie fenotypes en migratie modi, voornamelijk door morfologische eigenschappen worden gedefinieerd, er is behoefte aan een mobiele modellen die inschakelen imaging gebaseerde detectie en behandeling van alle vormen van de invasie van de tumor en het migreren van cellen.

Het algemene doel van de huidige methode is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D in vitro cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. Hier introduceren we de HMCA gebaseerde 6-well imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische therapie. De technologie maakt de vorming van grote aantallen van uniforme 3D tumor spheroïden (450 per putje) in een hydrogel micro-kamers (MC) structuur. Verschillende onderdelen van de ECM zijn toegevoegd aan de matrix sferoïde om de invasie van de cellen in de omgeving. Invasie proces wordt voortdurend gecontroleerd door korte - en lange termijn waarneming van dezelfde individuele spheroïden/invasie cellen en vergemakkelijkt Morfologische karakterisering, fluorescerende vlekken en het ophalen van specifieke spheroïden op elk gewenst moment. Aangezien talrijke spheroïden ruimte en medium delen, is interactie via oplosbare moleculen tussen individuele spheroïden en hun invloed op elkaar mogelijk. Semi-automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van in-house MATLAB-code waarmee de snellere en meer efficiënte verzameling van grote hoeveelheden gegevens. Het platform vergemakkelijkt nauwkeurige, gelijktijdige meting van talrijke invasie van spheroïden/cellen in een tijd-efficiënte manier, waardoor middellange throughput screening van anti-invasie drugs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. HMCA plaat preegdruk

Opmerking: Het volledige proces voor het ontwerp en de fabricage van Polydimethylsiloxaan (PDMS) stempel en imaging plaat HMCA gebruikt in dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in onze eerdere artikelen15,16. Het PDMS stempel (negatieve vorm) wordt gebruikt om het reliëf van de HMCA (positieve vorm), die uit ongeveer 450 MCs per putje (figuur 1A bestaat). Zoals aangetoond in figuur 1B, elk van de MCs heeft een vorm van een afgeknotte piramide vierkant-vormige ondersteboven (hoogte: 190 µm, kleine basisareaal: 90 µm x 90 µm en groot basisareaal: 370 µm x 370 µm). De HMCA plaat wordt gebruikt voor de voorbereiding en het kweken van 3D tumor spheroïden en daarna voor invasie assay. U kunt ook kan een commerciële stempel worden gebruikt voor de productie van de HMCA.

  1. Bereid een oplossing van 6% lage smeltende agarose (LMA). Het LMA poeder en steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (0,6 g LMA per 10 mL PBS) invoegen in een glazen fles met een magneetroerder. Plaats de fles op een verwarmingsplaat en roer de oplossing terwijl verwarming tot 80 ° C voor een paar uur totdat een uniforme oplossing is bereikt. Bewaar deze oplossing bij 70 ° C tot gebruik.
  2. Verwarm het PDMS stempel tot 70 ° C in de oven. Houd het warm tot gebruik. Als alternatief gebruik van een commerciële stempel en volg de instructies.
  3. Plaats de commerciële 6-well glazen-bodem platen op een droge Bad pre-water verwarmd tot 75 ° C. Wacht enkele minuten totdat de plaat volledig warm.
  4. Giet een druppel (400 µL) voorverwarmde LMA op de glazen bodem van elk van de putjes in de plaat. Zachtjes de voorverwarmde PDMS stempel op de daling van de agarose plaatst. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 tot 10 min voor vooraf gelerend en vooraf koeling. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 minuten tot volledige agarose gelering. Vervolgens voorzichtig afschilferen naar het PDMS, verlaten het agarose gel patroon met MCs.
    Opmerking: Deze stap gebeurt gelijktijdig in alle de putjes.
  5. Plaats de reliëf plaat in een licht systeem voorzien van ultraviolet (UV)-lamp uitharden en incubeer gedurende 3 minuten.
    Opmerking: Nu de HMCA plaat is UV gesteriliseerd.
  6. Vul de macro-putten met steriel PBS om ervoor te zorgen dat ze vochtig blijven, dan de afdekplaat, wikkel het met parafilm en het bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
  7. Vóór gebruik, leeg PBS reststromen uit de HMCA plaat. Plaats het in de biologische kap.

2. veilig laden cellen en sferoïde vorming

  1. Verzamelen van de cellen als volgt: alle medium verwijderen uit een 10 cm cultuur plaat cel enkelgelaagde, was tweemaal met 10 mL PBS te vervreemden van serum storingswaarden, voeg 5 mL trypsine (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en incubeer gedurende 3 minuten in de incubator bij 37 ° C. Vervolgens, schud de plaat zachtjes aan enkelgelaagde detachement zorgen en voeg 10 mL van volledige medium (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en Pipetteer op en neer totdat homogene celsuspensie is bereikt. Centrifugeren en wassen van de celsuspensie met 15 mL verse voedingsbodem dan opschorten bij adequate concentraties in vers volledig medium.
  2. Zachtjes laden de celsuspensie (50 µL, 150 – 360 x 103 cellen/mL in medium, ~ 16-40 cellen per MC) op de top van de HMCA en de cellen te regelen door de zwaartekracht voor 15 min te laat.
  3. Zachtjes 6 – 8 aliquots van 500 µL verse medium (totaal 3-4 mL) aan de rand van de macro-well kunststof bodem buiten de ring en hydrogel array toevoegen.
  4. Incubeer HeLa cellen gedurende 72 uur en MCF7 cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2, in een bevochtigde sfeer voor de vorming van spheroïden.

3. levensvatbaarheid detectie door Propidium jodide (PI) kleuring

  1. Bereiden van een stamoplossing van PI (500 µg voor PI per 1 mL PBS). Houd het bij 4 ° C voor ongeveer 6 maanden. Vers bereid een verdunning van 1:2,000 (0,25 µg/mL), door de toevoeging van 6 µL van materieel tot 12 mL van volledige medium zonder fenol rood, voor de 6-well HMCA plaat (2 mL per putje).
  2. De HMCA plaat met 48-72 uur spheroïden, vanuit de incubator voor de biologische kap overzetten. Alle medium uit de HMCA verwijderen door het tip-einde leunend op de rand van de macro-well Kunststof onderzijde naast de hydrogel array, verlaten de matrix tank gevuld met medium.
  3. Zachtjes Voeg toe 2 mL PI verdunning van stap 3.1 aan elk putje, door het einde van de tip leunend op de rand van de macro-well kunststof bodem. Incubeer de plaat van de HMCA gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2, in een bevochtigde sfeer. Ga verder met stap 7.
    Opmerking: Andere kleurstoffen kunnen worden gebruikt hier ook, bijvoorbeeld, Hoechst voor nucleus kleuring, tetramethylrhodamine methylester (TMRM) voor Mitochondriale membraanpotentiaal kleuring, fluoresceïne DIACETAAT (FDA) voor de levende cellen detectie, Annexine V voor apoptosis detectie en anderen.

4. collageen mengsel voorbereiding

  1. Bereiden steriel dubbel gedestilleerd water (DDW) door autoclaaf en een voorraad van 100 mL 1 M NaOH filter-gesteriliseerde oplossing. Het handhaven van de materialen op de RT en de tips voor collageen mengsel bereiding bevroren bij-20 ° C, tot gebruik bestemd.
  2. 10 – 20 min vóór gebruik, plaats alle intergrades met inbegrip van: steriele DDW, 1 M NaOH steriele oplossing, steriele 10 x PBS, typ ik collageen van de staart van de rat (opgeslagen bij 4 ° C gedurende 3-maanden) en een steriele buis in de ijsemmer tot volledig afgekoeld. Plaats de ijsemmer binnen de biologische kap.
  3. 1.800 µL van het mengsel van collageen met een eindconcentratie van 3 mg/mL, voorbereiden op 6-well HMCA invasie assay plaat (300 µL per putje) als volgt. Voeg de intergrades in de afgekoelde buis in de volgende volgorde: 515 µL van DDW, 24.8 µL van 1 M NaOH en 180 µL van 10 x PBS. Meng goed door vortex en terug in het ijs. Ten slotte, 1080 µL van collageen toevoegen aan het mengsel, vortex weer en zet terug in ijs.

5. HA en collageen mengsel voorbereiding

  1. Los 10 mg HA in 2 mL steriele DDW. Incubeer het mengsel op RT voor een paar minuten en vortex zachtjes tot het poeder volledig is opgelost. Bewaar de stockoplossing bij 4 ° C voor maximaal twee jaar.
  2. Rechts vóór gebruik, plaatst u de stockoplossing HA in de ijsemmer binnen de biologische kap.
  3. Bereiden een 3 mg/mL collageen mengsel zoals beschreven in stap 4. Voeg 36 µg (7.2 µL) van HA in 1800 μL van klaar voor gebruik van collageen mengsel, voor een eindconcentratie van 20 µg/mL. Dan, vortex nogmaals kort en zet terug in ijs.

6. ECM mengsel toevoeging

  1. De HMCA plaat, met 48-72 h spheroïden, overdracht van de incubator in de biologische kap en plaats deze op het ijs. Incubeer gedurende 10 minuten tot de plaat is afgekoeld. Verwarm op een oplossing van 1% LMA tot 37 ° C in een waterbad.
  2. Verwijder alle medium uit rond de HMCA, door het tip-einde leunend op de rand van de macro-well Kunststof onderzijde naast de hydrogel-matrix. Zorgvuldig, verwijder vervolgens alle medium uit de matrix tank met een fijne tip/gel tip, door het einde van de tip leunend op de rand van de matrix, langzaam en zachtjes zuigen alle medium uit te laden.
    Opmerking: Na het verwijderen van alle medium uit rond de hydrogel matrix, de matrix-tank is nog steeds gevuld met medium. Dit medium moet zeer voorzichtig worden verwijderd om te voorkomen vernietiging van de hydrogel MC en dislocatie van spheroïden.
  3. Neem 150 µL van het mengsel van collageen of HA en collageen mengsel (ECM mengsel) met de vooraf bevroren fijne tip en voeg in de matrix tank door de tip te hechten aan de rand van de matrix. Laat het mengsel langzaam Voorkom sferoïde dislocatie. Herhaal deze stap met een andere hoeveelheid 150 µL, voor een totale 300 µL per putje. Volg dezelfde procedure als voor elk putje totdat alle putjes worden opgevuld. Plaats de plaat dan in de incubator voor 1 h voor de volledige gelering voor de ECM.
  4. Nadat de volledige gelering voor ECM is bereikt, Pipetteer 400 µL voorverwarmde 1% LMA bovenop de ECM-gel. De afdekplaat met zijn deksel, Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 5-7 minuten, waarna gedurende 2 minuten bij 4 ° C, voor agarose gelering. Ten slotte, zachtjes Voeg toe 2 mL van volledige medium door het einde van de tip leunend op de rand van de macro-well kunststof bodem.
    Noot: De agarose laag voorkomt dat de onthechting van de collageen-gel matrix van de HMCA.

7. invasie Assay verwerving en analyse

  1. Belasting de HMCA plaat op een gemotoriseerde omgekeerde Microscoop fase voorzien van een incubator, vooraf aangepast tot 37 ° C, 5% CO2 en bevochtigde sfeer.
  2. Vooraf bepalen de posities voor Beeldacquisitie in elk goed zodat de hele matrix gebied bestrijken, en gebruiken van 10 X of 4 X doelstellingen (deze stap is vereist voor de afbeelding acquisitie software hier gebruikt, zie de Materialen tabel hieronder voor details). Anderzijds alle afbeelding acquisitie software gebruiken om de automatische scan van de gehele vereiste ruimte, door te kiezen voor de "Stich" optie.
  3. Verwerven beelden helder veld (BF) elke 2-4 h voor een totale periode van 24-72 uur te volgen van de invasie van cellen van het lichaam sferoïde in de omliggende ECM.
  4. Verwerven fluorescerende beelden voor PI detectie met behulp van een speciale tl kubus (excitatie filter 530 – 550 nm, dichroïde spiegel 565 nm lange pass en emissie filter 600 – 660 nm).
  5. Time-lapse BF/TL beelden uit de afbeelding acquisitie software exporteren en opslaan in tagged image file-indeling (TIFF) naar een speciale map via het tabblad 'Database' in de werkbalk en vervolgens op de knop "Export bestanden opnemen" .
    Opmerking: We hebben ontwikkeld code voor een speciale in-house analyse in MATLAB software waarin een ontworpen grafische gebruikersinterface (GUI) in welke invasie analyse kan worden uitgevoerd, sneller en gemakkelijker. In deze code analyse gebeurt de segmentatie van de spheroïden en de invasie gebied semi-automatisch met behulp van Sobel filter gevolgd door de morfologische operatoren erosie en dilatatie. Na automatische segmentatie van de gebieden, handmatige correcties aangebracht waar nodig voor betere nauwkeurigheid. Na de voltooiing van de segmentatie, waren een aantal parameters automatisch berekend door de software en geëxporteerd naar een excel bestand voor verdere manipulatie. De lijst van parameters zijn: doorsnede van het fundamentele sferoïde tijde = 0, invasie gebied van cellen verbonden met sferoïde lichaam = belangrijkste invasie gebied, gebied van cellen gescheiden van belangrijkste invasie, aantal cellen gescheiden van belangrijkste invasie, gemiddelde afstand van invasie van het fundamentele sferoïde massamiddelpunt aan de omtrek van de belangrijkste invasie gebied en scheidt cellen en collectieve invasie afstand parameter = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y-1)2) uit de X en Y sferoïde massamiddelpunt coördineert, voorheen (X1, Y-1) en na (X2, Y2) collectieve invasie proces). U kunt ook kan beeldanalyse worden gedaan met een andere gespecialiseerde software.
  6. Open de GUI en druk op de "Load BF" knop. Nadat de afbeelding geopend is, de segmentatie parameters aanpassen (minimale grootte: > 1 en straal sluiten: > 1) om een precieze segmentatie van sferoïde en de invasie, druk vervolgens op "Regio van belang (ROI) segmentatie" knop voor uitvoering en Er verschijnt een rand rond elke sferoïde. Als de automatische segmentatie onjuist is, drukt u op de knop "Verwijderen" of "Toevoegen" en de gevraagde correcties handmatig aanbrengen. Herhaal dezelfde stappen voor latere beelden.
  7. Druk op de knop "Tracking" naar het nummer van de spheroïden en de software zal toewijzen voor elke sferoïde in elk van de tijd lapse beelden hetzelfde getal. Druk vervolgens op de knop "Measurement" , die een spreadsheet met alle parameters genereren zal. Dit werkblad opslaan als een excel-bestand voor verder gebruik in resultaten verwerking en statistieken in excel software.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De unieke HMCA imaging plaat wordt gebruikt voor de bepaling van de invasie van de 3D tumor spheroïden. De gehele assay, begint met de vorming van sferoïde en eindigt met het proces van de invasie en de extra manipulaties, wordt uitgevoerd binnen de dezelfde plaat. Voor de vorming van sferoïde, HeLa cellen zijn geladen in het bekken van de matrix en vestigen in de hydrogel MCs door de zwaartekracht. De hydrogel MCs, die hebben niet-aanhanger/lage bijlage kenmerken, faciliteren van de interactie van de cel en de vorming van 3D tumor spheroïden. Figuur 2A toont de cellen vestigde zich in de MCs, na het gebruik van 150 x 10-3 cellen/mL laden oplossing (dwz., ~ 16 cellen per MC waarde berekend). Het is duidelijk dat de bezetting van cellen per MC is niet gelijkmatig verdeeld door de array, en de verdeling van de gemiddelde verkregen statistiek 14.78 ± 3,60 cellen per MC is. De tabel in figuur 2B bevat een overzicht van de verdeling van de cel per MC voor de hele plaat van de HMCA. De gemiddelde variatiecoëfficiënt (CV) van de cel distributie binnen een macro-well is 43.33%, terwijl tussen de macro-putten het 24.37%. De verschillen in cel bezetting zijn van cruciaal belang en direct dicteren de grootte van spheroïden gevormd en hun homogeniteit in de plaat. Om verminderen/beperken van de variabiliteit gemaakt door het aantal cellen per MC, wordt de analyse van de resultaten uitgevoerd met één element resolutie. De percelen in figuur 2C-D illustreren de grootteverdeling (doorsnede) van 3-daagse spheroïden. Het is duidelijk geïllustreerd in figuur 2D berekening van de verhouding van de groei van elke sferoïde (doorsnede op dag 3/dag 2) heeft een meer homogene verdeling dan de absolute grootte distributie (figuur 2C), opbrengst van een CV 15.48% en 52.80%, respectievelijk. Sferoïde verdeling van de diameter van de 3-daagse spheroïden levert een CV van 24.52% en de verhouding van de groei (diameter aan dag3/day2) is 7,45%. Deze CV-waarden zijn vergelijkbaar met de17 of hoger dan18 andere verslagen bereiken cel laden door de zwaartekracht. Om te vermijden de afwijking van de gemeten parameter als gevolg van de variabiliteit in de oorspronkelijke geplaatste celaantal per MC, is het beter om te normaliseren van de geselecteerde parameters naar het nummer van de eerste cel of naar een andere gemeten parameter van hetzelfde object, dergelijke elke sferoïde heeft haar interne controle. Deze aanpak kan gemakkelijk worden toegepast door het bijhouden van het object op de imaging plaat van HMCA.

Het proces van sferoïde vorming en groei kan eenvoudig worden gevolgd op de HMCA plaat imaging. Figuur 3A-B toont een BF-beeld van een regio op de HMCA imaging plaat met 24u HeLa cel aggregaten en de respectieve afbeelding van oudere, 5-dag 3D-meercellige objecten, die steeds meer bolvormig en dichtere. Het is duidelijk aangetoond dat de meeste objecten hun locatie tijdens de 5-daagse incubatietijd behouden. De analyse van de vorm (bolvorm) en grootte (doorsnede) tijdens de sferoïde vorming wordt gepresenteerd in Figuur 3 c. De scatterplot toont de stijgingen van beide parameters vanaf dag 1 tot dag 5; 0.544 ±0.020 a.u. 0.684± 0,016 a.u. voor bolvorm (p < 0,05) en 0.00356± 0.00013 mm2 tot 0.00538 ± 0.00015 mm2 voor doorsnede (p < 0,05), respectievelijk. Terwijl 24u aggregaten klein zijn en niet-regelmatige vorm hebben, de respectieve 5-daagse spheroïden zijn groter en het verwerven van sferische vorm.

De opsporing van de levensvatbaarheid van de cellen van de sferoïde wordt uitgevoerd met behulp van lage concentratie PI voor de kleuring van19 , waarin de noodzaak voor het wassen van de kleurstof omzeilt. PI doordringt de celmembraan en klik vervolgens in het DNA van niet-levensvatbare cellen intercalates. Figuur 4A toont 5-daagse HeLa spheroïden gekleurd met PI (in rood). Analyse van het percentage van rode gebied (namens dode cellen) uit elke doorsnede sferoïde is samengevat in figuur 4B. Het histogram toont aan dat 85% van de bevolking sferoïde een maximale waarde van 5% rood gekleurd heeft en het gemiddelde 3.01 ± 2.34% (linker histogram). Doorsnede van spheroïden (juiste histogram) toont een normale verdeling met een gemiddelde van 0.02447 ± 0.00487 mm2.

Na de 3-daagse volwassen HeLa spheroïden produceren, is de bepaling van de invasie uitgevoerd binnen de HMCA imaging plaat. Het effect van variabelen, zoals ECM-remmers, samenstelling en activators, op het proces van 3D tumor sferoïde invasie kon worden onderzocht. Voor invasie assay prestaties, is het medium voorzichtig verwijderd en vervangen door ECM oplossing pipet over de spheroïden in het bekken van de matrix MC. Na de volledige gelering van de ECM-oplossing, wordt volledige medium toegevoegd in de macro-put. (1) In het oog op de onderzoeken van de invloed van HA op het proces van HeLa sferoïde spontane invasie, de spheroïden waren bedekt met collageen en HA mengsel oplossing (figuur 5A) en vergeleken met die bedekt met collageen enige oplossing (figuur 5C), en BF beelden werden verworven recht na ECM gelering (t = 0 h). De kinetische van invasie proces werd gevolgd door dezelfde regio elke 5 h imaging voor een periode van 63 h. Na 50 uur incubatie, de spheroïden ingesloten in collageen en HA (figuur 5B) toonde lagere dispersie van de cel in de omliggende ECM in vergelijking met de spheroïden ingebed in collageen alleen (figuur 5D). De analyse van de invasie gebied kinetische na verloop van tijd voor 99 spheroïden op single-sferoïde resolutie is samengevat in figuur 5E. Figuur 5E Staanplaatsen van de gemiddelde/gemiddelde invasie gebied na verloop van tijd van de twee groepen, en toont duidelijk aan dat de toevoeging van HA aan collageen remt de spreiding van de cel uit de sferoïde, wat resulteert in kleinere gebieden van de invasie. Het gemiddelde van de hellingen die voortvloeien uit lineaire regressie aanpassing curven voor elk van de spheroïden ingebed in collageen (0.001973 ± 0.000894 mm2/h) in vergelijking met collageen en HA oplossing (0.001410 ± 0.000941 mm2/h) zijn aanzienlijk verschillende (p = 0.003, t-toets: twee gepaarde steekproeven met gelijke varianties). (2) om het onderzoeken van de invloed van Fisetin (een bioactieve flavonoïde gevonden in diverse groenten en fruit die toont cytostatic en migrastatic activiteiten door te handelen op verschillende moleculaire targets, met inbegrip van phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) / Akt/c-Jun N-Terminal kinases (JNK) signalering en Wnt/β-catenine signalering ontstekingsuitlokkende matrix metalloproteinasen (MMP) e.a.20) op HeLa sferoïde spontane invasie proces, toenemende concentraties van de drug werden toegevoegd aan het volledige medium en BF beelden werden verworven op t = 0 (figuur 6A) en 24 h later (figuur 6B-C). Zoals aangetoond, remt 10 µM van Fisetin (Figuur 6 c) de spreiding van de cellen rond het spheroïden ten opzichte van niet-behandelde HeLa spheroïden (figuur 6B). De invasie gebied analyse van een dosis reactie experiment (figuur 6D) vertoont significante remming bij 10-40 µM van Fisetin (p < 0.003), verwezenlijking van verzadiging in de concentratie van 10 µM en hoger. (3) het heeft aangetoond dat Nee, op het niveau van een nano-molar, draagt bij tot een meer agressieve borstkanker kanker fenotype door stimulerende tumor expansie en migratie16. Om te onderzoeken van de invloed van NO op het proces van collectieve invasie van MCF7 spheroïden ingebed in collageen, 1 µM van diëthyleentriamine/nitraat oxide donor (DETA/NO) werd toegevoegd aan de volledige kweekmedium en BF beelden werden verworven op t = 0 en t = 20 h. Dramatic veranderingen in de morfologie en de locaties van 3D spheroïden tijdens de blootstelling aan geen donor zijn evident (figuur 7A-B). De spheroïden verliezen hun bolvorm en worden meer langwerpige Wortelpotigen grote afstanden trekkende fenotype verwerven. Gelijktijdig, werd verbeterde translocatie van de spheroïden binnen de omringende collageen matrix waargenomen (Figuur 7 c). De waarde van de gemiddelde rek aanzienlijk verhoogd van 1.305 ± 0.193 a.u. naar 1.477 ± 0.298 a.u., (p < 0.0006). De gemiddelde migratie afstand gemeten voor de dezelfde spheroïden werd aanzienlijk uitgebreid, 0.0788 ± 0.0575 mm en 0.3164 ± 0.3365 mm in de afwezigheid en in de aanwezigheid van DETA/Nee, respectievelijk (p < 4 x 10-6).

Beeldanalyse van de sferoïde invasie werd bereikt door semi-automatische software voor in-house MATLAB. De verworven time lapse beelden van sferoïde vorming en invasie binnen de HMCA bestaat uit talrijke spheroïden in één beeld (4-6 spheroïden op 10 X vergroting en 25-30 spheroïden op 4 X vergroting). De analyse van sferoïde vorming, groei en invasie werd gelijktijdig uitgevoerd op alle spheroïden in de afbeelding. De sleutelparameters gewonnen voor sferoïde invasie worden gepresenteerd in figuur 8A, waarin een vertegenwoordiger beeldsegmentatie van 4 spheroïden op een enkel tijdstip (t = 16 h). De belangrijkste invasie-gebied dat is gedefinieerd door een rode rand, evenals de scheidt cellen die ontkoppeld en verspreid eromheen (aangegeven door zwarte pijlen), werden bijgehouden en geteld voor elke sferoïde na verloop van tijd. Sferoïde grootte voor invasie op t = 0 wordt gedefinieerd door een blauwe rand. De afstand van de gemiddelde/gemiddelde invasie van sferoïde massamiddelpunt tot de invasie gebied omtrek met inbegrip van scheidt cellen is berekend op basis van de omringde rode segmentatie en aangegeven met gele pijlen. Gegevens uit deze time-lapse experiment is samengevat in figuur 8B-D. Figuur 8B vertoont de hoogte van de invasie van de gemiddelde afstand van elke triade sferoïde na verloop van tijd. Figuur 8C vertoont de hoogte van het gebied van de totale invasie in elk van de spheroïden na verloop van tijd (met inbegrip van de belangrijkste invasie en gescheiden/ontkoppeld-cel). Figuur 8D 1-4 toont de omvang van gescheiden-cel gebied in vergelijking met het totale invasie gebied van elke sferoïde (na verloop van tijd). Het cumulatieve aantal onthechte cellen is 33, 7, 4 en 5 voor spheroïden #1, #3 en #2 en #4, respectievelijk. De analyse van het cumulatieve aantal onthechte cellen die meer dan 20 h van invasie verkregen 126 HeLa spheroïden ingebed in collageen wordt weergegeven in figuur 8E. Hier wordt aangetoond dat er een enorm groot verspreidingsgebied in het aantal onthechte cellen bij de onderzochte populatie en de gemiddelde waarde 12,3 ± 12,8 cellen is.

Figure 1
Figuur 1: de HMCA plaat imaging. (A) afbeelding van een macro-well met HMCA in reliëf. (B) een dwarsdoorsnede van een MC binnen de HMCA imaging plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: homogeniteit van de verhouding van de cel distributie en sferoïde de groei in de HMCA plaat imaging. (A) een overlay van BF en fluorescerende beelden van de HMCA geladen met HeLa cellen vooraf gekleurd met Hoechst 33342 1 µg/mL (laden concentratie 150 x 103 cellen per mL). Beelden werden verworven recht na de schikking van de cel bij de MC. Image vergroting 4 X, schaal bar = 500 µm. (B) de tabel bevat een overzicht van de verdeling van HeLa cellen binnen de HMCA-6-well imaging plaat. De cellen werden geteld van maximaal 90 MC/macro-well. De resultaten worden gepresenteerd zoals bedoel ± standaarddeviatie (SD), CV (SD/mean100) wordt berekend binnen en tussen de macro-putten. (C) distributie histogram van de doorsnede van de 3-daagse spheroïden, n = 418, bepaald op basis van BF beelden. (D) distributie histogram van de sferoïde groei ratio (doorsnede op dag 3/dag 2). Groei verhouding wordt berekend op de resolutie van één element voor elk van de 418 spheroïden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Tracking sferoïde vorming in de imaging plaat HMCA. BF beeld van HeLa cellen (laden concentratie 120 x 103 cellen per mL) geïncubeerd in de HMCA voor 1 dag (A) en 5 dagen (B). Image vergroting 4 X, schaal bar = 500 μm. (C) Scatter uitzetten van 3D-object bolvorm als een functie van de doorsnede, na 1 dag (blauwe diamanten) en 5 dagen (bruin pleinen) van incubatie post cel laden. Elke gegevensmarkering vertegenwoordigt de geanalyseerde gegevens uit een enkele sferoïde, n = 83. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: detectie van de levensvatbaarheid van de cellen in volwassen spheroïden. Een deken van BF en fluorescerende beelden van 5 daagse spheroïden (laden concentratie 360 x 103 cellen per mL) gekleurd met PI 0,25 µg/mL (A). Image vergroting 4 X, schaal bar = 500 µm. (B) distributie histogram van het percentage van PI ruimte ten opzichte van de doorsnede van de sferoïde (linkerdeel) en distributie histogram van doorsnede (juiste paneel), n = 84. Procent van PI ruimte wordt op één element resolutie berekend voor elk van de 84 spheroïden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: invloed van ECM samenstelling op sferoïde invasie proces. BF beelden van 3 dag HeLa spheroïden ingebed in een mengsel van 3 mg/mL collageen en 20 µg Mo/mL HA (A) en 3 mg/mL collageen (C), op t = 0 h en na 50 uur incubatie (B) en (D), respectievelijk. Image vergroting 10 X, schaal bar = 200 µm. De HMCA plaat imaging is geladen op het podium van de omgekeerde Microscoop uitgerust met incubator. Beelden werden verkregen elke 5 h en de kinetische analyse wordt gepresenteerd in perceel (E), n = 99. Elke kromme vertegenwoordigt de gemiddelde ± SD van verhoging van het gebied van de invasie na verloop van tijd voor collageen en HA (blauwe diamanten) en voor collageen alleen (bruin pleinen). Gemiddelde lineaire regressie curve en de vergelijking en het R-kwadraat zijn hierboven de bochten aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Fisetin remt spontane invasie van HeLa spheroïden. BF beelden van 3 dag HeLa spheroïden, ingebed in een mengsel van 3 mg/mL collageen (A) bij t = 0 en vervolgens 24 h na toevoeging van 0 µM (B) en 10 µM Fisetin (C) om het volledige kweekmedium. Image vergroting 4 X, schaal bar = 500 µm. analyse van de invasie gebied voor elke sferoïde bij eindpunt (t = 24 h) wordt gepresenteerd in perceel (D), n = 488. De curve vertegenwoordigt gemiddelde ± SD van invasie gebied als een functie van 0-40 µM Fisetin. Fisetin behandeling aanzienlijk remt de invasie op 10 µM (P = 4.65 x 10-6), 20 µM (P = 0.0021) en 40 µM (P = 4,86 x 10-8), met behulp van de t-toets: twee gepaarde steekproeven met gelijke varianties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: NO induceert collectieve invasie in MCF-7 borst kanker spheroïden. BF beelden van 2 dag MCF-7 borst kanker spheroïden, ingebed in collageen (A) aan (t = 0) en (B) na 20u blootstelling aan 1 µM DETA/nr. Sferoïde ROI segmentatie is gedefinieerd door de rode rand, bedekt en genummerd in rood op BF afbeeldingen A en B. ROIs gedefinieerd door blauwe rand, overlay op BF afbeelding B vertegenwoordigen sferoïde grootte en de locatie op t = 0. Vergroting 4 X, schaal bar = 500 µm. (C) A scatterplot van de correlatie tussen rek factor en migratie afstand van individuele borst kanker spheroïden bij de blootstelling aan 1 µM DETA/geen (bruin pleinen) als in vergelijking met controle (blauwe diamanten) bij t = 20 h, n = 54. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: HeLa cel spontane invasie beeldanalyse. BF beelden van 3 dag HeLa spheroïden, 16 uur na de insluiten in collageen (A). Vergroting 10 X. Sferoïde invasie gebied en onthechte cellen worden gedefinieerd door de rode rand, de grootte van de sferoïde bij t = 0 wordt gedefinieerd door de blauwe rand, gemiddelde invasie sferoïde massamiddelpunt afstand wordt aangegeven door gele pijlen en onthechte cellen worden aangegeven door zwarte pijlen. Plot de stijging ten opzichte van de tijd van de invasie van de gemiddelde afstand van sferoïde massamiddelpunt (B) en totale invasie gebied (C). De curven vertegenwoordigen sferoïde #1 (blauwe diamanten), sferoïde #2 (bruin vierkantjes), sferoïde #3 (groene driehoekjes) en sferoïde #4 (paarse Xs). (D) Bar grafiek van de belangrijkste (blauw) en gescheiden van de verhoging van het gebied van de invasie van het cel (bruin) na verloop van tijd. (E) distributie histogram van het cumulatieve aantal scheidt cellen per sferoïde gedurende 20 uur van invasie proces, n = 126. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het is goed gedocumenteerd zijn levende organismen, gekenmerkt door hun complexe 3D meercellige organisatie duidelijk onderscheiden van de meest gebruikte 2D enkelgelaagde gekweekte cellen, nadruk op de cruciale noodzaak om cellulaire modellen die beter na te de functies bootsen en processen van levend materiaal voor drug screening. Meercellige spheroïden, organotypic culturen, organoids en organen-on-a-chip hebben onlangs geïntroduceerde8 voor het gebruik in gestandaardiseerde drugontdekking. Grote complexiteit van het 3D-meercellige model brengt echter aanzienlijk gevaar voor de robuustheid, de paralellisatie en de gegevensanalyse die cruciaal zijn voor assay efficiëntie.

Kwantitatieve evaluatie van invasie capaciteit maatregelen doorgaans het verkeer van cellen door hydrogel materialen. Om te meten de invasie van de tumor met behulp van traditionele micro-Wells-platen, grote aantallen van kankercellen zijn overgeënt ronde bodem platen en gedwongen tot totaal door centrifugeren21,22. Deze platen beperken cel/sferoïde interactie in naast elkaar liggende wells, terwijl de ronde onderkant de optische kwaliteit belemmert en beeldacquisitie bemoeilijkt. In andere methoden, afzonderlijke cellen willekeurig ingekapseld binnen de hydrogel, groeien en functioneren in een 3D omgeving maar niet noodzakelijkerwijs in volwassen spheroïden23,24ontwikkelen. Bovendien zijn de ingewikkelde procedures voor het plaatsen van de cel binnen hydrogel nodig, zoals magnetische kracht gebaseerde cel patronen25 of twee-foton laser-bestraling van bioactieve hydrogels26.

De HMCA gebaseerde technologie hierin gepresenteerd blijkt te zijn voordelige via de bovenstaande methoden: cel positionering, spontane aggregatie en oprichting van spheroïden uit enkele verspreide cellen kan gemakkelijk worden bereikt, waardoor het gebruik van waardevolle beperkte mobiele monster (bv., Steel-achtige kankercellen of primaire cellen afgeleid van patiënt exemplaren). Het systeem heeft controle over zowel de aard van de cellen waaruit de spheroïden evenals over hun exacte ruimtelijke locatie tijdens lange termijn experimenten. Bovendien, de platte bodem van de MC vergemakkelijkt de generatie van talrijke spheroïden op de zelfde brandpunt plan, dus snelle verlichting en beeld verwerving van grote gebieden via een breed veld Microscoop is mogelijk, waardoor de noodzaak voor gecompliceerde tijdrovende confocale microscopie. Het systeem is gemakkelijk te verwerken en zijn praktisch haalbaar. Door eenvoudige operationele procedures toe te passen bereikt we hoge bezetting van sferoïde populaties in die ongeveer 50% van de spheroïden vergelijkbare omvang hebben en een betrouwbare analyse van kanker cel invasie capaciteit. Bovendien, kan het effect van drugs op invasie capaciteit worden geanalyseerd gelijktijdig met hun cytostatische en/of cytotoxische effecten met behulp van hoge-inhoudsanalyse aanpak samen met HMCA apparaat gekweekt met talrijke spheroïden. Bovendien, in de HMCA, alle cellulaire elementen delen dezelfde ruimte en medium, waardoor het mogelijk is te onderzoeken sferoïde-sferoïde interactie die meestal via cel-uitgescheiden cytokines, chemokines, hormonen en de ECM-27 gemedieerde is. Deze cross-talk vergemakkelijkt het voortbestaan en de functie van individuele cellen/kleine cel clusters in macro-well volume.

Een cruciale stap in de uitvoering van het protocol is de toevoeging van ECM mengsel op de top van de spheroïden en valideren van haar goede polymerisatie. De spheroïden zal niet tonen trekgedrag zelfs als ze zijn ingesloten binnen ECM, tenzij de vergadering en dwarsbinding optreden, en passende collageenvezels worden gevormd. De collageenvezels kunnen worden waargenomen door BF verlichting en adviseren wij controleren de plaat onder een microscoop te bevestigen van de oprichting van collageenvezels aan het einde van deze fase. Aangezien het aantal spheroïden is afhankelijk van de concentratie van de oorspronkelijke cel en het percentage van bezet MCs, de matrix moet worden gecontroleerd na het laden van de eerste cel, en als cel bezetting niet optimaal is, opnieuw zaaien van dezelfde array kan worden uitgevoerd. Inderdaad, de grootte en de geometrie van de hierin beschreven HMCA werden ontworpen om geschikt voor relatief kleine cel clusters (tot 150 µm in diameter). Dit kan worden overwogen een beperking aangezien het ontwerpen van een nieuw type array is noodzakelijk voor het analyseren van cel migratie van grotere cel structuren.

Het huidige platform maakt gebruik van minimale celaantal en kleine reagens volume, terwijl tegelijkertijd het verstrekken van de grootte van een grote steekproef (duizenden spheroïden per plaat). Om te analyseren 12 verschillende compounds voor anti-metastatische activiteit, zou 2 één 6-well HMCA gebaseerd platen nodig, de resultaten oplevert van ongeveer 5.000 spheroïden, terwijl ten minste vijftig 96-wells-platen nodig zou zijn om de dezelfde resultaten te bereiken. De mogelijkheid om het analyseren van de migratie op de resolutie van het individu-object in de HMCA biedt een hoge mate van statistische robuustheid en nauwkeurigheid, waardoor de studie van structurele en functionele invasie heterogeniteit in de talrijke spheroïden.

Deze studie toont uniek aan de collectieve invasie van borst kanker sferoïde bevolking bij de blootstelling aan DETA/nr. De cel clusters van MCF7 cellen Toon Wortelpotigen grote afstanden trekkende fenotype en kwantitatieve veranderingen in de morfologie en de locatie van elke sferoïde automatisch kunnen worden bereikt. Tot de beste van onze kennis is dit het eerste gekleed systeem dat monitoring en analyse van collectieve invasie in talrijke 3D structuren wordt vergemakkelijkt. Door het analyseren van de relatieve aanwijzingen en de invasie afstand voor elke sferoïde, is het mogelijk om te bestuderen van de wederzijdse interactie tussen spheroïden binnen de bevolking. Bovendien, wordt de gevestigde invloed van extracellulaire communicatie factoren op kanker cel gedrag28 hier geïllustreerd. Naast deze factoren, heeft de stijfheid en de samenstelling van de communicatie aangetoond dat de cel migratie sterk te beïnvloeden. HMCA-technologie zorgt voor een gedefinieerde, biomimetische, in vitro platform, waarbij deze eigenschappen voor het ECM kunnen worden gemakkelijk benaderd en gecontroleerd. De stijfheid van pure collageen type ik hydrogel op de concentratie van 3 mg/mL, die werd gebruikt in deze studie is gemeld dat ongeveer 50-600 Pa29,30,31 en de toevoeging van HA (20 µg/mL; 0,4 wt %) niet veranderen de stijfheid van de hydrogel aanzienlijk32,33. Dus, het onderdrukkende effect van gemiddeld molecuulgewicht (MMW)-HA op de invasie van 3D HeLa spheroïden, die werd aangetoond is hier niet als gevolg van veranderingen van de stijfheid. Deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies waaruit bleek een bimodaal effect van HA op kanker cel invasie met hoge afhankelijkheid van HA molecuulgewicht34,35,,36,,37.

Toekomstige toepassingen van de methoden omvatten naast elkaar multi cel type kweken van tumor en stromale cellen in verschillende regio's binnen de macro-well, en het ophalen van specifieke spheroïden voor downstream moleculaire analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door het legaat van Moshe Shimon en Judith Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5, (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16, (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, (1), 33 (2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752, (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8, (12), e82811 (2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7, (1), 10784 (2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6, (1), 35544 (2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9, (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7, (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (2), 21005 (2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16, (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8, (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6, (1), 31063 (2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6, (1), 14114 (2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12, (23), 5007 (2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19, (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10, (1), 15001 (2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5, (2), 29 (2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18, (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9, (7), e103502 (2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29, (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20, (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6, (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9, (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6, (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5, (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28, (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375, (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29, (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9, (1), 91-92 (2015).
Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).More

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter