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Cancer Research

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

doi: 10.3791/58359 Published: October 25, 2018

Summary

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Abstract

Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.

Introduction

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Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica1. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.

El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrado para ser muy costoso y no siempre representativa del tumor en los seres humanos. Por otra parte, la topología de microambiente extracelular, mecánica y composición afectan fuertemente cáncer célula comportamiento2. En vivo modelos intrínsecamente carecen de la habilidad de separar y controlar estos parámetros específicos que contribuyen a la invasión del cáncer y la metástasis, es necesario para biomiméticos controlable en vitro modelos.

Para metastatizar a órganos distantes, las células cancerosas deben exhibir rasgos fenotípicos invasivos y migratorios que pueden ser destinados a la terapia. Sin embargo, puesto que la mayoría en vitro modelos de cáncer no imitar las reales características de tumores sólidos3, es muy difícil detectar fenotipos fisiológicamente relevantes. Además, la heterogeneidad fenotípica que existe dentro del tumor, dicta la necesidad de analizar la migración del tumor en el solo elemento de resolución para descubrir terapias dirigidas por fenotipo, por ejemplo, apuntando a la celda de inicio de la metástasis población dentro de los tumores heterogéneos4.

El estudio de la motilidad celular y la migración colectiva se lleva a cabo principalmente en cultivos monocapa de células epiteliales en las superficies planas homogéneas. Estos modelos celulares convencionales de migración de la célula de cáncer se basan en el análisis de la población de células invasoras a través de las membranas y componentes de ECM5, pero en estos sistemas, las diferencias intrínsecas entre las células individuales no pueden ser estudió. Generación 3D esferoides mediante andamios o en micro-estructuras de andamio-libre se considera como un superior significa estudiar el tumor de la célula crecimiento y cáncer invasión6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los sistemas 3D no son adecuados a los formatos de alto rendimiento y esferoide entre interacción generalmente no puede lograrse desde esferoides individuales aisladas se generan en cada micro pozo9. Estudios recientes que involucran la migración del cáncer se basan en dispositivos microfluídicos3,10,11,12, sin embargo, estos sofisticación microfluídicos herramientas son difíciles de producir y no puede ser utilizado para alto rendimiento (HTS) de detección de drogas anti-invasivas.

Dos fenotipos principales, migración de la célula individual y colectiva, que juegan un papel en las células del tumor superando la barrera de ECM e invadiendo tejidos vecinos, han demostrado13,14, cada uno mostrando distintos morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares y genéticos. Además, dos formas de migración de las células de tumor, fibroblasto-como y ameboides, se observan en cada fenotipo. Desde ambos, fenotipos de invasión y modos de la migración, principalmente se definen por las características morfológicas, hay una necesidad para celulares modelos que permiten basado en proyección de imagen de detección y examen de todas las formas de invasión tumoral y la migración de las células.

El objetivo general del método actual es proporcionar un simple y reproducible biomiméticos 3D en vitro sistema basadas en células para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Aquí, presentamos la base de HMCA 6 imagen placa de pozos para la investigación de invasión del tumor y terapia anti-metastásica. La tecnología permite la formación de un gran número de esferoides tumorales 3D uniforme (450 por pozo) en una estructura de micro-cámaras (MC) de hidrogel. Varios componentes de la ECM se añaden a la matriz de esferoide para permitir la invasión de las células en el entorno. Proceso de invasión es continuamente supervisado por observación de corto y largo plazo de las mismas células esferoides individuales/invadiendo y facilita la caracterización morfológica, tinción fluorescente y recuperación de esferoides específicos en cualquier momento. Puesto que numerosos esferoides comparten espacio y medio, interacción a través de moléculas solubles entre esferoides individuales y su impacto el uno del otro es posible. Análisis de semi-automática de la imagen se realizan utilizando interno código MATLAB que permite la más rápida y eficaz recopilación de gran cantidad de datos. La plataforma facilita la medición precisa y simultánea de numerosas células esferoides/invadiendo de manera eficiente, permitiendo la proyección del rendimiento medio de los medicamentos de lucha contra la invasión.

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Protocol

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1. HMCA placa repujado

Nota: El proceso completo para el diseño y fabricación de sello de polidimetilsiloxano (PDMS) y HMCA imagen usada en este protocolo se describe en detalle en nuestros anteriores artículos15,16. El sello PDMS (forma negativa) se utiliza para realzar el HMCA (forma positiva) que consiste en aproximadamente 450 MCs por pozo (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, cada uno de los MCs tiene forma de una pirámide truncada de forma cuadrada boca abajo (altura: 190 μm, pequeña base: 90 μm μm x 90 y gran área de la base: 370 μm μm x 370). La placa HMCA se utiliza para la preparación y cultivo de esferoides 3D del tumor y después de eso, para ensayo de invasión. Por otra parte, un sello comercial podría utilizarse para la producción de HMCA.

  1. Preparar una solución de agarosa de fusión baja 6% (LMA). Introduzca el polvo de la LMA y el tampón de fosfato estéril salino (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) en un frasco de vidrio con un agitador magnético. Coloque la botella en una placa de calentamiento y agitar la solución durante el calentamiento a 80 ° C por unas horas hasta que se logre una solución uniforme. No la solución a 70 ° C hasta su uso.
  2. Calentar previamente el sello PDMS para 70 ° C en el horno. Mantener caliente hasta su utilización. Alternativamente, utilice una marca comercial y siga las instrucciones.
  3. Coloque las placas de comercial pozo 6-fondo de cristal en un baño seco precalentado a 75 ° C. Espere unos minutos hasta que la placa esté totalmente caliente.
  4. Vierta una gota (400 μL) de la LMA precalentado en la parte inferior del cristal de cada uno de los pozos de la placa. Coloque suavemente el sello PDMS precalentado sobre la caída de la agarosa. Incubar a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para la gelificación y la prerefrigeración. Incubar a 4 ° C por 20 min lograr la gelificación de agarosa completo. Luego, suavemente Retire el PDMS, dejando el gel de agarosa estampado con MCs.
    Nota: Este paso se realiza simultáneamente en todos los pozos.
  5. Colocar la placa realzada en una sistema equipado con lámpara ultravioleta (UV) de polimerización e incubar durante 3 minutos.
    Nota: Ahora la placa HMCA es esterilizado UV.
  6. Llenar los pozos de macro con PBS estéril para asegurar que se mantienen húmedos, luego cubra la placa, envuélvalo con parafilm y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
  7. Antes de usar, vaciar residuos de PBS de la placa HMCA. Lugar en la capilla biológica.

2. carga de células y formación esferoide

  1. Recoger las células como sigue: Retire Media todos de una monocapa de células de la placa 10 cm cultura, lavar dos veces con 10 mL de PBS para eliminar residuos de suero, añadir 5 mL de tripsina (previamente calentado a 37 ° C) e incube durante 3 min en la incubadora a 37 ° C. Luego, agitar la placa suavemente para asegurar el desprendimiento de la monocapa, añadir 10 mL de medio completo (previamente calentado a 37 ° C) y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta logra una suspensión homogénea. Centrifugar y lavar la suspensión con 15 mL de medio fresco, entonces, suspender en concentraciones apropiadas en el medio completo fresco.
  2. Suavemente la suspensión de células de carga (50 μL, 150-360 x 103 células/mL en medio, ~ 16 – 40 células por MC) en el HMCA y permitir a las células a asentarse por gravedad durante 15 minutos.
  3. Suavemente agregar 6-8 alícuotas de 500 μl de medio fresco (total 3-4 mL) en el borde de la parte inferior plástico macro-bien fuera de la matriz de anillo y de hidrogel.
  4. Incubar las células HeLa por 72 h y células MCF7 durante 48 h a 37 ° C y 5% CO2, en un ambiente humidificado para la formación de esferoides.

3. viabilidad detección por yoduro de propidio (PI) tinción

  1. Preparar una solución stock de PI (500 μg de PI por cada 1 mL de PBS). Mantener a 4 ° C durante aproximadamente 6 meses. Recién preparar una dilución de 1:2,000 (0.25 μg/mL), mediante la adición de 6 μl de caldo a 12 mL de medio completo sin rojo de fenol, la placa de la pozo 6 HMCA (2 mL por pozo).
  2. Transferencia de la placa HMCA con esferoides de 48-72 h, de la incubadora a la campana biológica. Retire todo medio del HMCA por la punta, apoyado en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel, dejando el depósito de la matriz llena de medio.
  3. Suavemente agregar 2 mL de dilución de PI de paso 3.1 a cada pocillo, la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien. Incube la placa HMCA por 1 h a 37 ° C y 5% CO2, en un ambiente humidificado. Continúe con el paso 7.
    Nota: Otros tintes podrían utilizarse aquí, así, por ejemplo, Hoechst para tinción del núcleo, tetramethylrhodamine metil éster (TMRM) para el potencial de membrana mitocondrial tinción fluoresceína diacetato (FDA) para la detección de células vivas, anexina V de apoptosis detección y otros.

4. preparación de la mezcla colágeno

  1. Preparar agua bidestilada estéril (DDW) por autoclave y un stock de 100 mL de solución de 1 M NaOH filtro esterilizado. Mantener los materiales en el RT y las puntas utilizadas para la preparación de la mezcla de colágeno congelado a-20 ° C, hasta su uso.
  2. 10 – 20 minutos antes de usar, coloque todos los intergrades incluyendo: DDW estéril, solución estéril de 1 M NaOH, estéril 10 x PBS, colágeno de cola de rata (almacenado a 4 ° C durante 3 – meses) y un tubo estéril de tipo I en el cubo de hielo hasta que enfríe totalmente. Coloque el cubo de hielo dentro de la campana biológica.
  3. Preparar 1.800 μl de mezcla de colágeno a una concentración final de 3 mg/mL, 6 bien placa de ensayo de invasión de HMCA (300 μL por pozo) como sigue. Añadir los intergrades en el tubo de enfriado en el siguiente orden: 515 μl de DDW, 24,8 μl de 1 M NaOH y 180 μl de PBS 10 x. Homogeneizar bien vortex y en el hielo. Por último, añadir μl de 1080 de colágeno a la mezcla, vortex nuevo y coloque en hielo.

5. HA y preparación de la mezcla de colágeno

  1. Disolver 10 mg de HA en 2 mL de DDW estéril. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante unos minutos y agitar suavemente hasta que el polvo se disuelva totalmente. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por dos años.
  2. Justo antes del uso, coloque la solución HA en el cubo de hielo dentro de la campana biológica.
  3. Preparar un 3 mg/mL de mezcla de colágeno como se describe en el paso 4. Añadir 36 μg (7.2 μL) de la HA en 1.800 μL de listo para usar mezcla de colágeno, para una concentración final de 20 μg/mL. Luego, mezclar otra vez brevemente y puesto en hielo.

6. Además de la mezcla ECM

  1. La placa HMCA, con esferoides de 48 – 72 h, la transferencia de la incubadora en la campana biológica y coloque en el hielo. Incubar por 10 min hasta que la placa se enfría. Caliente previamente una solución de 1% LMA a 37 ° C en un baño de agua.
  2. Quitar todo medio de alrededor de HMCA, inclinándose la punta en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel. Entonces, con mucho cuidado, saque medio todos el depósito de matriz con un fino gel punta carga punta, por la punta, apoyado en el borde de la matriz, lenta y suavemente chupar medio todo hacia fuera.
    Nota: Después de quitar todo medio de alrededor de la matriz de hidrogel, el depósito de matriz está lleno todavía de medio. Este medio tiene que ser eliminado muy suavemente para evitar destrucción de hidrogel MC y dislocación de esferoides.
  3. 150 μL de la mezcla de colágeno o colágeno y HA mezcla (mezcla de ECM) con la punta fina precongelada y añadir en el depósito de matriz colocando la punta en el borde de la matriz. Lanzamiento de la mezcla lentamente para evitar la dislocación del esferoide. Repita este paso con otra alícuota de 150 μL, para un total de 300 μL por pocillo. Siga el mismo procedimiento para cada bien hasta que todos los pozos están llenos. Luego coloque la placa en la incubadora durante 1 h para la completa gelificación del ECM.
  4. Después de que se ha logrado la completa gelificación del ECM, pipetee 400 μL de precalentado 1% LMA en la parte superior del gel de la ECM. Cubra la placa con su tapa, incubar la placa a temperatura ambiente durante 5-7 min y 2 min a 4 ° C, para la gelificación de agarosa. Finalmente, agregar 2 mL de medio completo suavemente por la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien.
    Nota: La capa de agarosa previene el desprendimiento de la matriz de gel de colágeno de la HMCA.

7. Análisis y adquisición de ensayo invasión

  1. Carga de la placa HMCA sobre un motor invertido platina del microscopio equipado con una incubadora, previamente ajustada a 37 ° C, 5% CO2 y ambiente humidificado.
  2. Averiguar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada uno así para cubrir la zona de toda serie y utilizan 10 X y objetivos de X 4 (este paso es necesario para el software de adquisición de imagen usado aquí, vea la Tabla de materiales abajo para más detalles). Como alternativa, utilice cualquier software de adquisición de imagen para facilitar la exploración automática de toda la zona requerida, seleccionando la opción"Stich" .
  3. Adquirir imágenes de campo claro (BF) cada 2-4 h durante un período total de 24-72 h para la invasión de las células del cuerpo esferoide en el ECM circundante.
  4. Adquisición de imágenes fluorescentes para la detección de PI utilizando un cubo fluorescente dedicado (filtro 530 – 550 nm de excitación, espejo dicroico 565 nm largo pase y emisión filtro 600-660 nm).
  5. Exportar imágenes BF/fluorescente Time-lapse desde el software de adquisición de imagen y guardarlos en formato de archivo de imagen etiquetado (TIFF) en una carpeta dedicada mediante la ficha "Base de datos" en la barra de herramientas y luego en el botón "Exportar archivos de registro" .
    Nota: Hemos desarrollado un código de análisis interno especial en el software MATLAB que incluye una interfaz de diseño gráfica de usuario (GUI) en que la invasión análisis podrían ejecutarse más rápido y más fácil. En este código de análisis, se realiza la segmentación de la zona de invasión y esferoides semiautomática utilizando filtro de Sobel, seguido de los operadores morfológicos de erosión y dilatación. Después de segmentación automática de las zonas, se hicieron correcciones manuales donde sea necesario para mejor precisión. Después de la terminación de la segmentación, un conjunto de parámetros fueron calculados por el software y automáticamente exportado a un archivo de excel para su manipulación posterior. La lista de parámetros son: área seccional esferoide básica en tiempo = 0, zona de invasión de las células conectado al cuerpo esferoide = zona de invasión principal, área de células separadas del área de invasión principal, número de células separadas del área de invasión principal, distancia media de invasión de esferoide básica centro de masa a la circunferencia de la zona de invasión principal y separado de las células y parámetro de distancia de invasión colectiva = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) de la Coordenadas X e Y esferoide centro de masa, antes (X1, Y1) y después (X2, Y2) proceso de invasión colectiva). Por otra parte, análisis de imagen podrían hacerse con cualquier otro software especializado.
  6. Abrir la interfaz gráfica y pulse el botón "carga BF" . Después de abierta la imagen, ajustar los parámetros de segmentación (tamaño mínimo: > 1 y radio cierran: > 1) para lograr una segmentación precisa de esferoide y su área de invasión, a continuación, pulsa el botón de "Región de segmentación de interés (ROI)" para la ejecución y aparece un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse el botón "Borrar" o "Agregar" y hacer las correcciones solicitadas manualmente. Repita los mismos pasos para las siguientes imágenes.
  7. Presione el botón "Seguimiento" a los esferoides y el software asignará al mismo número para cada esferoide en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. Luego, presione el botón de "Medición" , que generará una hoja de cálculo con todos los parámetros. Guarde esta hoja de cálculo como un archivo de excel para uso posterior en los resultados de procesamiento y estadísticas en excel software.

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Representative Results

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El único HMCA placa de la proyección de imagen se utiliza para el ensayo de invasión de esferoides tumorales 3D. El ensayo completo, comenzando con la formación esferoide y terminando con el proceso de invasión y manipulación adicional, se realiza en el mismo plato. Para la formación esferoide, células HeLa se cargan en la cuenca de la matriz y se instalan en el hidrogel MCs por gravedad. El hidrogel MCs, que tienen características de adherente/bajo sujeción, facilitar la interacción célula-célula y la formación de esferoides tumorales 3D. Figura 2A ilustra las células en el MCs, tras el uso de 150 x 103 células/mL, solución de carga (es decir., ~ 16 células por MC calcularon valor). Es claro que la ocupación de células por MC no se distribuye uniformemente a través de la matriz, y la distribución de la media estadística obtenidos 14,78 células ± 3.60 por MC. La tabla en la figura 2B Resumen la distribución de la célula por MC para la placa entera de HMCA. El promedio coeficiente de variación (CV) de la distribución de la célula dentro de un pozo de macro es 43.33%, mientras que entre los pozos de macro es 24.37%. Las diferencias en la ocupación de la célula son cruciales y dictan directamente el tamaño de esferoides formados y su homogeneidad a lo largo de la placa. Para disminuir/reducir al mínimo la variabilidad creada por el número de células por MC, se realiza el análisis de los resultados en el solo elemento de resolución. Las parcelas en la figura 2-D ilustran la distribución de tamaño (área) de esferoides de 3 días. Es claramente ejemplificado en la Figura 2D que calcular la relación de crecimiento de cada esferoide (área de la sección en día 3 día 2) tiene una distribución más homogénea que la distribución de tamaño absoluto (figura 2), rindiendo una CV de 15.48% y 52.80%, respectivamente. Distribución diamétrica de esferoide de esferoides 3 días produce un CV de 24,52% y el coeficiente de crecimiento (diámetro en day3/day2) es 7.45%. Estos valores de CV son similares a17 o mayor que18 otros informes celular logra carga por gravedad. Para eliminar la variación del parámetro medido resultante de la variabilidad en el número de células sembradas inicial por MC, es preferible para normalizar los parámetros seleccionados para el número de células inicial o cualquier otro parámetro medido del mismo objeto, tal que cada esferoide tiene su control interno. Este enfoque podría aplicarse fácilmente mediante el seguimiento del objeto en la placa de la proyección de imagen de HMCA.

El proceso de formación esferoide y el crecimiento podría ser fácilmente seguido en el HMCA placa de la proyección de imagen. Figura 3A-B muestra una imagen BF de una región en el HMCA placa que contiene agregados de células HeLa de 24 h la proyección de imagen y la imagen respectiva de maduros, 5día multicelulares objetos 3D, que son cada vez más esférica y más densa. Claramente se muestra que mayoría de los objetos conserva su ubicación durante el periodo de incubación de 5 días. El análisis de forma (esfericidad) y tamaño (área) durante la formación esferoide se presenta en la figura 3. El diagrama de dispersión muestra los aumentos en ambos parámetros desde el día 1 a día 5; 0.544 a.u. ±0.020 0.684± 0,016 a.u. de esfericidad (p < 0.05) y 0.00356± 0,00013 mm2 a 0.00538 ± mm 0,000152 para el área de la sección (p < 0.05), respectivamente. Mientras que 24 h agregados son pequeños y tienen forma no regular, los esferoides 5 días respectivos son más grandes y adquieren forma esférica.

La detección de la viabilidad celular de esferoide se ejecuta mediante el uso de baja concentración de PI para la tinción de19 que evita la necesidad de lavado del tinte. PI penetra la membrana de la célula y luego se intercala en el ADN de células no viables. Figura 4A muestra esferoides de HeLa 5 días teñidos con PI (en rojo). Análisis del porcentaje de zona roja (que representa las células muertas) de cada área de la sección de esferoide se resumen en la Figura 4B. El histograma muestra que 85% de la población de esferoide tiene un área de valor máximo del 5% rojo teñido y el promedio es de 3.01 ± 2.34% (histograma de la izquierda). Área seccional de esferoides (histograma de la derecha) muestra una distribución normal con media de 0.02447 ± 0,00487 mm2.

Después de producir esferoides de HeLa madurados 3 días, el ensayo de invasión se realiza en el HMCA placa de la proyección de imagen. El efecto de variables como la composición del ECM, inhibidores y activadores, en el proceso de invasión de tumor 3D esferoide podría ser examinado. Para un funcionamiento de ensayo de invasión, el medio suavemente es eliminado y reemplazado con pipeta de la solución de ECM en los esferoides en la cuenca de la matriz de MC. Después de la completa gelificación de la solución de ECM, medio completo se agrega en el macro bien. (1) a fin de examinar la influencia de la HA en el proceso de invasión espontánea del esferoide de HeLa, los esferoides se cubrieron con colágeno y HA mezcla solución (figura 5A) y en comparación con las cubiertas con única solución colágeno (figura 5), y Imágenes BF fueron adquiridos después de la gelificación de la ECM (t = 0 h). La cinética del proceso de invasión fue seguida por las mismas regiones cada 5 h la proyección de imagen para un período de 63 h. Después de 50 h de incubación, los esferoides incrustada en colágeno y HA (figura 5B) mostró menor dispersión de células en el ECM circundante en comparación con los esferoides en colágeno solamente (figura 5). El análisis de la zona de invasión cinético con el tiempo, para 99 esferoides con resolución de solo-esferoide se resume en la figura 5E. Figura 5E parcelas de la zona de invasión de la media/promedio en el tiempo de los dos grupos y demuestra claramente que la adición de HA a colágeno inhibe la dispersión de células de la esferoide, dando por resultado áreas más pequeñas de la invasión. El promedio de las pendientes resultantes de las curvas de ajuste de regresión lineal para cada uno de los esferoides encajados colágeno (± 0.001973 0,000894 mm2/h) en comparación con el colágeno y la solución de la HA (0.001410 ± 0,000941 mm2/h) son significativamente diferentes (p = 0,003, t-test: dos muestras suponiendo varianzas iguales). (2) para examinar la influencia de Fisetin (un flavonoide bioactivo encontrado en varias frutas y verduras que muestra actividades de citostáticos y migrastatic actuando sobre diversas dianas moleculares, incluyendo fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) / Akt/c-Jun N-terminal quinasas (JNK) señalización Wnt/β-catenina señalización algo metaloproteinasas de matriz (MMPs) y otros20) proceso de invasión espontánea de esferoide de HeLa, las concentraciones crecientes del fármaco añadidas al medio completo y Se adquirieron imágenes BF en t = 0 (figura 6A) y 24 h más tarde (Figura 6B-C). Como lo demuestra, 10 μm de Fisetin (figura 6) inhibe la dispersión de las células alrededor de los esferoides en comparación con los no tratados HeLa esferoides (Figura 6B). El análisis de la zona de invasión de un experimento de respuesta de dosis (figura 6) muestra inhibición significativa en 10-40 μm de Fisetin (p < 0.003), lograr saturación en la concentración de 10 μm y superiores. (3) se ha demostrado que NO, a un nivel de nano-molar, contribuye a un fenotipo más agresivo de cáncer de mama por tumor estimulante expansión y migración16. Con el fin de examinar la influencia del NO en el proceso de invasión colectiva de MCF7 esferoides en colágeno, 1 μm de donante de óxido nítrico/diethylenetriamine (DETA/NO) se añadió al medio de cultivo completo y BF se adquirieron imágenes en t = 0 y t = 20 h. dramático cambios en la morfología y localizaciones de la 3D esferoides durante la exposición a donantes NO son evidentes (Figura 7A-B). Los esferoides perder su esfericidad y ser más alargadas adquirir fenotipo migratorio ameboides. Concomitante, el mayor desplazamiento de los esferoides dentro de la matriz de colágeno circundante se observó (figura 7). El valor de la elongación media aumentado significativamente de 1.305 ± a.u. 0,193 a 1.477 ± 0,298 a.u., (p < 0.0006). La distancia de migración promedio medida por el mismo esferoides se extendió considerablemente, ± 0.0788 0,0575 mm y ± 0.3164 0,3365 mm en ausencia y en presencia de DETA/NO, respectivamente (p < 4 x 10-6).

Análisis de la imagen de la invasión de esferoide fue alcanzado por semiautomática en software MATLAB. Las imágenes de lapso de tiempo adquirido de invasión en el HMCA y formación esferoide consiste en esferoides numerosos en una sola imagen (esferoides de 4-6 a 10 aumentos y esferoides de 25-30 con 4 aumentos). Concomitantemente se realizó el análisis de formación esferoide, el crecimiento y la invasión de los esferoides en la imagen. Los parámetros clave para invasión de esferoide se presentan en la figura 8A, que muestra una segmentación de la imagen representativa de 4 esferoides en un solo momento (t = 16 h). El área de invasión principal definida por un borde rojo, así como las células separadas que desunido dispersadas alrededor de ella (indicado por las flechas negras), fueron rastreadas y numeradas para cada esferoide en el tiempo. Tamaño esferoidal antes de invasión en t = 0 se define por un borde azul. La distancia media/media invasión de esferoide centro de masa a la circunferencia de la zona de invasión incluyendo las células separadas es calculada a partir de la segmentación de red cercada e indicada por flechas amarillas. Datos extraídos de este time-lapse experimento se resumen en la figura 8B-D. Figura 8B muestra la elevación de la distancia de invasión media de cada centro del esferoide en el tiempo. Figura 8 muestra la elevación de la zona de invasión total en cada uno de los esferoides con el tiempo (incluyendo la zona de invasión principal y área de separados/desactivado-celular). Figura 8 1-4 muestra la magnitud del área de células separadas en comparación con el área de invasión total de cada esferoide (con el tiempo). El número acumulado de células desunidas es 33, 7, 4 y 5 de esferoides #1, #2, #3 y #4 respectivamente. El análisis acumulativo número de desvinculados células más de 20 h de la invasión de esferoides de HeLa 126 incrustado en colágeno se muestra en la figura 8E. Aquí está demostrado que existe una amplia distribución en el número de células desunidas en la población examinada y el valor promedio es de 12,3 ± 12,8 células.

Figure 1
Figura 1: HMCA la placa de la proyección de imagen. (A) imagen de un macro-bien realzado con HMCA. (B) sección transversal de un MC en el HMCA placa de la proyección de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: homogeneidad de la celular distribución y esferoide coeficiente del crecimiento en la placa de la proyección de imagen de HMCA. (A) un recubrimiento de BF e imágenes fluorescentes de HMCA cargado con células HeLa previamente teñidas con Hoechst 33342 1 μg/mL (concentración 150 x 103 células por mL de carga). Se adquirieron imágenes justo después del establecimiento de la célula en la ampliación de la imagen de MC. 4 X, barra de escala = 500 μm. (B) la tabla resume la distribución de las células HeLa dentro de la placa de proyección de imagen de HMCA-6-bien. Las células se contaron hasta 90 MC/macro-pozo. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar (SD), CV (SD/mean100) se calcula dentro de y entre los pozos de macro. (C) histograma de distribución del área seccional de esferoides de 3 días, números = 418, determinado a partir de imágenes BF. (D) histograma de distribución de la proporción de crecimiento del esferoide (área de la sección en día 3 día 2). Relación de crecimiento se calcula en el solo elemento de resolución para cada uno de los 418 esferoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: seguimiento formación esferoide en el HMCA placa de la proyección de imagen. Imagen BF de células HeLa (carga concentración 120 x 103 células por mL) se incubaron en el HMCA por (A) de 1 día y 5 días (B). Aumento 4 X, barra de escala de la imagen = 500 μm. Dispersión (C) parcela de esfericidad de objetos 3D en función de su área, después de 1 día (diamantes azules) y 5 días (cuadrados marrón) de incubación post célula de carga. Cada marcador representa los datos de un esferoide sola, n = 83. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: detección de la viabilidad celular en esferoides maduros. Imágenes fluorescentes de esferoides de 5 días (carga concentración 360 x 103 células por mL) y un recubrimiento de BF teñidos con PI 0.25 μg/mL (A). Aumento 4 X, barra de escala de la imagen = 500 μm. (B) histograma de distribución del porcentaje de área de PI en relación con el área de la sección del esferoide (panel izquierdo) y el histograma de distribución de área seccional (panel derecho), n = 84. Por ciento del área de PI se calcula en el solo elemento de resolución para cada uno de los 84 esferoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: influencia de la composición del ECM en el proceso de invasión de esferoide. Imágenes BF de esferoides de HeLa 3 días embebido en una mezcla de colágeno de 3 mg/mL y 20 μg/mL HA (A) y 3 mg/mL de colágeno (C), en t = 0 h y después de 50 h de incubación (B) y (D), respectivamente. Imagen de aumento 10 X, barra de escala = 200 μm. HMCA placa de la proyección de imagen cargada en el escenario del microscopio invertido, dotado de incubadora. Imágenes fueron adquiridas cada 5 h y el análisis cinético se presenta en parcela (E), n = 99. Cada curva representa la media ± SD de aumento del área de invasión en el tiempo, colágeno y HA (diamantes azules) y de colágeno solamente (los cuadrados marrones). Curva de regresión lineal promedio y su ecuación y el valor de R cuadrado están indicadas en las curvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Fisetin inhibe la invasión espontánea de esferoides HeLa. Imágenes BF de esferoides de HeLa de 3 días, embebido en una mezcla de colágeno de 3 mg/mL (A) en t = 0 y 24 h después de la adición de (B) de 0 μm y 10 μm Fisetin (C) al medio de cultivo completo. Aumento 4 X, barra de escala de la imagen = 500 μm. análisis del área de invasión para cada esferoide en punto final (t = 24 h) se presenta en parcela (D), n = 488. La curva representa la media ± SD del área de invasión en función de 0-40 μm Fisetin. Fisetin tratamiento inhibe significativamente la invasión en el μm 10 (P = 4,65 x 10-6), 20 μm (P = 0.0021) y 40 μm (P = 4.86 x 10-8), con t-test: dos muestras suponiendo varianzas iguales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: NO induce la invasión colectiva en esferoides de cáncer de mama MCF-7. Imágenes BF de 2 día MCF-7 senos esferoides de cáncer, encajados colágeno (A) a (t = 0) y (B) después de la exposición de 20 h a 1 μm DETA/no. Esferoide ROI segmentación es definido por el borde rojo, superpuesta y numerado en rojo en BF imágenes A y B. ROIs definidas por frontera azul, superpuesto en BF B representan esferoide tamaño y ubicación en t = 0. Aumento 4 X, barra de escala = 500 μm. (C) A dispersión parcela de la correlación entre la distancia de migración y factor de alargamiento de esferoides de cáncer de mama individual sobre la exposición a 1 μm DETA/NO (plazas marrón) como frente a control (diamantes azules) en t = 20 h, n = 54. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Análisis de imágenes de células HeLa invasión espontánea. Imágenes BF de esferoides de HeLa de 3 días, 16 h después de la incorporación de colágeno (A). Aumento 10 X. Área de invasión del esferoide y desvinculados de las células se definen por borde rojo, tamaño esferoidal en t = 0 se define por la frontera azul, invasión de media distancia de esferoide centro de masa se indica con flechas amarillas y desvinculados de las células se indican mediante flechas negras. Parcela el aumento en el tiempo de la distancia de invasión media de esferoide centro de masa (B) y área de invasión total (C). Las curvas representan esferoide #1 (diamantes azules), esferoide #2 (cuadrados marrón), esferoide #3 (triángulos verdes) y esferoide #4 (púrpura Xs). (D) Carta de la principal (azul) de la barra y separado aumento del área de invasión celular (marrón) con el tiempo. (E) histograma de la distribución del número acumulativo de células separadas por esferoide durante 20 h del proceso de invasión, n = 126. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas8 para el uso en el descubrimiento de fármacos estandarizados. Sin embargo, gran complejidad del modelo multicelular 3D significativamente pone en peligro su robustez, paralelización y análisis de los datos que son cruciales para la eficacia del ensayo.

Evaluación cuantitativa de la capacidad de invasión por lo general mide el movimiento de las células a través de materiales de hidrogel. Para medir la invasión del tumor usando placas de micro pozos tradicionales, grandes cantidades de células de cáncer son sembrados en ronda las placas inferiores y forzados a agregado por centrifugación21,22. Estas placas limitan interacción célula/esferoide en adyacentes a pozos, mientras que la parte inferior redonda obstruye la calidad óptica y complica la adquisición de la imagen. En otros métodos, las células individuales al azar encapsulan dentro del hidrogel, crecen y funcionan en un entorno 3D pero no se desarrollan necesariamente en esferoides maduras23,24. Por otra parte, procedimientos complicados para el posicionamiento de la célula dentro del hidrogel se requieren, como célula basada en la fuerza magnética patrones25 o la irradiación del laser de dos fotones de hidrogeles bioactivos26.

La tecnología basada en el HMCA presentada resulta ventajoso sobre los métodos anteriores: celular agregación espontánea, posicionamiento y creación de esferoides de algunas células dispersas puede ser fácilmente alcanzado, que permite el uso del valioso celular limitada muestra (por ej., cáncer vástago-como las células o células primarias derivados de muestras de los pacientes). El sistema tiene control sobre ambos la naturaleza de las células que componen los esferoides, así como sobre su ubicación espacial exacta durante experimentos de largo plazo. Además, el fondo plano del MC facilita la generación de esferoides numerosos en el mismo plano focal, por lo tanto, es posible, eliminando la necesidad de complicadas rápida adquisición de imagen e iluminación de grandes áreas a través de un microscopio de campo microscopia confocal desperdiciador de tiempo. El sistema es fácil de manejar y su sentido práctico factible. Mediante la aplicación de sencillos procedimientos operativos, hemos logrado alta ocupación de las poblaciones de esferoide en que aproximadamente el 50% de los esferoides con tamaño comparable y un análisis fiable de la capacidad de invasión de la célula de cáncer. Además, el efecto de fármacos sobre la capacidad de invasión puede analizarse simultáneamente con sus efectos citotóxicos o citostáticos mediante enfoque de análisis de contenido de alta junto con el dispositivo HMCA con esferoides numerosos. Por otra parte, en el HMCA, todos los elementos celulares comparten el mismo espacio y medio, lo que es posible investigar interacción esferoidal esferoide que generalmente está mediada por células secretan citocinas, quimiocinas, hormonas y el ECM27. Esta diafonía facilita la supervivencia y la función de racimos de célula pequeña de células individuales en el macro bien volumen.

Un paso crítico en la ejecución del protocolo es la adición de mezcla de ECM en la cima de los esferoides y validar su correcta polimerización. Los esferoides no mostrará comportamiento migratorio aunque están incrustados dentro de ECM, a menos que la Asamblea y cross-linking, y se forman las fibras de colágeno adecuada. Las fibras de colágeno pueden ser observadas por iluminación de BF, y recomendamos consultar la placa bajo un microscopio para confirmar la creación de fibras de colágeno al final de esta fase. Puesto que el número de esferoides es dependiente en la concentración celular inicial y el porcentaje de ocupados MCs, la matriz debe medirse después de la carga inicial de la célula y si ocupación de celular no es óptima, volver a sembrar de la misma matriz se puede realizar. De hecho, el tamaño y la geometría de HMCA descrito fueron diseñados para acomodar a grupos de células relativamente pequeñas (hasta 150 μm de diámetro). Esto podría considerarse una limitación ya que diseñar un nuevo tipo de matriz será necesario para el análisis de migración de la célula de las estructuras de célula más grandes.

La plataforma actual utiliza el numero de celular mínima y volumen pequeño reactivo, mientras que al mismo tiempo proporcionar un tamaño de muestra grande (miles de esferoides por placa). Para analizar 12 diferentes compuestos de actividad anti-metastásico, 2 placas HMCA base 6-bien solo se necesitarían que rinde los resultados de esferoides de 5.000, mientras que por lo menos cincuenta placas de 96 pocillos se necesitarían para alcanzar los mismos resultados. La capacidad de analizar la migración a individuo objeto de resolución en el HMCA proporciona un alto nivel de robustez estadística y exactitud, lo que permite el estudio de la heterogeneidad estructural y funcional de la invasión en esferoides numerosos.

Este estudio únicamente demuestra la invasión colectiva de poblaciones de esferoide de cáncer de mama con la exposición a DETA/NO. Los racimos de la célula de células MCF7 muestran fenotipo migratorio ameboides y cambios cuantitativos en la morfología y ubicación de cada esferoide pueden ser logrados automáticamente. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer sistema de matriz que facilita el seguimiento y análisis de invasión colectiva en numerosas estructuras 3D. Analizando la dirección relativa y la distancia de la invasión para cada esferoide, es posible estudiar la interacción mutua entre esferoides dentro de la población. Además, la influencia establecida de factores del microambiente extracelular en cáncer celular comportamiento28 se ilustra aquí. Entre estos factores, la rigidez y la composición del microambiente se ha demostrado que influyen fuertemente la migración de la célula. HMCA tecnología proporciona una definida, biomimética, en vitro la plataforma, en la que estas propiedades de la ECM se pueden fácilmente acceder y controladas. La rigidez de puro colágeno tipo I del hidrogel en la concentración de 3 mg/mL que se utilizó en este estudio, se divulga para ser aproximadamente 50-600 Pa29,30,31 y la adición de HA (20 μg/mL; 0,4% en peso) no cambió la rigidez de la hidrogel significativamente32,33. Así, el efecto supresor de mediano peso molecular (SMM)-HA en la invasión de esferoides de HeLa 3D que fue demostrada aquí no es debido a los cambios de rigidez. Estos resultados concuerdan con estudios previos que demostraron un efecto bimodal de HA en invasión celular de cáncer con alta dependencia HA peso molecular34,35,36,37.

Futuras aplicaciones de los métodos incluyen al lado de multi celulares tipo cultivo de tumor y células del estroma en las diferentes regiones dentro de la macro-bien y recuperación de esferoides específicos para posterior análisis molecular.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por el legado de Moshe Shimon y Judith Weisbrodt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

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Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas
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