Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.
Uitzaaiing van kanker is bekend dat het veroorzaken van 90% van kanker letaliteit. Metastase is een meertraps proces dat met de penetratie/invasie van tumorcellen in naburige weefsel start. Invasie is dus een cruciale stap in de metastase, waardoor de invasie proces onderzoek en de ontwikkeling van anti-metastatische drugs, veelbetekenend. Om aan deze vraag, er is een noodzaak om 3D in vitro modellen die imiteren van de architectuur van solide tumoren te ontwikkelen en hun communicatie nauwst aan in vivo staat aan de ene kant, maar op hetzelfde moment worden gereproduceerd, robuust en geschikt voor hoge opbrengst en hoog inhoud metingen. Op dit moment de meeste invasie testen leunen op geavanceerde microfluidic-technologieën die geschikt zijn voor onderzoek, maar niet voor hoog volume drug screening. Andere plaat-gebaseerde apparaten met geïsoleerde individuele spheroïden in elk putje testen zijn materiaal consumeren en lage steekproefgrootte per voorwaarde. Het doel van het huidige protocol is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. We ontwikkelden een 3D-model voor invasie assay gebaseerd op HMCA imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische drugontdekking. Dit apparaat maakt de productie van talrijke uniforme spheroïden per putje (hoge steekproefgrootte per voorwaarde) omgeven door ECM-onderdelen, terwijl tegelijkertijd en continu observeren en meten van de spheroïden met één element voor medium resolutie throughput screening van anti-metastatische drugs. Dit platform wordt hier gepresenteerd door de productie van HeLa en MCF7 spheroïden voor het voorbeeldig voor eencellige en collectieve invasie. We vergelijken de invloed van de ECM component hyaluronzuur (HA) op de invasieve capaciteit van collageen rondom HeLa spheroïden. Tot slot, we kennismaken met Fisetin (invasie remmer) HeLa spheroïden en stikstofmonoxide (NO) (invasie activator) naar MCF7 spheroïden. De resultaten worden geanalyseerd door interne software waarmee semi-automatische, eenvoudige en snelle analyse die Multi-parameter onderzoek vergemakkelijkt.
Kanker overlijden wordt toegeschreven voornamelijk aan de verspreiding van uitgezaaide cellen naar verre locaties. Vele inspanningen in de behandeling van kanker geconcentreerd op targeting of preventie van de vorming van metastatische kolonies en progressie van systemische gemetastaseerde ziekte1. Kanker cel migratie is een cruciale stap in het proces van tumor metastase, het onderzoek van de kanker invasie cascade is dus erg belangrijk en een voorwaarde voor het vinden van de anti-metastatische therapeutics.
Het gebruik van dierlijke modellen als instrumenten voor het bestuderen van gemetastaseerde ziekte is erg duur en niet altijd representatief voor de tumor bij de mens gevonden. Bovendien, de extracellulaire communicatie topologie, de mechanica en de samenstelling sterk van invloed op kanker cel gedrag2. Aangezien in vivo modellen is inherent gebrek aan de mogelijkheid om te scheiden en beheren van dergelijke specifieke parameters die aan kanker invasie en metastase bijdragen, is er behoefte aan een beheersbare biomimetische in vitro modellen.
Om het metastaseren tot verre organen, moeten de kankercellen trekkende en invasieve fenotypische eigenschappen die kunnen worden gericht voor therapie vertonen. Aangezien de meeste in vitro kanker modellen niet de feitelijke kenmerken van solide tumoren3nabootsen doen, is het echter zeer uitdagend om te detecteren fysiologisch relevante fenotypen. Bovendien, dicteert de fenotypische heterogeniteit die bestaat binnen de tumor, de noodzaak voor het analyseren van de tumor migratie op één element resolutie om te ontdekken fenotype gerichte therapieën, bijvoorbeeld door zich te richten de cel metastase-Inleiding bevolking binnen heterogene tumoren4.
De studie van de beweeglijkheid van de cel en collectieve migratie is voornamelijk uitgevoerd in enkelgelaagde culturen van epitheliale cellen op homogene vlakke oppervlakken. Deze conventionele cellulaire modellen voor kanker cel migratie zijn gebaseerd op de analyse van de bevolking van afzonderlijke cellen invasie door de membranen en ECM componenten5, maar in dergelijke systemen, de intrinsieke verschillen tussen afzonderlijke cellen kunnen niet studeerde. Genereren 3D spheroïden, hetzij via steigers of steiger-gratis micro-structuren is beschouwd als een superieure betekent om te studeren van de tumor cel groei en kanker invasie6,7,8. Echter meest 3D systemen zijn niet geschikt voor hoge doorvoer formaten, en inter sferoïde interactie meestal niet worden bereikt aangezien geïsoleerde individuele spheroïden worden gegenereerd in elk micro-well9. Recente studies met betrekking tot de migratie van kanker zijn gebaseerd op microfluidic apparaten3,10,11,12, echter deze verfijnde microfluidic tools zijn moeilijk te produceren en kan niet voor hoge throughput screening (HTS) van anti-invasieve drugs worden gebruikt.
Twee belangrijkste fenotypen, collectieve en individuele cel migratie, die een rol spelen bij de tumorcellen het overwinnen van de ECM-barrière en invasie van naburige weefsel, hebben aangetoond dat13,14, elke weergave van verschillende morfologische kenmerken, genetische, biochemische en moleculaire mechanismen. Daarnaast zijn twee vormen van migratie tumorcellen, fibroblast-achtige en Wortelpotigen, waargenomen in elke fenotype. Aangezien beide invasie fenotypes en migratie modi, voornamelijk door morfologische eigenschappen worden gedefinieerd, er is behoefte aan een mobiele modellen die inschakelen imaging gebaseerde detectie en behandeling van alle vormen van de invasie van de tumor en het migreren van cellen.
Het algemene doel van de huidige methode is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D in vitro cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. Hier introduceren we de HMCA gebaseerde 6-well imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische therapie. De technologie maakt de vorming van grote aantallen van uniforme 3D tumor spheroïden (450 per putje) in een hydrogel micro-kamers (MC) structuur. Verschillende onderdelen van de ECM zijn toegevoegd aan de matrix sferoïde om de invasie van de cellen in de omgeving. Invasie proces wordt voortdurend gecontroleerd door korte – en lange termijn waarneming van dezelfde individuele spheroïden/invasie cellen en vergemakkelijkt Morfologische karakterisering, fluorescerende vlekken en het ophalen van specifieke spheroïden op elk gewenst moment. Aangezien talrijke spheroïden ruimte en medium delen, is interactie via oplosbare moleculen tussen individuele spheroïden en hun invloed op elkaar mogelijk. Semi-automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van in-house MATLAB-code waarmee de snellere en meer efficiënte verzameling van grote hoeveelheden gegevens. Het platform vergemakkelijkt nauwkeurige, gelijktijdige meting van talrijke invasie van spheroïden/cellen in een tijd-efficiënte manier, waardoor middellange throughput screening van anti-invasie drugs.
Het is goed gedocumenteerd zijn levende organismen, gekenmerkt door hun complexe 3D meercellige organisatie duidelijk onderscheiden van de meest gebruikte 2D enkelgelaagde gekweekte cellen, nadruk op de cruciale noodzaak om cellulaire modellen die beter na te de functies bootsen en processen van levend materiaal voor drug screening. Meercellige spheroïden, organotypic culturen, organoids en organen-on-a-chip hebben onlangs geïntroduceerde8 voor het gebruik in gestandaardiseerde drugontdekking. G…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door het legaat van Moshe Shimon en Judith Weisbrodt.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |