צלחת הדמיה המבוססת על HMCA מוצג לביצועים assay הפלישה. הצלחת הזו מקלה על היווצרות הגידול תלת מימדי (3D) spheroids והמידה של סרטן תאים פלישת מטריצות (ECM). כימות assay הפלישה מושגת על ידי ניתוח חצי-אוטומטי.
גרורות סרטן ידוע כגורם 90% של סרטן קטלני. גרורות הוא תהליך רב מדרגתיות אשר יוזם עם הפלישה/החדירה של תאים סרטניים לתוך רקמות שכנות. לפיכך, הפלישה היא שלב קריטי גרורות, שהופך את הפלישה תהליך מחקר ופיתוח של תרופות אנטי גרורתי, משמעותית ביותר. כדי לטפל דרישה זו, יש צורך לפתח מודלים 3D במבחנה אשר לחקות את הארכיטקטורה של גידולים מוצקים, microenvironment שלהם בצורה הקרובה ביותר למצב ויוו מצד אחד, אך בו זמנית להיות מתאים, חזקים הדירים תשואה גבוהה ומדידות תוכן גבוהה. כיום, רוב מבחני הפלישה להישען על טכנולוגיות מתוחכמות microfluidic אשר מתאימות למחקר, אבל לא בשביל נפח גבוה והתרופות הקרנה. מבחני אחרים באמצעות מכשירים מבוססי צלחת עם spheroids בודדים מבודדת היטב כל חומר רב, יש גודל המדגם נמוך לכל תנאי. המטרה של הפרוטוקול הנוכחי נועד לספק מבוססת תא 3D ביונים פשוט וניתן לשחזור מערכת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. פיתחנו דגם תלת-ממד עבור assay הפלישה בהתבסס על צלחת הדמיה HMCA למחקר של הגידול הפלישה, גילוי תרופות אנטי גרורתי. התקן זה מאפשר הייצור של רבים spheroids אחיד לכל טוב (גודל המדגם גבוהה לכל תנאי) מוקף רכיבים ECM, תוך התבוננות ללא הרף, בו זמנית מדידה של spheroids ברזולוציה רכיב בודד בינוני הקרנת תפוקה של תרופות אנטי גרורתי. פלטפורמה זו מוצגת כאן על-ידי הייצור של הלה, MCF7 spheroids עבור המשמשים תא בודד ופלישה קולקטיבית. אנו משווים את השפעת חומצה היאלורונית רכיב ה-ECM (HA) על היכולת פולשנית של קולגן סביב הלה spheroids. בסופו של דבר, אנחנו מציגים Fisetin (מעכב הפלישה) הלה spheroids, תחמוצת החנקן (אין) (activator הפלישה) כדי MCF7 spheroids. התוצאות מנותחות על-ידי תוכנה פנימית המאפשרת ניתוח חצי אוטומטי, פשוטה ומהירה המאפשרת בדיקה multi-parameter.
מקרי המוות מסרטן מיוחס בעיקר להפצת גרורתי לתאים מקומות מרוחקים. מאמצים רבים בטיפול בסרטן להתמקד מיקוד או מניעת היווצרות של מושבות גרורתי והתקדמות של מחלה גרורתית מערכתית1. נדידת תאים סרטן היא שלב חיוני בתהליך גרורות הגידול, לפיכך, המחקר של המפל הפלישה סרטן הוא מאוד חשוב ומפשעה תנאי הכרחי למציאת הרפוי אנטי גרורתי.
השימוש במודלים כלי לימוד במחלה גרורתית נמצאה להיות מאוד יקר, לא תמיד נציג של הגידול ב בני אדם. יתר על כן, הטופולוגיה microenvironment חוץ-תאית, מכניקה והרכב להשפיע על סרטן התא התנהגות2. מאז ויוו מודלים מטבעו חוסר היכולת להפריד בין ולשלוט פרמטרים ספציפיים כגון, אשר תורמים הפלישה סרטן, גרורות, יש צורך ביונים לשליטה במבחנה מודלים.
על מנת גרורות לאיברים מרוחקים, תאים סרטניים חייב להפגין תכונות פנוטיפי נודדות ופולשני אשר ניתן לפלח לטיפול. עם זאת, מאז רוב במבחנה הדגמים סרטן מחקה את התכונות בפועל של גידולים מוצקים3, זה מאתגר מאוד לזהות פנוטיפים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, הטרוגניות פנוטיפי שקיים בתוך הגידול, מכתיב את הצורך בניתוח הגידול ההעברה ברזולוציה רכיב אחד כדי לגלות מכוון פנוטיפ טיפולים, למשל, על ידי מיקוד התא. מתחילה גרורות אוכלוסייה בתוך גידולים הטרוגנית4.
המחקר של תנועתיות תאי והעברה קולקטיבית מתנהל בעיקר בתרבויות טפט של תאים אפיתל על משטחים מישוריים הומוגנית. אלה דגמי הסלולר המקובלת על נדידת תאים סרטן מבוססים על ניתוח האוכלוסייה של תאים בודדים פולשים דרך ממברנות ECM רכיבים5, אבל במערכות כאלה, לא יכול להיות הבדלים מהותיים בין תאים בודדים למד. ביצירת spheroids תלת-ממד באמצעות פיגומים או מיקרו-מבנים לגרדום ללא נחשב ממונה פירושו ללמוד את הגידול התא סרטן וצמיחה של הפלישה6,7,8. עם זאת, ביותר תלת-ממד מערכות אינם מתאימים לתבניות תפוקה גבוהה, בדרך כלל אינה יכולה להיות מושגת האינטראקציה הבין-ספרואיד מאז spheroids בודדים מבודדת נוצרים כל מיקרו-ובכן9. מחקרים שנעשו לאחרונה המערבים את ההעברה סרטן מבוססים על microfluidic התקנים3,10,11,12, אולם, אלה מתוחכמים microfluidic כלים קשה לייצר, לא ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) של תרופות אנטי-פולשנית.
שני ראשי פנוטיפים, נדידת תאים קיבוציים ואישיים, אשר ממלאים תפקיד תאים סרטניים להתגבר על המכשול ECM פולשים רקמות שכנות, כבר הפגינו13,14, כל הצגת ברורים מורפולוגי המאפיינים, מנגנונים ביוכימיים, המולקולריים והגנטיים. בנוסף, שתי צורות של העברת תאים סרטניים, כמו פיברובלסט ו- amoeboid, הם נצפו כל פנוטיפ. מאז, הפלישה פנוטיפים and מצבי העברה, בעיקר המוגדרים על-ידי מאפיינים מורפולוגיים, יש צורך הסלולר מודלים זיהוי מבוסס-הדמיה זה לזמין, בחינת כל צורות גידול הפלישה ושל העברת תאים.
המטרה הכוללת של השיטה הנוכחית היא לספק ביונים לשחזור ופשוט 3D במבחנה תא מערכת מבוססת לניתוח של קיבולת הפלישה בקרב אוכלוסיות גדולות של גידול spheroids. כאן, אנחנו מציגים מבוסס-HMCA 6-ובכן הדמיה הצלחת עבור המחקר של הפלישה גידול וטיפול אנטי גרורתי. הטכנולוגיה מאפשרת היווצרות של מספרים גדולים של הגידול תלת-ממד אחיד spheroids (450 לכל טוב) בתוך מבנה תאי-מיקרו (MC) הידרוג. רכיבי ה-ECM שונים נוספים למערך ספרואיד כדי לאפשר את הפלישה של התאים לתוך הסביבה. הפלישה תהליך ללא הרף מנוטרת על ידי קצר – ארוכת התבוננות לאותם תאים בודדים spheroids/פולש ואסטמה ומקילה על אפיון מורפולוגי, צביעת פלורסנט ולאחזור של spheroids ספציפי בשלב כלשהו. מאז spheroids רבים חולקים חלל בינוני, אינטראקציה באמצעות מולקולות מסיסים בין הבודדים spheroids והשפעתם על אחד לשני אפשרי. ניתוח תמונות חצי אוטומטי מתבצע על ידי שימוש בקוד MATLAB שבאתר המאפשרת אוסף יעילה ומהירה של כמות גדולה של נתונים. פלטפורמת מקל מדידה מדויקים, בו זמנית של תאים spheroids/פולש רבים בצורה היעילה, המאפשר הקרנה תפוקה בינונית של תרופות נגד הפלישה.
זה מתועד היטב כי היצורים החיים, מאופיין על ידי הארגון multicellular תלת-ממדיים מורכבים שלהם הם ברורים למדי את התאים נפוץ טפט 2D תרבותי, תוך הדגשת הצורך קריטי להשתמש דגמי הסלולר אשר כדאי לחקות את הפונקציות . וסינון תהליכים של האורגניזם החי על סמים. לאחרונה, multicellular spheroids, תרבויות organotypic, organoids, איברים-…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי עזבון משה שמעון, ג’ודית Weisbrodt.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |