Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58359
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Bar-Ilan University

Summary

HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.

Abstract

Kanser metastaz kanser ölümcül % 90'ı neden olduğu bilinmektedir. Metastaz tümör hücreleri penetrasyon/işgali ile komşu dokusuna başlatır çok aşamalı bir süreçtir. Böylece, istila istila işlem araştırma ve geliştirme Anti-metastatik ilaçların son derece önemli hale metastaz içinde önemli bir adımdır. Bu talebi adrese, solid tümör mimarisini taklit 3D vitro modellerinin geliştirilmesi için bir ihtiyaç olduğunu ve onların microenvironment vivo içinde devlet bir yandan ama aynı zamanda en yakın için tekrarlanabilir, sağlam ve uygun yüksek verim ve yüksek içerik ölçümleri. Şu anda, çoğu işgal deneyleri yeterli olan sofistike mikrosıvısal teknolojileri yalın araştırma için ancak yüksek hacimli uyuşturucu tarama için. Her iyi izole bireysel pulcuklarının ile plaka tabanlı cihazlar kullanarak diğer deneyleri malzeme tüketen ve koşul başına düşük örnek boyutu var. Geçerli protokol amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D hücre tabanlı sistem sağlamaktır. HMCA görüntüleme plaka tümör işgali ve Anti-metastatik ilaç keşfi araştırma için temel işgali tahlil için 3B modeli geliştirdik. Bu cihaz ise sürekli olarak ve aynı anda gözlemlemek ve orta için tek öğe çözünürlükte pulcuklarının ölçme ECM bileşenleri tarafından çevrili sayısız Tekdüzen pulcuklarının iyi (koşul başına yüksek örnek boyutu) başına üretimi sağlar üretilen iş Anti-metastatik uyuşturucu testi ile taranması. Bu platform burada tek hücre ve toplu istilası örnekli için HeLa ve MCF7 pulcuklarının üretim tarafından sunulan. HeLa pulcuklarının çevreleyen kollajen invaziv kapasitesini ECM bileşen hyaluronik asit (HA) etkisini karşılaştırın. Son olarak, biz Fisetin (Invasion inhibitörü) HeLa pulcuklarının ve nitrik oksit (NO) (Invasion harekete geçirmek) MCF7 pulcuklarının için tanıtın. Sonuçlar çok parametreli muayene kolaylaştırır yarı otomatik, basit ve hızlı analiz sağlayan kurum içi yazılım tarafından incelenir.

Introduction

Kanser ölüm esas olarak uzak konumlara metastatik hücreleri yayılması atfedilir. Kanser tedavisinde birçok çabaları hedefleme veya metastatik kolonileri oluşumu ve sistemik metastatik hastalık1ilerlemesini engelleyen odaklanmak. Kanser hücre göç tümör metastazı işleminde önemli bir adımı, böylece, kanseri istila cascade araştırma çok önemli ve bir Anti-metastatik tedavi bulmak için ön koşul.

Metastatik hastalık çalışmak için araçlar olarak hayvan modelleri kullanımını çok pahalı ve değil her zaman temsilcisi insanlarda tümör olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, hücre dışı microenvironment topoloji, mekanik ve kompozisyon güçlü kanser hücre davranış2etkiler. Vivo modelleri doğal olarak ayırmak ve kanser işgali ve metastaz için katkıda bulunmak gibi belirli parametreleri denetlemek için yetenek eksikliği olduğu kontrol edilebilir biomimetic vitro modelleri için bir ihtiyaç.

Uzak organlara metastaz için kanser hücrelerinin tedavi için hedeflenen göçmen ve invaziv fenotipik özellikleri sergilemek gerekir. Çoğu vitro kanser modelleri solid tümör3gerçek özelliklerini taklit değil, ancak, fizyolojik ilgili fenotipleri tespit etmek çok zor çünkü. Buna ek olarak, içinde tümör, var fenotipik heterojenite dikte tümör geçiş tek öğe çözünürlükte metastaz başlatılıyor hücre hedefleyerek terapiler, örneğin, fenotip yönetmen bulmak için analiz etmek için ihtiyaç Türdeş olmayan tümörler4içinde nüfus.

Hücre hareketliliği ve toplu geçiş çalışma öncelikle monolayer kültürler homojen düzlemsel yüzeylerde epitel hücrelerinin yürütülmektedir. Bu klasik hücresel modellere kanser hücre geçiş için tek tek hücrelere membranlar ve ECM bileşenleri5işgal nüfus analizi temel alır ancak tür sistemlerde, tek tek hücreler arasındaki içsel farklılıklar olamaz okudu. İskele üzerinden veya iskele-Alerjik mikro-yapıların olarak kabul edilir olarak üstün bir tümör çalışmaya anlamına gelir getirici 3D pulcuklarının işgali6,7,8büyüme ve kanser hücre. Ancak, 3D sistemleri en yüksek işlem hacmi biçimlerine uygun değildir ve izole bireysel pulcuklarının her Mikro-Evet9' da üretilen bu yana arası küresel etkileşim genellikle elde edilemez. Son çalışmalar kanser geçiş içeren mikrosıvısal aygıtları3,10,11,12dayalı, ancak, bunlar araçlar üretmek zordur ve cant mikrosıvısal sofistike (HTS) Anti-invaziv ilaçların eleme yüksek üretilen iş için kullanılabilir.

Tümör hücreleri ECM bariyer üstesinden bir rol oynamaktadır ve komşu doku istila gösterdiği13,14her farklı görüntüleme, morfolojik olmuştur iki ana fenotipleri, kolektif ve bireysel hücre göç, Özellikleri, biyokimya, moleküler ve genetik mekanizmaları. Buna ek olarak, geçirme tümör hücreleri, fibroblast benzeri ve protozlar, iki türde her fenotip gözlenir. Her ikisi de beri işgal fenotipleri ve geçiş modları, özellikle morfolojik özelliklerine göre tanımlanır, cep için bir ihtiyaç bu etkinleştir görüntüleme tabanlı algılama modelleri ve tümör işgali ve geçirdiğiniz her türlü incelenmesi hücreleri.

Geçerli yöntem genel amacı işgal kapasitesi tümör pulcuklarının büyük nüfus analizi için bir basit ve tekrarlanabilir biomimetic 3D vitro hücre tabanlı sistem sağlamaktır. Burada, HMCA tabanlı 6-iyi görüntü plaka tümör işgali ve Anti-metastatik terapi araştırma için tanıtmak. Teknolojisi, tek tip 3D tümör pulcuklarının (450 başına iyi) hidrojel mikro-Odalar (MC) yapısında çok sayıda oluşumunu sağlar. Çeşitli ECM bileşenleri hücreleri istila çevresini içine etkinleştirmek için küresel dizisine eklenir. İstila işlemi sürekli olarak kısa ve uzun vadeli gözlem aynı bireysel pulcuklarının/istila hücre tarafından izlenir ve morfolojik karakterizasyonu, floresan boyama ve herhangi bir noktada belirli pulcuklarının alınmasını kolaylaştırır. Bu yana çok sayıda pulcuklarının alanını ve orta paylaşır, bireysel pulcuklarının ve bir başka etkileri arasında çözünen molekülleri ile etkileşimi mümkündür. Yarı otomatik görüntü analizi daha hızlı ve daha verimli koleksiyonu büyük miktarda veri sağlayan kurum içi MATLAB kod kullanarak gerçekleştirilir. Platform orta üretilen iş tarama anti-Invasion ilaçların izin zaman verimli bir şekilde çok sayıda pulcuklarının/istila hücrelerinin doğru eş zamanlı ölçüm kolaylaştırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HMCA plaka kabartma

Not: Ayrıntılı olarak bizim önceki makaleler15,16tasarım ve imalat polydimethylsiloxane (PDMS) damga ve bu protokol için kullanılan HMCA görüntüleme plaka için tam işlemi açıklanmıştır. PDMS damga (negatif şekli) iyi (Şekil 1A) başına yaklaşık 450 MCs oluşur (pozitif şekli) HMCA kabartma için kullanılır. Şekil 1Badımında gösterildiği gibi her birinin MCs kare şeklinde kesilmiş bir ters piramit şeklinde vardır (Yükseklik: 190 µm, küçük temel alan: 90 µm x 90 µm ve geniş taban alanı: 370 µm x 370 µm). HMCA plaka hazırlık ve 3D tümör pulcuklarının kültür ve bundan sonra istila tahlil için kullanılır. Alternatif olarak, ticari bir damga HMCA üretimi için kullanılabilir.

  1. % 6 düşük erime özel (LMA) çözeltisi hazırlamak. LMA toz ve steril fosfat tamponlu tuz (PBS) (PBS 10 mL başına LMA 0.6 g) ile bir manyetik karıştırıcı bir cam şişe içine yerleştirin. Şişeyi bir Isıtma tabağa yerleştirin ve çözüm ile 80 ° C Isıtma için Tekdüzen bir çözüm elde kadar bir kaç saat süre karıştırın. Çözüm 70 ° C kadar kullanmak tutun.
  2. 70 ° c fırında PDMS damga ön ısı. Kadar kullanmak sıcak tut. Alternatif olarak, ticari bir damga kullanın ve izlemek belgili tanımlık öğretim.
  3. 75 ° C'ye önceden ısıtılmış kuru banyo ticari 6-şey cam-alt tabak yerleştirin Plaka tamamen sıcak kadar birkaç dakika bekleyin.
  4. Bir damla (400 µL) önceden ısıtılmış LMA cam alt plaka wells her biri üzerine dökün. Yavaşça önceden ısıtılmış PDMS damga üzerinde özel açılan yer. (RT) Oda sıcaklığında 5-10 dk önceden uyuyor ve ön soğutma için kuluçkaya. Tam özel jelleşme ulaşmak 20 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Sonra yavaşça MCS'ye desenli özel jel bırakarak PDMS akasındaki.
    Not: Bu adım tüm wells aynı anda yapılır.
  5. Ultraviyole (UV) lamba ile donatılmış sistemi kür bir ışık kabartma tabak yerleştirin ve 3 dakikadır kuluçkaya.
    Not: Şimdi HMCA sterilize UV plakadır.
  6. Makro-wells onlar nemli, tutulur sonra plaka kapak, parafilm ile sarın ve 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak emin için steril PBS ile doldurun.
  7. Önce kullanma, PBS kalanlar HMCA plaka boş. Biyolojik mahallede yerleştirin.

2. yük hücreleri ve küresel oluşumu

  1. Hücreleri aşağıdaki gibi toplamak: tüm Orta 10 cm kültür plaka hücre monolayer kaldırmak için iki kez 10 mL serum kalanlar imha etme, 5 mL (37 ° C için önceden ısındı) tripsin de eklemek ve kuluçka 37 ° C'de 3 min için kuluçkaya PBS ile yıkayın Sonra yavaşça monolayer dekolmanı sağlamak, homojen hücre süspansiyon elde kadar tam orta (37 ° C için önceden ısındı) ve pipet yukarı ve aşağı 10 mL eklemek için plaka sallamak. Santrifüj kapasitesi ve hücre süspansiyon 15 mL taze orta ile yıkayın, sonra taze tam orta uygun konsantrasyonlarda askıya alma.
  2. Yavaşça hücre süspansiyon yük (50 µL, 150 – 360 x 103 hücre/mL orta, ~ 16-40 hücreleri MC) HMCA üstüne ve hücreleri yerçekimi tarafından 15dk için yerleşmek için izin verir.
  3. Yavaşça halka ve hidrojel dizi dışında makro-şey plastik alt kenarında 6 – 8 aliquots 500 µL taze Orta (Toplam 3-4 mL) ekleyin.
  4. 72 h için HeLa hücreleri ve MCF7 hücreleri pulcuklarının oluşumu için oksijen bir atmosferde 37 ° C ve % 5 CO2, 48 h için kuluçkaya.

3. canlılığı algılama Propidium boyama iyodür (PI) tarafından

  1. PI stok çözeltisi hazırlamak (PBS 1 mL başına PI sayısının 500 µg). 4 ° C'de yaklaşık 6 ay için devam et. Taze 1:2,000 (0,25 µg/mL), seyreltme stokunun tam orta fenol red, olmadan 12 ml 6 µL eklenmesiyle 6-şey HMCA plaka (iyi başına 2 mL) için hazır olun.
  2. 48-72 h pulcuklarının, HMCA plakalı kuluçka biyolojik hood için transfer. Tüm Orta hidrojel dizi yanında makro-şey plastik alt kenarına ipucu son eğilim tarafından HMCA kaldırmak için dizi tank bırakarak orta ile dolu.
  3. Yavaşça PI seyreltme 2 mL adım 3.1 her şey için makro-şey plastik alt kenarında ipucu son eğilim tarafından ekleyin. HMCA plaka 1 h 37 ° C ve % 5 CO2,'de oksijen bir atmosfer için kuluçkaya. Adım 7 ile devam edin.
    Not: Diğer boyalar burada de, örneğin, Höchst çekirdeği boyama için kullanılabilir tetramethylrhodamine metil ester (TMRM) boyama, floresein diacetate (FDA) canlı hücreleri algılama, Annexin V apoptosis için mitokondrial membran potansiyeli için algılama ve diğerleri.

4. kollajen karışım hazırlama

  1. Steril Çift Kişilik distile su (DDW) basınçlı kap ve 100 mL 1 M NaOH çözeltisi filtre sterilize stokunun tarafından hazırlayın. RT ve kollajen karışım hazırlama-20 ° C'de dondurulmuş kadar kullanmak için kullanılan ipuçları malzemeleri korumak.
  2. 10-20 dk kullanmadan, yer de dahil olmak üzere tüm alanı: steril DDW, 1 M NaOH steril çözüm, steril 10 x PBS, tip ı buz tamamen soğutmalı kadar kova içine kollajen sıçan kuyruk (3-ay 4 ° C'de depolanan) ve steril bir tüp. Buz kovası biyolojik kapağın içine yerleştirin.
  3. 3 mg/mL, son bir konsantrasyon, kollajen karışımı 1.800 µL 6-şey HMCA işgali tahlil plaka (iyi başına 300 µL) aşağıdaki gibi hazırlamak. Alanı soğutmalı tüp içine aşağıdaki sırayla ekleyin: DDW, 1 M NaOH 24.8 µL ve 10 x PBS 180 µL 515 µL. Girdap ve yer tarafından iyi karışımı buz içine geri. Son olarak, 1080 µL kollajen girdap tekrar karışıma ekleyin ve buz geri koy.

5. HA ve kollajen karışım hazırlama

  1. HA 10 mg 2 ml steril DDW geçiyoruz. Toz tamamen eriyene kadar RT karisimin yavaşça birkaç dakika ve girdap için kuluçkaya. 4 ° c hisse senedi çözüm için iki yıla kadar saklayın.
  2. Şu kullanmadan önce biyolojik başlık içinde buz kovası HA hisse senedi çözüm yerleştirin.
  3. 3 mg/mL adım 4'te açıklandığı gibi kolajen karışımı hazırlayın. 36 µg (7,2 µL) HA kollajen karışımı, 20 µg/mL nihai bir konsantrasyon için kullanıma hazır 1.800 μL içine ekleyin. O zaman, tekrar kısaca girdap ve buz içine geri koy.

6. ECM karışımı ek

  1. 48-72 h pulcuklarının, HMCA plakalı kuluçka biyolojik kapağın içine aktarmak ve buz üzerinde yerleştirin. Plaka soğutmalı kadar 10 dakikadır kuluçkaya. % 1'lik bir çözüm ön ısı LMA 37 ° c su banyosu içinde.
  2. HMCA, çevresinde tüm Orta hidrojel dizi yanında makro-şey plastik alt kenarına ipucu son eğilim tarafından kaldırın. Sonra çok dikkatli, tüm Orta dizi tankından iyi bir ipucu/jel uç, nazikçe ve yavaşça dışarı tüm Orta emme dizi kenar uç uç yaslanmış tarafından yükleme ile kaldırın.
    Not: tüm ortamından hidrojel dizi çevresinde kaldırdıktan sonra dizi tank hala orta ile doludur. Bu orta çok yavaşça hidrojel MC imha ve çıkık pulcuklarının önlemek için kaldırılması gerekir.
  3. Kollajen karışımı veya HA ve kollajen karışımı (ECM karışımı) 150 µL önceden dondurulmuş ince ucu ile alıp dizi kenar için belgili tanımlık uç ekleyerek dizi tank içine ekleyin. Yayın karışımı yavaş yavaş küresel çıkığı kaçının. Toplam 300 µL iyi ücret için 150 µL, başka bir aliquot ile bu adımı yineleyin. Bütün wells doldurulur kadar her şey için aynı yordamı izleyin. Sonra da kuluçka ECM tam jelleşme için 1 h için plaka yerleştirin.
  4. ECM tam jelleşme elde sonra önceden ısıtılmış %1 400 µL pipet LMA ECM jel üstüne. Kapak kapağı ile plaka, plaka RT, 5-7 dakika ve sonra özel jelleşme için 4 ° C'de 2 min için kuluçkaya. Son olarak, yavaşça 2 mL tam orta makro-şey plastik alt kenarında ipucu son eğilim tarafından ekleyin.
    Not: Özel katman HMCA kollajen-jel matris dekolmanı engel olur.

7. Invasion tahlil toplama ve Analizi

  1. Mikroskop sahne 37 ° C, %5 CO2 ve oksijen atmosferi için önceden ayarlanmış bir kuluçka ile donatılmış yük bir motorlu HMCA tabağa ters.
  2. Pozisyonlar her resim alma için tüm dizi alanı kapsayacak şekilde iyi ve 10 X veya 4 X hedefleri kullanıp önceden belirler (Bu adım burada kullanılan görüntü alma yazılımı için gereklidir, Ayrıntılar için aşağıdaki Malzemeler tablo bakınız). Alternatif olarak, seçerek tüm gerekli alanı otomatik olarak taranmasını kolaylaştırmak için herhangi bir görüntü alma yazılımı kullanın "Dikiş" seçeneği.
  3. Parlak alan (BF) görüntüleri her 2-4 h 24-72 saat toplam süre için hücreleri işgali çevreleyen ECM küresel vücut izleyebilmek için elde etmek.
  4. Floresan görüntüler PI algılama için adanmış bir floresan küp (uyarma filtre 530-550 nm, Dikroik ayna 565 nm uzun pas ve emisyon Filtre 600 – 660 nm) kullanarak elde.
  5. Görüntü alma yazılımı hızlandırılmış BF/floresan görüntüleri dışa aktarmak ve onları etiketli görüntü dosyası biçimi (TIFF) "Veritabanı" sekmesini araç ve sonra "Bu dosyaların kaydını tut dışa aktar" düğmesini kullanarak özel bir klasöre kaydedin.
    Not: Hangi işgal analiz daha hızlı ve kolay yürütülebilir bir tasarlanmış grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içerir MATLAB yazılım özel kurum içi analiz kodda geliştirdik. Bu analiz kodu pulcuklarının ve işgal alanı ayrılmasını yarı otomatik olarak morfolojik işleçleriyle erozyon ve genişleme takip Sobel filtre kullanılarak gerçekleştirilir. Sonra otomatik bölümleme alanların daha iyi doğruluk için gerektiğinde el ile düzeltmeler yapılmıştır. Segment oluşturma tamamlandıktan sonra parametreleri kümesini otomatik olarak yazılım tarafından hesaplanan ve daha fazla işleme için bir excel dosyası ihraç. Parametre listesi vardır: temel küresel kesit alanı zaman = 0, küresel vücuda bağlı hücre işgal alanı = ana işgal alanı, alan ana işgal alanında, ayrılmış hücre hücre sayısı ayrılmış ana işgal alanında, ortalama mesafe yaratıklardan kütlenin temel küresel merkezi çevresi için ana işgal alanı ve ayrı hücreleri ve toplu işgali mesafe parametre = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) dışarı-in Küresel center of kütle X ve Y koordinatları, daha önce (X1, Y1) ve sonra (X2, Y2) toplu işgal işlem). Alternatif olarak, görüntü analizi diğer özel yazılım ile yapılabilir.
  6. GUI açın ve "yük BF" düğmeye bas. Görüntü açıldıktan sonra segmentasyon parametrelerini ayarlamak (en küçük boyut: > 1 ve RADIUS kapatın: > 1) kesin bir bölümleme küresel ve onun işgal alanı elde etmek için sonra "Faiz (ROI) bölümleme bölge" düğmesine çalıştırılmak üzere basın ve Her küresel bir kenarlık görünür. Otomatik ayrılmasını doğru değilse, "Sil" veya "Ekle" düğmesine basın ve istenen düzeltmeleri el ile yapın. Sonraki görüntüler için aynı adımları yineleyin.
  7. Pulcuklarının numaralandırmak için "İzleme" düğmesine basın ve yazılım her küresel her zaman atlamalı görüntüleri için aynı numarası atar. Ardından, tüm parametreleri içeren bir elektronik tablo oluşturur "Ölçü" butonuna basın. Bu elektronik tablo sonuçlarında işleme daha fazla kullanılmasını ve excel yazılımı istatistik için bir excel dosyası olarak kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plaka Imaging benzersiz HMCA 3D tümör pulcuklarının işgali tahlil için kullanılır. Küresel oluşumu ile başlayan ve işgal işlem ve ek manipülasyonlar, ile biten tüm tahlil aynı tabak içinde gerçekleştirilir. Küresel oluşumu için HeLa hücreleri dizi Havzası yüklenir ve yerçekimi tarafından hidrojel MCs yerleşmek. Sigara-yapışık/düşük ek özelliklere sahip, MCs hidrojel hücre-hücre etkileşim ve 3D tümör pulcuklarının oluşumunu kolaylaştırır. Şekil 2A 150 x 103 hücre/mL çözüm yükleme kullanımını takip MCs içinde yerleşmiş hücreleri gösterir (i.e., MC başına ~ 16 hücreleri hesaplanan değeri). Bu hücre, MC başına oda eşit olarak dizi aracılığıyla dağıtılır değil ve ortalama elde edilen istatistik dağılımın MC başına 14,78 ± 3,60 hücre olduğu açıktır. Şekil 2B tabloda bütün HMCA plaka MC başına hücre dağıtıma özetler. Makro-wells arasında %24.37 olmakla varyasyon (CV) bir makro-kuyu içinde hücre dağılımının ortalama katsayısı %43.33 olduğunu. Hücre doluluk farklılıkları açısından büyük önem taşıyor ve doğrudan pulcuklarının kurdu ve onların homojenliği plaka boyunca boyutu dikte. MC başına hücre sayısı tarafından oluşturulan değişkenliği azaltmak/en aza indirmek için sonuçları analiz tek öğe çözünürlükte gerçekleştirilir. Şekil 2C-D araziler 3 günlük pulcuklarının boyutu (kesit alanı) dağılımı gösterir. Açıkça her küresel (gün 3/gün 2 kesit alanı) büyüme oranını hesaplamak bir CV %15.48 ve %52.80 verimli bir daha homojen dağılımı mutlak boyutu dağılımı (Şekil 2C), daha gösterir Şekil 2B örneklenir, anılan sıraya göre. 3 günlük pulcuklarının küresel çapı dağılımı bir CV %24.52 verimleri ve büyüme oranı (day3/day2, çapı) %7,45 olduğunu. 17 benzer veya daha yüksek kazanma hücre yerçekimi tarafından yükleme18 diğer raporları daha bu CV değerlerdir. İlk numaralı seribaşı cep numarası MC başına değişkenlik kaynaklanan ölçülen parametre farkı ortadan kaldırmak için seçili parametre ilk cep numarası veya diğer ölçülen parametresi aynı nesnenin normalleştirmek için tercih edilir gibi Her küresel onun iç kontrol var. Bu yaklaşım, HMCA görüntüleme plaka üzerinde nesneyi takip ederek kolayca uygulanabilir.

Küresel oluşumu ve büyüme sürecinin kolayca plaka Imaging HMCA takip edilebilir. Şekil 3A-B bölgeyle bir BF görüntüsünü HMCA üzerinde plaka 24 h HeLa hücre toplamları içeren görüntüleme gösterir ve ilgili görüntü Olgun, daha küresel ve daha yoğun hale gelmektedir 5-gün 3D çok hücreli nesneleri. Bu nesnelerin çoğu 5 günlük kuluçka döneminde konumlarını korumak açıkça gösterilir. Şekil (Küresellik) ve boyutu (kesit alanı) küresel oluşumu sırasında Analizi Şekil 3 ciçinde sunulur. Dağılım çizim her iki parametre artışlar 1 günden 5 gün gösterir; 0.544 ±0.020 yapıyordum 0.684± Küresellik (p < 0,05) için 0,016 yapıyordum ve 0.00356± 0.00013 mm2 ile 0.00538 ± 0.00015 mm2 kesit alanı (p < 0,05), anılan sıraya göre. 24-h toplamları küçük ve düzenli olmayan şekli var, anılan sıraya göre 5 günlük pulcuklarının büyüktür ve küresel formu elde.

Küresel hücre canlılığı tespiti boya yıkama ihtiyacını circumvents19 boyama için düşük konsantrasyon PI kullanılarak yürütülür. PI hücre zarı nüfuz eder ve sigara-hücrelerin DNA'sı intercalates. Şekil 4A (kırmızı) ile PI lekeli 5 gün HeLa pulcuklarının gösterir. (Ölü hücreleri temsil eden) kırmızı alanı dışında her küresel kesit alanı yüzdesini analizini Şekil 4B' özetlenir. Histogram küresel nüfusun % %85 5 kırmızı lekeli maksimal değeri alana sahiptir ve ortalama 3.01 olduğunu gösterir ± %2,34 (sol çubuk grafik). Kesit alanını pulcuklarının (doğru çubuk grafik) ortalama 0.02447 ± 0.00487 mm2ile bir normal dağılım gösterir.

3 günlük olgun HeLa pulcuklarının üreten sonra istila tahlil plaka Imaging HMCA içinde gerçekleştirilir. ECM kompozisyon, inhibitörleri ve aktivatörleri, gibi değişkenleri etkisi 3D tümör küresel işgal işlem muayene. İstila tahlil performans için orta hafifçe kaldırılır ve ECM çözümü pipet ile pulcuklarının MC dizi Havzası değiştirilir. ECM çözümü tam jelleşme sonra tam orta makro-kuyunun içine eklenir. (1) HA etkisi HeLa küresel spontan işgali sürecinde incelemek için pulcuklarının kollajen ve HA karışım çözüm (Şekil 5A) ile kaplı ve bu kollajen tek çözüm (Şekil 5C) ile kaplı karşılaştırıldığında ve BF görüntüleri şu ECM jelleşme sonra elde (t = 0 h). Kinetik saldırı sürecinin aynı bölgeleri her 5 h 63 h bir süre için Imaging tarafından izledi. Sonra 50 h, kuluçka pulcuklarının kolajen gömülü ve HA (Şekil 5B) ile karşılaştırıldığında sadece (Şekil 5 d) kolajen gömülü pulcuklarının çevreleyen ECM içine alt hücre dağılım gösterdi. İşgal alanı tek-küresel çözünürlükte 99 pulcuklarının için zaman içinde kinetik Analizi Şekil 5Eiçinde özetlenir. Şekil 5E demek/ortalama işgal alanı iki grup zamanla çizer ve açıkça HA ayrıca kollajen için küresel dışında hücre dağılım engeller daha küçük işgal alanlarda ortaya çıkan gösteriyor. Doğrusal regresyon ayarlama eğriler kollajen (0.001973 ± 0.000894 mm2/h) gömülü pulcuklarının herbiri için kollajen ve HA çözüm (0.001410 ± 0.000941 mm2/h) ile karşılaştırıldığında ortaya çıkan yamaçları ortalama vardır önemli ölçüde farklı (p = 0,003, t-test: eşit Varyanslar varsayarak iki örnek). (2) Fisetin etkisini incelemek amacıyla (biyoaktif flavonoid bulundu çeşitli meyve ve sebze phosphatidylinositol 3-kinaz (PI3K) de dahil olmak üzere birden çok moleküler hedef üzerinde hareket ederek sitostatik ve migrastatic faaliyetleri gösteren/Akt/c-Haziran N-terminal sinyal kinaz (JNK) ve Wnt/β-catenin sinyal downregulates matriks metalloproteinazların (MMPs) ve diğerleri20) HeLa küresel spontan işgali süreci, ilaç artan konsantrasyonları tam orta olarak eklenmiştir ve BF görüntüleri t elde = 0 (Şekil 6A) ve 24 saat sonra (Şekil 6B-C). Gösterildiği gibi Fisetin (Şekil 6C) 10 µM hücrelerin etrafında pulcuklarının olmayan tedavi HeLa pulcuklarının (Şekil 6B) göre dağılımını engeller. Bir doz yanıt deneyi (Şekil 6D) işgal alanı analizini doygunluk konsantrasyonu 10 µM ve daha yüksek ulaşmak önemli inhibisyonu, 10-40 µM Fisetin (p < 0,003), sergiler. (3) bu Hayır, bir daha Agresif meme kanseri fenotip bir nano-molar düzeyde katkıda uyarıcı tümör genişleme ve geçiş16tarafından gösterilmiştir. Hayır kollajen, diethylenetriamine/nitrik oksit donör 1 µM gömülü MCF7 pulcuklarının toplu işgali işlemi etkisini incelemek amacıyla (DETA/Hayır) eklendi tam kültür orta ve BF t görüntüleri elde = 0 ve t = 20 h. dramatik = donör maruz sırasında 3D pulcuklarının yerleri ve morfoloji değişikliklerdir belirgin (Şekil 7A-B). Pulcuklarının onların Küresellik kaybetmek ve daha protozlar göçmen fenotip edinme uzamış olur. Kullanılazlar, çevredeki kollajen matris içinde pulcuklarının gelişmiş translocation (Şekil 7C) gözlenmiştir. Ortalama uzama değeri önemli ölçüde arttı 1,305 ± 0,193 yapıyordum 1.477 ± 0,298 yapıyordum, (p < 0,0006). İçin aynı pulcuklarının ölçülen ortalama geçiş mesafe uzatıldı önemli ölçüde, 0.0788 ± 0.0575 mm ve 0.3164 ± 0.3365 mm olmaması ve DETA/Hayır, varlığı sırasıyla (p < 4 x 10-6).

Görüntü analizi küresel işgalinin yarı otomatik in-house MATLAB yazılım tarafından sağlanır. Alınan zaman atlamalı görüntüleri küresel oluşumu ve işgal HMCA içinde bir görüntü (10 X büyütme ve 25-30 pulcuklarının 4 X büyütme, 4-6 pulcuklarının) çok sayıda pulcuklarının oluşur. Küresel oluşumu, büyüme ve işgal Analizi kullanılazlar görüntüdeki tüm pulcuklarının tarihinde gerçekleştirildi. Bir seferinde noktada 4 pulcuklarının bir temsili resim ayrılmasını gösteren Şekil 8A, küresel işgal için çıkarılan anahtar parametreleri sunulur (t = 16 h). Kırmızı bir kenarlık yanı sıra devre dışı bırakıldı (siyah oklarla gösterilen) etrafında dağınık, izleniyor ve her küresel için zaman içinde numaralandırılmış ayrılmış hücreleri tarafından tanımlanan ana işgal alanı. Küresel boyutu t işgalinden önce = 0 mavi bir sınır tarafından tanımlanır. Küresel merkezi kütlenin ortalama/ortalama işgali mesafeden ayrılmış hücreleri de dahil olmak üzere işgal alanı çevresi için deklanşörü kırmızı ayrılmasını hesaplanır ve sarı oklarla gösterilir. Hızlandırılmış Bu deneyden elde veri resim 8B-Dözetlenir. Resim 8B her küresel merkezi acımasız işgali mesafeden yükselmesine zaman içinde sergiler. Şekil 8 c toplam işgal alanı her pulcuklarının yükselmesine (ana işgal alanı ve ayrılmış/devre dışı bırakıldı-hücre alanı dahil olmak üzere) zaman içinde sergiler. Şekil 8D 1-4 (zamanla) her küresel toplam işgal bölgesine göre ayrılmış hücreli alan büyüklüğü gösterir. Serbest hücre sayısı 33, 7, 4 ve 5 için pulcuklarının #1, #2, #3 ve #4, sırasıyla var. Serbest hücre üzerinde 20 h işgalinin 126 HeLa pulcuklarının elde edilen kollajen gömülü toplu numaraları analiz rakam 8Eiçinde gösterilir. Burada muayene nüfus serbest hücre sayısı büyük bir dağıtım olduğunu ve ortalama değeri 12.3 ± 12.8 hücreleri bu gösterilmiştir.

Figure 1
Şekil 1: plaka Imaging HMCA. (A)görüntü HMCA ile kabartmalı bir makro-iyi. (B) bir kesit plaka Imaging HMCA içinde bir MC. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: hücre dağıtım ve küresel büyüme oranı plaka Imaging HMCA polimerlerin. (A) BF bir bindirme ve HeLa hücreleri lekeli Höchst 33342 1 µg/mL (konsantrasyon 150 x 10 mL başına3 hücre takılması) ile önceden yüklenmiş HMCA floresan görüntüleri. Görüntüleri hemen sonra X, ölçek çubuğu MC. görüntü büyütme 4 hücre yerleşim elde = 500 µm. (B) tablo özetler HeLa hücreleri HMCA-6-da görüntüleme plaka içinde dağılımı. Hücreleri 90 MC/Makro-kuyudan sayıldı. Sonuçları ± standart sapma (SD), CV (SD/mean100) içinde hesaplanır anlamına ve makro-wells arasında sunulmaktadır. (C) dağıtım histogram 3 gün pulcuklarının, n kesit alanının 418, BF görüntülerden tespit =. (D) dağıtım histogram küresel büyüme oranı (kesit alanı 3 gün/2 gün). Büyüme oranı tek öğe çözünürlükte her 418 pulcuklarının için hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: plaka Imaging HMCA oluşumunda küresel izleme. HeLa hücreleri (mL başına konsantrasyon 120 x 103 hücre takılması) BF görüntüsünü HMCA 1 günde(a)ve (B) 5 gün inkübe. Görüntü büyütme 4 X, ölçek çubuğu 500 mikron =. (C) Dağılım Arsa, 3D nesne Küresellik fonksiyonu kesit alanı, 1 gün (mavi elmas) sonra ve 5 gün (kahverengi kareler) kuluçka sonrası hücre yükleme olarak. Her işaretçi analiz verileri temsil eden bir tek küresel, n = 83. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Olgun pulcuklarının hücre canlılığı tespiti. BF bir bindirme ve floresan (mL başına konsantrasyon 360 x 103 hücre takılması) 5 gün pulcuklarının görüntülerini PI ile 0,25 µg/mL(a)lekeli. Görüntü büyütme 4 X, ölçek çubuğu = 500 (sol panelde) küresel kesit alanı göre PI alanının yüzde dağıtım histogram µm. (B) ve dağıtım histogram kesit alanı (doğru kapı aynası), n = 84. PI alanının yüzde tek öğe çözünürlükte her 84 pulcuklarının için hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ECM kompozisyon küresel işgali sürecinde etkisi. 3 gün HeLa pulcuklarının BF görüntüleri gömülü 3 mg/mL kollajen ve 20 µg/mL karışımı HA(a)ve 3 mg/mL kollajen (C), t = 0 h ve sonra 50 h, kuluçka (B) ve (D), anılan sıraya göre. Görüntü büyütme 10 X, ölçek çubuğu 200 µm =. Plaka Imaging HMCA kuluçka makinesi ile donatılmış ters mikroskop sahne alanı'na yüklendi. Görüntüleri her 5 h elde ve kinetik Analizi Arsa (E), sunulan n 99 =. Her eğrinin işgal alanı artış kollajen ve HA (mavi elmas) ve kollajen sadece (kahverengi kareler) için zaman içinde ortalama ± SD temsil eder. Ortalama doğrusal regresyon eğrisi ve denklemi ve R-kare değerini eğrileri belirtilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Fisetin inhibe HeLa pulcuklarının spontan işgali. 3 gün HeLa pulcuklarının, BF görüntüleri gömülü bir karışımı 3 mg/mL kollajen(a)t = 0 µM (B) eklenmesinden sonra 0 ve sonra 24 saat ve 10 µM Fisetin (C) tam kültür orta. Görüntü büyütme 4 X, ölçek çubuğu 500 µm. analiz için bitiş noktası, her küresel işgal alanının = (t = 24 h) Arsa (D), sunulan n 488 =. Eğri ortalama ± SD işgal alanı temsil eden 0-40 µM bir fonksiyonu olarak Fisetin. Fisetin tedavi önemli ölçüde engeller 10 µM işgalinden (P 4.65 x 10-6=), 20 µM (P = 0.0021) ve 40 µM (P 4,86 10-8x =), kullanarak t-test: eşit Varyanslar varsayarak iki örnek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Hayır MCF-7 göğüs kanseri pulcuklarının yılında toplu işgal indükler. BF 2 gün MCF-7 görüntülerini meme kanseri pulcuklarının, (A) kolajen gömülü (t = 0) ve (B) uzun süre 1 µM DETA maruz 20 h/hayır Küresel yatırım getirisi segmentasyon kırmızı kenarlıkla tanımlanan, overlaid ve kırmızı BF görüntüleri A ve b mavi sınır, BF resim B temsil küresel boyutu ve konumu t overlaid tarafından tanımlanan ROIs sayılı = 0. 4 X büyütme, ölçek çubuğu 500 µm. (C) A dağılım çizim bireysel meme kanseri pulcuklarının 1 µM DETA maruz üzerine uzama faktörü ve göç mesafe arasındaki korelasyon = / yok (kahverengi kareler) olarak karşılaştırıldığında kontrol (mavi elmas) t = 20 h, n = 54. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: HeLa hücre spontan işgal görüntü analizi. 3 gün HeLa pulcuklarının, kollajen(a)gömme sonra 16 h BF görüntüleri. Büyütme 10 X. Küresel işgal alanı ve serbest hücreler tanımlanmış kırmızı kenarlıkla, küresel boyutta t = 0 mavi sınır tarafından tanımlanan, küresel center kütlenin ortalama işgali uzaktan sarı oklarla belirtilir ve serbest hücreleri siyah oklarla gösterilir. Acımasız işgali mesafe küresel merkezi kütlenin (B) ve (C) Toplam işgal bölgesine zamanla artış arsa. Eğrileri küresel #1 (mavi elmas), küresel #2 (kahverengi kareler), küresel #3 (yeşil üçgenler) ve küresel #4 (mor Xs) temsil eder. (D) çubuk grafik Main (mavi) ve hücre (kahverengi) işgal alanı artış zaman içinde ayrılmış. (E) dağıtım histogram küresel işgal sürecinin, n 20 h sırasında başına ayrı hücre sayısı 126 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iyi belgelenmiş canlı organizmalar, onların karmaşık 3D Çokhücreli Organizasyon tarafından karakterize oldukça çok önemli fonksiyonları daha iyi taklit hücresel modelleri kullanmaya gerek vurgulayan kültürlü sık kullanılan 2D monolayer hücrelerden farklıdır ve uyuşturucu için canlı organizmanın süreçleri eleme. Son zamanlarda, çok hücreli pulcuklarının, organotypic kültürlerin, organoids ve organları-on-a-chip tanıtılan8 kullanılmak üzere standart ilaç keşfi olmuştur. Ancak, 3D çok hücreli modelinin büyük karmaşıklığı önemli ölçüde, sağlamlık, parallelization ve tahlil etkinlik için çok önemli olan veri analizi tehlikeye atıyor.

Kantitatif değerlendirilmesi işgal kapasitesi genellikle ile hidrojel malzemeleri arasında yer alan hareketin ölçer. Geleneksel mikro-şey plakaları kullanarak tümör işgali ölçmek amacıyla, çok sayıda kanser hücrelerinin içinde alt plaka numaralı seribaşı ve zorla Santrifüjü21,22tarafından toplanacak. Bu tabakları yuvarlak alt optik kalitesi takdir ve resim alma için sadelik içinde wells, bitişik hücre/küresel etkileşim kısıtlamak. Diğer yöntemleri, tek tek hücreleri rastgele hidrojel içinde kapsüllü, büyümek ve bir 3D ortamda çalışması ama mutlaka olgun pulcuklarının23,24geliştirmek mi. Ayrıca, hücre hidrojel içinde konumlandırma için karmaşık prosedürler, manyetik kuvvet tabanlı cep desenlendirme25 veya iki fotonlu lazer ile biyoaktif hydrogels26gibi gereklidir.

Burada sunulan teknoloji HMCA müstenit belgili tanımlık yukarıda yöntem üzerinde avantajlı olmaktadır: konumlandırma, spontan toplama hücre ve birkaç dağınık hücrelerden pulcuklarının oluşturulması kolayca elde edilebilir, değerli sınırlı cep kullanmanızı örnek (Örn., kanser kök benzeri hücreler veya primer hücre elde edilen hasta örnekleri). Sistem kontrolü pulcuklarının oluşturan hücre yapısı üzerinde yanı sıra onların tam uzamsal konumları üzerinde uzun süreli deneyler sırasında vardır. Buna ek olarak, düz dipli mc aynı odak planı üzerinde çok sayıda pulcuklarının nesil kolaylaştırır, bu nedenle hızlı aydınlatma ve görüntü edinme geniş alan mikroskop ile geniş alanlarda eleme belgili tanımlık lüzum için karmaşık, mümkündür zaman alıcı confocal mikroskobu. Sistem tanıtıcısı ve onun pratiklik uygun kolaydır. Basit işlem yordamlarını uygulayarak, biz pulcuklarının yaklaşık % 50'si karşılaştırılabilir boyutu olan küresel nüfusun yüksek doluluk ve kanser hücre işgal kapasitesi güvenilir bir analizini elde. Buna ek olarak, uyuşturucu etkisi Invasion kapasite aynı anda sitostatik ve/veya sitotoksik etkileri ile yüksek-içerik analizi yaklaşımı ile çok sayıda pulcuklarının kültürlü HMCA cihaz ile birlikte kullanarak analiz edilebilir. Ayrıca, HMCA, aynı alanını ve orta, genellikle hücre salgılanan sitokinler, kemokinler, hormonlar ve ECM27ile aracılık ettiği küresel küresel etkileşim araştırmak edinerek tüm hücresel öğeleri paylaşır. Bu çapraz konuşma hayatta kalma ve tek tek hücreler/küçük hücre kümeleri makro-şey birimindeki işlevini kolaylaştırır.

Protokolün yürütülmesi kritik bir adımda pulcuklarının ve onun uygun polimerizasyon doğrulama üstüne ECM karışımı eklenmesidir. Derleme ve ilişkilendirerek ortaya ve uygun kollajen lifleri oluşan sürece ECM içinde katıştırılmış olsa bile pulcuklarının göçmen davranış göstermez. Kollajen lifleri BF aydınlatma tarafından görülebilir ve kolajen lifleri bu aşama sonunda yaratılmasının bir mikroskop altında plaka kontrol tavsiye ediyoruz. Pulcuklarının sayısı bu yana ilk hücre toplama ve yüzde bağımlı için MCs işgal, dizinin ilk hücre yükledikten sonra denetlenmesi ve hücre doluluk en uygun değilse, aynı dizi yeniden tohum gerçekleştirilebilir. Gerçekten de, burada açıklanan HMCA geometrisini ve boyutu görece küçük hücre kümeleri (çapı 150 µm) karşılamak için tasarlanmıştır. Dizi yeni bir tür tasarlama hücre göç--dan daha büyük hücre yapıları analiz etmek için gerekli olacak çünkü bu bir sınırlama düşünülebilir.

Geçerli platform en az cep telefonu numarasını ve aynı zamanda bir büyük örnek boyutu (pulcuklarının plaka başına binlerce) sağlayan küçük reaktif hacmi kullanır. 12 farklı bileşenleri, Anti-metastatik etkinlik için çözümlemek amacıyla 2 tek 6-şey dayalı HMCA tabak en az 50 96-şey plakaları aynı sonuçları elde etmek için gerekli süre yaklaşık 5000 pulcuklarının sonuçları verimli gerekli olacaktır. HMCA birey-nesne çözünürlükte geçiş analiz yeteneği yüksek düzeyde istatistiksel sağlamlık ve doğruluğu, yapısal ve işlevsel işgali heterojenite çok sayıda pulcuklarının içinde çalışmanın etkinleştirme sağlar.

Bu çalışmada, benzersiz olarak meme kanseri küresel nüfus DETA/No maruz üzerine toplu işgali gösterir MCF7 hücrelerinin hücre kümeleri protozlar göçmen fenotip göstermek ve Morfoloji ve her küresel konumunu nicel değişiklikler otomatik olarak elde edilebilir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bu izleme ve analiz çok sayıda 3D yapılar toplu işgalinin kolaylaştıran ilk dizilmiş sistemidir. Göreli yol tarifi ve işgal mesafe her küresel için analiz ederek, nüfus içinde pulcuklarının arasındaki karşılıklı etkileşimi incelemek mümkündür. Ayrıca, kanser hücre davranışı28 ekstraselüler microenvironment faktörlerin etkisi kurulmuş burada gösterilmektedir. Bu faktörler arasında güçlü hücre göç etkilemek için sertlik ve microenvironment bileşimi kanıtlanmıştır. HMCA teknolojisi tanımlanmış, biomimetic, hangi ECM bu özellikleri kolayca erişilebilir kontrol ve vitro platformu sağlar. Saf kolajen sertliği tip ı hidrojel, bu çalışmada kullanılan 3 mg/mL konsantrasyonu yaklaşık olarak 50-600 Pa29,30,31 olmak bildirdi ve HA (20 µg/mL; 0.4 wt %) eklenmesi değişmedi hidrojel sertliği önemli ölçüde32,33. Böylece, orta molekül ağırlığı (MMW) baskılayıcı etkisi-HA 3D HeLa pulcuklarının hangi gösterilmiştir işgali buraya değil sertlik değişiklikler nedeniyle. Bu sonuçlar HA molekül ağırlığı34,35,36,37yüksek bağımlılık ile kanser hücre işgal HA biomodel etkisini gösterdi önceki çalışmalar ile anlaşma vardır.

Yan yana çok hücre tipi tümör ve makro-kuyu içinde farklı bölgelerdeki stromal hücreler ve aşağı akım moleküler analiz için belirli pulcuklarının alınmasını kültür yöntemleri gelecekteki uygulamalar içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser Moshe Şimon ve Judith Weisbrodt miras tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

Tags

Kanser Araştırmaları sayı: 140 3D çok hücreli nesneler küresel hidrojel mikro-odası istila tahlil ECM görüntü analizi toplu işgali 3D kültür modeli
Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N.,… More

Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter