En HMCA-baseret tænkelig plade præsenteres for invasion assay ydeevne. Denne plade letter dannelsen af tre-dimensionelle (3D) tumor spheroids og måling af kræft celle invasion i den ekstracellulære matrix (ECM). Invasion assay kvantificering opnås ved halvautomatiske analyse.
Kræft metastaser er kendt for at forårsage 90% af kræft dødelighed. Metastaser er en flertrins proces, som starter med penetration/invasion af tumorceller i omkringliggende væv. Invasionen er således et afgørende skridt i metastase, gør invasion proces forskning og udvikling af anti-metastatisk narkotika, meget sigende. For at løse dette krav, der er behov for at udvikle 3D in vitro- modeller, der imiterer arkitektur af solide tumorer og deres mikromiljø tættest til i vivo staten på den ene side, men på samme tid være reproducerbare, robust og velegnet til højt udbytte og høj indhold målinger. I øjeblikket, de fleste invasion assays lean på sofistikeret mikrofluid teknologier, som er passende for forskning, men ikke for høj lydstyrke stof screening. Andre assays ved hjælp af plade-baserede enheder med isolerede enkelte spheroids i hver brønd er materiale forbruger og har lav stikprøvestørrelse pr. betingelse. Målet med den nuværende protokol er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D celle-baseret system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Vi udviklede en 3D model for invasion analysen baseret på HMCA imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk drug discovery. Denne enhed gør det muligt for produktion af talrige ensartet spheroids pr. brønd (høj stikprøvestørrelse pr. betingelse) omgivet af ECM komponenter, mens løbende og samtidig observere og måle spheroids på ét element opløsning til mellemstore throughput screening af anti-metastatisk narkotika. Denne platform er præsenteret her af produktionen af HeLa og MCF7 spheroids for eksemplificere enkelt celle og kollektive invasion. Vi sammenligner indflydelse af ECM komponent hyaluronsyre (HA) på kollagen omkring HeLa spheroids invasive kapacitet. Endelig, vi introducere Fisetin (invasion hæmmer) til HeLa spheroids og nitrogenoxid (NO) (invasion aktivator) til MCF7 spheroids. Resultaterne er analyseret af in-house software, som gør det muligt for semi-automatiske, enkel og hurtig analyse, som letter multi-parameter undersøgelse.
Kræft død er hovedsagelig tilskrives spredning af metastatisk celler til fjerne steder. Mange bestræbelser i kræftbehandling fokusere på målretning eller forhindre dannelsen af metastatisk kolonier og progression af systemisk metastatisk sygdom1. Kræft celle migration er et afgørende skridt i tumor metastaser proces, forskning i kræft invasion cascade er således meget vigtigt og en forudsætning for at finde anti-metastatisk therapeutics.
Anvendelsen af dyremodeller som værktøjer til at studere metastatisk sygdom er blevet fundet for at være meget dyrt og ikke altid repræsentativt for tumor hos mennesker. Desuden påvirker de ekstracellulære mikromiljø topologi, mekanik og sammensætning kraftigt kræft celle opførsel2. Da i vivo modeller i sagens natur mangler evnen til at adskille og kontrollere sådanne specifikke parametre, som bidrager til kræft invasion og metastaser, er der behov for en kontrollerbar biomimetiske in vitro- modeller.
For at metastaserer til fjerntliggende organer, skal kræftceller udstille vandrende og invasive fænotypiske egenskaber, som kan målrettes til terapi. Da de fleste in vitro- kræftmodeller ikke efterligne de faktiske funktioner af solide tumorer3, er det imidlertid meget udfordrende at opdage fysiologisk relevante fænotyper. Derudover dikterer fænotypiske heterogenitet, der findes inden for tumor, at analysere tumor migration på ét element beslutning for at opdage fænotype-instrueret behandlinger, for eksempel ved at målrette den metastase-indlede celle befolkningen i heterogene tumorer4.
Undersøgelse af celle motilitet og kollektive migration er primært udført i éncellelag kulturer af epitelceller på homogene plane overflader. Disse konventionelle cellulære modeller for kræft celle migration er baseret på befolkning analysen af individuelle celler invaderer gennem membraner og ECM komponenter5, men i sådanne systemer, de iboende forskelle mellem individuelle celler ikke kan være studerede. Generere 3D spheroids enten via stilladser eller stillads-gratis mikro-strukturer er betragtes som en overlegen betyder at studere tumor celle vækst og cancer invasion6,7,8. Dog mest 3D systemer er ikke egnet til høj overførselshastighed formater, og Inter klumpformet interaktion opnås normalt ikke da isolerede enkelte spheroids genereres i hver mikro-godt9. Nylige undersøgelser der involverer kræft migration er baseret på mikrofluid enheder3,10,11,12, men disse sofistikerede mikrofluid værktøjer er vanskelige at producere og ikke kan bruges til high throughput screening (HTS) af anti-invasive narkotika.
To vigtigste fænotyper, kollektive og individuelle celle migration, som spiller en rolle i tumorceller at overvinde ECM barriere og invaderer nærliggende væv, har været demonstreret13,14, hver viser forskellige morfologiske karakteristika, biokemiske, molekylære og genetiske mekanismer. Desuden er to former for overflytning tumorceller, fibroblast-lignende og amoeboid, observeret i hver fænotype. Da begge, invasion fænotyper og migration tilstande, defineres primært ved morfologiske egenskaber, der er behov for cellulær modeller at aktivere imaging-baseret detektion og behandling af alle former for tumor invasion og overflytning af celler.
Det overordnede mål i den aktuelle metode er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D i vitro celle-baserede system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Her introducerer vi HMCA-baserede 6-godt imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk terapi. Teknologien gør det muligt for dannelsen af et stort antal ensartet 3D tumor spheroids (450 pr. brønd) i en hydrogel mikro-kamre (MC) struktur. Forskellige ECM komponenter føjes til matrixen klumpformet aktivere invasion af celler ind i det omgivende miljø. Invasion processen overvåges løbende af kort og lang sigt observation af de samme individuelle spheroids/invaderer celler og letter morfologiske karakteristika, fluorescerende farvning og hentning af specifikke spheroids på ethvert tidspunkt. Da talrige spheroids deler plads og medium, er interaktion via opløselige molekyler mellem individuelle spheroids og deres indvirkning på hinanden muligt. Semi-automatisk billedanalyse udføres ved hjælp af in-house MATLAB kode, som giver mulighed for hurtigere og mere effektiv samling af store datamængder. Platformen letter præcise, samtidig måling af talrige spheroids/invaderer celler i en tid-effektive måde, medium throughput screening af anti-invasion narkotika.
Det er veldokumenteret, at levende organismer, kendetegnet ved deres komplekse 3D flercellede organisation er helt adskilt fra almindeligt anvendte 2D éncellelag kulturperler celler, understreger det påtrængende behov for at bruge cellulære modeller, som bedre efterligner funktioner og processer i den levende organisme for stof screening. For nylig, flercellede spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer-on-a-chip har været indført8 til brug i standardiseret drug discovery. Dog tru…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af arv af Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |