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Cancer Research

कैंसर सेल आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा Hydrogel सूक्ष्म चैंबर सरणी (HMCA) का उपयोग कर स्क्रीनिंग के विश्लेषण-प्लेट्स आधारित

doi: 10.3791/58359 Published: October 25, 2018

Summary

एक HMCA आधारित इमेजिंग प्लेट आक्रमण परख प्रदर्शन के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्लेट तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर spheroids और extracellular मैट्रिक्स (ECM) में कैंसर कोशिका आक्रमण की माप के गठन की सुविधा । आक्रमण परख ठहराव अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण द्वारा हासिल की है ।

Abstract

कैंसर मेटास्टेसिस कैंसर की मृत्यु के ९०% कारण जाना जाता है । मेटास्टेसिस एक multistage प्रक्रिया है जो पड़ोसी ऊतक में प्रवेश/ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण के साथ शुरू होता है । इस प्रकार, आक्रमण मेटास्टेसिस में एक महत्वपूर्ण कदम है, आक्रमण प्रक्रिया अनुसंधान और विरोधी मेटास्टेटिक दवाओं के विकास, अत्यधिक महत्वपूर्ण बना । इस मांग को संबोधित करने के लिए एक की जरूरत है इन विट्रो मॉडल जो ठोस ट्यूमर की वास्तुकला की नकल और उनके microenvironment सबसे निकटता में vivo राज्य में एक हाथ पर, लेकिन एक ही समय में reproducible, मजबूत और के लिए उपयुक्त हो उच्च उपज और उच्च सामग्री माप । वर्तमान में, सबसे आक्रमण परख परिष्कृत microfluidic प्रौद्योगिकियों जो अनुसंधान के लिए पर्याप्त नहीं बल्कि उच्च मात्रा दवा स्क्रीनिंग के लिए कर रहे है पर झुक जाते हैं । प्लेट का उपयोग अन्य परख-अलग व्यक्तिगत spheroids के साथ उपकरणों पर आधारित एक अच्छी तरह से सामग्री लेने वाले हैं और शर्त प्रति कम नमूना आकार है. वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य ट्यूमर spheroids की बड़ी आबादी में आक्रमण क्षमता के विश्लेषण के लिए एक सरल और reproducible biomimetic 3d कोशिका आधारित प्रणाली प्रदान करना है । हम आक्रमण परख के लिए एक 3 डी मॉडल ट्यूमर आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा खोज के अनुसंधान के लिए HMCA इमेजिंग प्लेट पर आधारित विकसित की है । यह डिवाइस (शर्त प्रति उच्च नमूना आकार) ECM घटकों से घिरा हुआ है, जबकि लगातार और एक साथ देख और मध्यम के लिए एकल तत्व संकल्प पर spheroids को मापने के प्रति अच्छी तरह से कई समान spheroids के उत्पादन को सक्षम बनाता है विरोधी मेटास्टेटिक दवाओं का प्रवाह स्क्रीनिंग । यह मंच यहाँ exemplifying एकल कोशिका और सामूहिक आक्रमण के लिए हेला और MCF7 spheroids के उत्पादन द्वारा प्रस्तुत किया गया है. हम ECM घटक hyaluronic एसिड के प्रभाव की तुलना कोलेजन के आसपास हेला spheroids के इनवेसिव क्षमता पर (हा) । अंत में, हम Fisetin (आक्रमण अवरोधक) हेला spheroids और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) (आक्रमण उत्प्रेरक) MCF7 spheroids करने के लिए परिचय । परिणाम में घर सॉफ्टवेयर है जो अर्द्ध स्वचालित, सरल और तेजी से विश्लेषण जो बहु-पैरामीटर परीक्षा की सुविधा में सक्षम बनाता द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।

Introduction

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कैंसर मृत्यु मेटास्टेटिक कोशिकाओं के प्रसार के लिए मुख्य रूप से दूर के स्थानों के लिए जिंमेदार ठहराया है । कैंसर के इलाज में कई प्रयासों को लक्षित करने या मेटास्टेटिक कालोनियों और प्रणालीगत मेटास्टेटिक रोग की प्रगति के गठन को रोकने पर ध्यान केंद्रित1। कैंसर सेल प्रवास ट्यूमर मेटास्टेसिस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है, इस प्रकार, कैंसर आक्रमण झरना के अनुसंधान बहुत महत्वपूर्ण है और विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सकीय खोजने के लिए एक शर्त है ।

मेटास्टेटिक रोग के अध्ययन के लिए उपकरणों के रूप में पशु मॉडलों का उपयोग बहुत महंगा पाया गया है और हमेशा मानव में ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं. इसके अलावा, extracellular microenvironment टोपोलॉजी, यांत्रिकी और संरचना दृढ़ता से कैंसर कोशिका व्यवहार को प्रभावित2। के बाद से vivo मॉडल में स्वाभाविक को अलग और ऐसे विशिष्ट मापदंडों जो कैंसर के आक्रमण और मेटास्टेसिस में योगदान को नियंत्रित करने की क्षमता की कमी है, वहां इन विट्रो मॉडल में नियंत्रणीय biomimetic के लिए एक की जरूरत है ।

आदेश में दूर के अंगों को metastasize करने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं प्रवासी और इनवेसिव phenotypic लक्षण है जो चिकित्सा के लिए लक्षित किया जा सकता है प्रदर्शन करना चाहिए । हालांकि, के बाद से इन विट्रो कैंसर मॉडल ठोस ट्यूमर3की वास्तविक सुविधाओं की नकल नहीं करते हैं, यह बहुत शारीरिक रूप से प्रासंगिक phenotypes का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, ट्यूमर के भीतर मौजूद phenotypic विविधता, phenotype-निर्देशित उपचारों को खोजने के क्रम में एकल-तत्व रिज़ॉल्यूशन पर ट्यूमर माइग्रेशन का विश्लेषण करने की आवश्यकता को निर्धारित करता है, उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस-शुरुआत कक्ष को टार्गेट करके विषम ट्यूमर के भीतर जनसंख्या4.

कोशिका गतिशीलता और सामूहिक प्रवास का अध्ययन मुख्यतः उपकला कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों में सजातीय planar सतहों पर आयोजित किया जाता है । कैंसर सेल प्रवास के लिए इन पारंपरिक सेलुलर मॉडल अलग झिल्ली और ECM5घटकों के माध्यम से हमला कोशिकाओं के जनसंख्या विश्लेषण पर आधारित हैं, लेकिन ऐसी प्रणालियों में, व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच आंतरिक मतभेदों को नहीं किया जा सकता अध्ययन. 3 डी spheroids या तो पाड़ या पाड़ में मुक्त सूक्ष्म संरचनाओं के माध्यम से पैदा करने के लिए एक बेहतर ट्यूमर सेल विकास और कैंसर के आक्रमण6,7,8अध्ययन का मतलब के रूप में माना जाता है । हालांकि, सबसे 3 डी सिस्टम उच्च प्रवाह प्रारूपों के लिए उपयुक्त नहीं हैं, और अंतर-अंडाकार आकृति बातचीत आमतौर पर अलग अलग spheroids प्रत्येक सूक्ष्म अच्छी तरह से9में उत्पंन कर रहे है के बाद से प्राप्त नहीं किया जा सकता है । हाल ही में कैंसर प्रवास शामिल अध्ययन microfluidic उपकरणों3,10,11,12पर आधारित हैं, तथापि, इन परिष्कृत microfluidic उपकरण के लिए उत्पादन और नहीं कर सकते है मुश्किल विरोधी इनवेसिव दवाओं के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग (HTS) के लिए इस्तेमाल किया जा ।

दो मुख्य phenotypes, सामूहिक और व्यक्तिगत सेल प्रवास है, जो ECM बाधा पर काबू पाने और पड़ोसी ऊतक हमलावर कोशिकाओं में एक भूमिका निभाते हैं,13,14प्रदर्शन किया गया है, प्रत्येक प्रदर्शित अलग रूपात्मक विशेषताओं, जैव रासायनिक, आणविक और आनुवंशिक तंत्र । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के पलायन के दो रूपों, fibroblast की तरह और amoeboid, प्रत्येक phenotype में मनाया जाता है । दोनों के बाद से, आक्रमण phenotypes और प्रवास मोड, मुख्य रूप से रूपात्मक गुणों द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, वहां सेलुलर मॉडल है कि इमेजिंग आधारित पता लगाने और ट्यूमर के आक्रमण के सभी रूपों और कोशिकाओं के स्थानांतरण की परीक्षा सक्षम करने के लिए एक की जरूरत है ।

वर्तमान विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक सरल और reproducible biomimetic 3 डी इन विट्रो सेल-आधारित प्रणाली ट्यूमर spheroids की बड़ी आबादी में आक्रमण क्षमता के विश्लेषण के लिए प्रदान करने के लिए है । यहां, हम ट्यूमर के आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक चिकित्सा के अनुसंधान के लिए HMCA आधारित 6 अच्छी इमेजिंग प्लेट परिचय । प्रौद्योगिकी एक hydrogel माइक्रो चैंबर्स (MC) संरचना में वर्दी 3 डी ट्यूमर spheroids (४५० प्रति अच्छी तरह से) की बड़ी संख्या के गठन में सक्षम बनाता है । विभिन्न ECM घटकों अंडाकार आकृति सरणी में जोड़े जाते हैं आसपास के वातावरण में कोशिकाओं के आक्रमण को सक्षम करने के लिए. आक्रमण की प्रक्रिया लगातार एक ही व्यक्ति spheroids/आक्रमण कोशिकाओं के लघु और दीर्घकालिक अवलोकन द्वारा निगरानी की जाती है और रूपात्मक लक्षण वर्णन, किसी भी बिंदु पर फ्लोरोसेंट धुंधला और विशिष्ट spheroids की पुनर्प्राप्ति की सुविधा । के बाद से कई spheroids शेयर अंतरिक्ष और मध्यम, व्यक्तिगत spheroids और एक दूसरे पर उनके प्रभाव के बीच घुलनशील अणुओं के माध्यम से बातचीत संभव है । अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण में घर MATLAB कोड है जो डेटा की बड़ी राशि का तेजी से और अधिक कुशल संग्रह में सक्षम बनाता है का उपयोग करके किया जाता है । मंच एक समय कुशल तरीके से, विरोधी आक्रमण दवाओं के मध्यम प्रवाह स्क्रीनिंग की अनुमति देने में कई spheroids/हमलावर कोशिकाओं के सटीक, एक साथ माप की सुविधा ।

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Protocol

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1. HMCA प्लेट उभार

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त polydimethylsiloxane (PDMS) स्टाम्प और HMCA इमेजिंग प्लेट के डिजाइन और निर्माण के लिए पूरी प्रक्रिया हमारे पिछले लेख15,16में विस्तार से वर्णित है । PDMS स्टांप (ऋणात्मक आकृति) का उपयोग HMCA (धनात्मक आकृति) को उभारने के लिए किया जाता है जिसमें लगभग ४५० MCs प्रति well (figure 1a) होते हैं. के रूप में चित्र 1bमें प्रदर्शित, MCs के प्रत्येक एक छोटा उल्टा चौकोर आकार का पिरामिड (ऊंचाई: १९० µm, छोटे बेस क्षेत्र: ९० µm x ९० µm, और बड़े आधार क्षेत्र: ३७० µm एक्स ३७० µm) की एक आकृति है । HMCA प्लेट तैयारी और 3d ट्यूमर spheroids और उसके बाद के संवर्धन के लिए प्रयोग किया जाता है, आक्रमण परख के लिए । वैकल्पिक रूप से, एक वाणिज्यिक स्टांप HMCA उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. 6% कम पिघलने agarose (LMA) का समाधान तैयार करें । एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ एक गिलास बोतल में LMA पाउडर और बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) (पंजाब के ०.६ ग्राम प्रति 10 मिलीलीटर की LMA) डालें । एक हीटिंग प्लेट पर बोतल प्लेस और समाधान हलचल, जबकि एक समान समाधान प्राप्त है जब तक ८० डिग्री सेल्सियस के लिए कुछ घंटों के लिए हीटिंग । समाधान ७० डिग्री सेल्सियस पर उपयोग तक रखें ।
  2. ओवन में ७० ° c के लिए PDMS टिकट पूर्व हीट करें । इसे गर्म रखें जब तक उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, एक वाणिज्यिक स्टांप का उपयोग करें और अनुदेश का पालन करें ।
  3. एक सूखी स्नान पूर्व-७५ डिग्री सेल्सियस को गर्म पर वाणिज्यिक 6 अच्छी तरह से गिलास नीचे प्लेट रखें । कुछ मिनट रुको जब तक थाली पूरी तरह से गर्म है ।
  4. एक बूंद (४०० µ एल) पूर्व की थाली में कुओं में से हर एक के गिलास नीचे पर गर्म LMA डालो । धीरे agarose ड्रॉप पर पूर्व गर्म PDMS स्टांप जगह है । कमरे के तापमान पर मशीन (आरटी) के लिए 5-10 मिनट पूर्व बीच बढ़िया तालमेल और पूर्व ठंडा करने के लिए । 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन पूर्ण agarose जमाना प्राप्त करने के लिए । फिर, धीरे से PDMS छील, agarose MCs के साथ नमूनों जेल छोड़ने ।
    नोट: यह चरण सभी कुओं में एक साथ किया जाता है ।
  5. एक प्रकाश इलाज प्रणाली पराबैंगनी (यूवी) चिराग से सुसज्जित में उभरा प्लेट प्लेस, और 3 मिनट के लिए गर्मी ।
    नोट: अब HMCA प्लेट यूवी निष्फल है ।
  6. बाँझ पंजाबियों के साथ स्थूल कुओं को भरने के लिए सुनिश्चित करें कि वे आर्द्र रखा जाता है, तो थाली कवर, यह parafilm के साथ लपेट और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान उपयोग जब तक ।
  7. उपयोग करने से पहले, HMCA प्लेट से खाली पंजाब अवशिष्ट । यह जैविक डाकू में जगह है ।

2. लोड हो रहा है कोशिकाओं और अंडाकार आकृति गठन

  1. निम्नानुसार कक्षों को एकत्रित करें: एक 10 सेमी संस्कृति प्लेट सेल monolayer से सभी माध्यम निकालें, दो बार पंजाब के 10 मिलीलीटर सीरम अवशिष्ट के निपटान के साथ धोने, trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें (पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में 3 मिनट के लिए मशीन । फिर, प्लेट धीरे से हिला monolayer टुकड़ी सुनिश्चित करने के लिए, पूरा मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ने (पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म) और ऊपर और नीचे पिपेट जब तक समरूप सेल निलंबन हासिल की है । केंद्रापसारक और ताजा माध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन धोने, तो, ताजा पूरा माध्यम में उचित सांद्रता पर निलंबित ।
  2. धीरे सेल निलंबन लोड (५० µ l, 150 – 360 x 103 कोशिकाओं/मिलीलीटर में मध्यम, ~ 16 – एम सी प्रति 40 कोशिकाओं) HMCA के शीर्ष पर और कोशिकाओं 15 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. धीरे अंगूठी और hydrogel सरणी के बाहर मैक्रो-अच्छी तरह से प्लास्टिक नीचे के रिम के लिए ५०० µ एल ताजा माध्यम (कुल 3-4 एमएल) के 6-8 aliquots जोड़ें ।
  4. spheroids के गठन के लिए एक humidified वातावरण में ७२ एच और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर ४८ एच के लिए MCF7 कोशिकाओं के लिए हेला कोशिकाओं की मशीन ।

3. Propidium आयोडाइड (PI) धुंधला द्वारा व्यवहार्यता का पता लगाने

  1. pi का एक शेयर समाधान तैयार (५०० µ ग्राम के प्रति 1 मिलीलीटर pi के) । के बारे में 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखो । हौसले से 1 के एक कमजोर पड़ने तैयार: 2000 (०.२५ µ g/एमएल), 6 µ एल के अलावा शेयर के 12 मिलीलीटर के लिए phenol लाल बिना पूर्ण मध्यम, 6 के लिए अच्छी तरह से HMCA प्लेट (प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर) ।
  2. 48-72 एच spheroids के साथ HMCA प्लेट, मशीन से जैविक डाकू के लिए स्थानांतरण । hydrogel सरणी के बगल में स्थूल अच्छी तरह से प्लास्टिक के नीचे के किनारे पर टिप अंत झुकाव द्वारा HMCA से सभी मध्यम निकालें, सरणी मध्यम से भरा टैंक छोड़ने ।
  3. धीरे PI के 2 मिलीलीटर कमजोर पड़ने से कदम ३.१ से एक अच्छी तरह से, स्थूल के किनारे पर टिप अंत दुबला-अच्छी तरह से प्लास्टिक नीचे झुक द्वारा जोड़ें । एक humidified वातावरण में ३७ ° c और 5% CO2, पर 1 h के लिए HMCA प्लेट की मशीन । चरण 7 पर जारी रखें ।
    नोट: अन्य रंगों के रूप में अच्छी तरह से यहाँ इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, नाभिक धुंधला के लिए Hoechst, tetramethylrhodamine मिथाइल एस्टर (TMRM) mitochondrial झिल्ली संभावित धुंधला के लिए, fluorescein diacetate (एफडीए) जीवित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, Annexin वी के लिए apoptosis पता लगाने और दूसरों ।

4. कोलेजन मिश्रण तैयारी

  1. आटोक्लेव द्वारा बाँझ डबल आसुत जल (DDW) तैयार करने और 1 मीटर NaOH फिल्टर के १०० मिलीलीटर के शेयर निष्फल समाधान । आर टी पर सामग्री बनाए रखने, और कोलेजन मिश्रण में जमे हुए तैयारी के लिए इस्तेमाल किया युक्तियां-20 ° c, जब तक उपयोग करें ।
  2. उपयोग करने से पहले 10 – 20 मिनट, सहित सभी ग्रेड: बाँझ DDW, 1 एम NaOH बाँझ समाधान, बाँझ 10x पंजाबियों, प्रकार मैं चूहे की पूंछ से कोलेजन (3 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत-महीने) और बर्फ की बाल्टी में एक बाँझ ट्यूब जब तक पूरी तरह से ठंडा. जैविक हुड के अंदर बर्फ की बाल्टी रखें ।
  3. तैयार 3 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता में कोलेजन मिश्रण के १,८०० µ एल, 6 के लिए अच्छी तरह से HMCA आक्रमण परख प्लेट (३०० µ एल प्रति अच्छी तरह से) के रूप में इस प्रकार है । नीचे के क्रम में कूल्ड ट्यूब में ग्रेड जोड़ें: ५१५ µ एल के DDW, २४.८ µ एल के 1 एम NaOH और १८० µ एल के 10x पंजाबियों. भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और बर्फ में वापस जगह है । अंत में, मिश्रण करने के लिए कोलेजन के १०८० µ एल जोड़ें, भंवर फिर से और बर्फ में वापस डाल दिया ।

5. हा आणि कोलेजन मिक्सचर वडा

  1. भंग १० में से हा की मिलीग्राम २ मिली बाँझ DDW. कुछ मिनट और भंवर के लिए आर टी पर मिश्रण गर्मी जब तक पाउडर पूरी तरह से भंग है । दो साल तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान की दुकान ।
  2. सही उपयोग करने से पहले, जैविक हुड के अंदर बर्फ की बाल्टी में हा स्टॉक समाधान जगह है ।
  3. एक 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन मिश्रण के रूप में चरण 4 में वर्णित तैयार करें । जोड़ें ३६ µ जी (७.२ µ एल) के १,८०० μL में का उपयोग करने के लिए तैयार कोलेजन मिश्रण, 20 µ जी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए/ फिर, भंवर फिर संक्षेप में और बर्फ में वापस डाल दिया ।

6. ECM मिश्रण इसके अलावा

  1. HMCA थाली स्थानांतरण, 48 के साथ-72 एच spheroids, मशीन से जैविक डाकू में और बर्फ पर जगह है । 10 मिनट के लिए मशीन जब तक प्लेट ठंडा है । पूर्व एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए 1% LMA का समाधान गर्मी ।
  2. HMCA के चारों ओर से सभी माध्यम निकालें, hydrogel सरणी के बगल में स्थूल अच्छी तरह से प्लास्टिक नीचे के किनारे पर टिप अंत झुकाव द्वारा । फिर, बहुत ध्यान से, सरणी टैंक से एक ठीक टिप के साथ सभी मध्यम निकालें/जेल लोड हो रहा है टिप, ऐरे एज पर टिप अंत झुकाव, धीरे और धीरे से सभी माध्यम से बाहर चूसने से ।
    नोट: hydrogel सरणी के चारों ओर से सभी माध्यम को हटाने के बाद, सरणी टैंक अभी भी मध्यम से भरा है । इस माध्यम को बहुत धीरे से हटा दिया जाना है क्रम में hydrogel MC और spheroids के विस्थापन के विनाश से बचने के लिए ।
  3. लेने के १५० µ एल कोलेजन मिश्रण या हा और कोलेजन मिश्रण (ECM मिश्रण) पूर्व के साथ जमे हुए ठीक टिप और सरणी के किनारे करने के लिए टिप संलग्न द्वारा सरणी टैंक में जोड़ें. अंडाकार आकृति विस्थापन से बचने के लिए धीरे से मिश्रण छोड़ें । १५० µ l की एक और aliquot के साथ इस चरण को दोहराएँ, एक कुल ३०० µ l के लिए अच्छी तरह से प्रति. एक ही प्रक्रिया का पालन करें जब तक सभी कुओं भर रहे हैं । तो ECM के पूर्ण जमाना के लिए 1 एच के लिए मशीन में थाली जगह है ।
  4. ECM के पूर्ण जमाना के बाद, LMA जेल के शीर्ष पर पूर्व गर्म 1% ECM के पिपेट ४०० µ एल हासिल किया गया है । इसके ढक्कन के साथ प्लेट कवर, 5 के लिए आर टी पर प्लेट मशीन-7 मिनट और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए, agarose जमाना के लिए । अंत में, धीरे स्थूल के किनारे पर टिप अंत दुबला-अच्छी तरह से प्लास्टिक नीचे से पूर्ण माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: agarose परत HMCA से कोलेजन जेल मैट्रिक्स की टुकड़ी रोकता है ।

7. आक्रमण परख अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. एक मोटर चालित औंधा माइक्रोस्कोप मंच पर HMCA प्लेट लोड एक मशीन के साथ सुसज्जित, पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 और humidified वातावरण के लिए समायोजित ।
  2. पूर्व एक अच्छी तरह से ताकि पूरे सरणी क्षेत्र को कवर करने के लिए छवि अधिग्रहण के लिए पदों का निर्धारण, और 10x या 4x उद्देश्यों का उपयोग करें (यह कदम छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर यहां इस्तेमाल के लिए आवश्यक है, विवरण के लिए नीचे सामग्री तालिका देखें) । वैकल्पिक रूप से, किसी भी छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए पूरे आवश्यक क्षेत्र के स्वत: स्कैन की सुविधा,"सिलाई" विकल्प का चयन करके ।
  3. प्राप्त उज्ज्वल क्षेत्र (BF) छवियां हर 2-4 एच 24 की कुल अवधि के लिए-72 एच क्रम में अंडाकार आकृति शरीर से आसपास के ECM में कोशिकाओं के आक्रमण का पालन करें ।
  4. एक समर्पित फ्लोरोसेंट घन का उपयोग करके PI का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट छवियों मोल (उत्तेजना फ़िल्टर 530 – 550 एनएम, dichroic मिरर ५६५ एनएम लंबे पास और उत्सर्जन फ़िल्टर 600-660 एनएम) ।
  5. निर्यात समय चूक BF/छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से फ्लोरोसेंट छवियां और उंहें टैग की गईं छवि फ़ाइल स्वरूप में सहेजें (TIFF) एक समर्पित फ़ोल्डर में उपकरण पट्टी में "डाटाबेस" टैब का उपयोग करके और फिर "निर्यात रिकॉर्ड फ़ाइलें" बटन ।
    नोट: हम MATLAB सॉफ्टवेयर में एक विशेष में घर विश्लेषण कोड है कि एक डिजाइन ग्राफिक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (GUI) जिसमें आक्रमण विश्लेषण तेजी से और आसान मार डाला जा सकता है विकसित किया । इस विश्लेषण कोड में, spheroids और आक्रमण क्षेत्र के विभाजन अर्द्ध स्वचालित रूप से Sobel फिल्टर रूपात्मक ऑपरेटरों कटाव और फैलाव के बाद का उपयोग किया जाता है । क्षेत्रों के स्वचालित विभाजन के बाद, मैनुअल सुधार किए गए जहां बेहतर सटीकता के लिए आवश्यक है । विभाजन पूरा होने के बाद, पैरामीटर का एक सेट स्वचालित रूप से सॉफ़्टवेयर द्वारा परिकलित किए गए थे और आगे हेरफेर के लिए किसी excel फ़ाइल में निर्यात किया गया । मानकों की सूची कर रहे हैं: समय पर बुनियादी अंडाकार आकृति अनुभागीय क्षेत्र = 0, अंडाकार आकृति शरीर से जुड़े कोशिकाओं के आक्रमण क्षेत्र = मुख्य आक्रमण क्षेत्र, मुख्य आक्रमण क्षेत्र से अलग कोशिकाओं के क्षेत्र, मुख्य आक्रमण क्षेत्र से अलग कोशिकाओं की संख्या, की औसत दूरी मुख्य आक्रमण क्षेत्र की परिधि के लिए जन के बुनियादी अंडाकार आकृति केंद्र से आक्रमण और अलग कोशिकाओं और सामूहिक आक्रमण दूरी पैरामीटर = डी (डी = √ ((x2 -x1)2 + (y2 -y1)2) से बाहर x और y अंडाकार आकृति केंद्र के बड़े पैमाने पर निर्देशांक, पहले (x1, y1) और उसके बाद (x2, y2) सामूहिक आक्रमण प्रक्रिया). वैकल्पिक रूप से, छवि विश्लेषण किसी भी अंय विशेष सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है ।
  6. जीयूआई खोलें और "लोड BF" बटन धक्का । छवि खोलने के बाद, सेगमेंटेशन पैरामीटर्स समायोजित करें (न्यूनतम आकार: > 1 और त्रिज्या बंद करें: > 1) अंडाकार आकृति और उसके आक्रमण क्षेत्र का एक सटीक विभाजन प्राप्त करने के लिए, फिर, निष्पादन के लिए "ब्याज क्षेत्र (ROI) सेगमेंटेशन" बटन दबाएँ और प्रत्येक अंडाकार आकृति के आस-पास एक बॉर्डर दिखाई देगा । यदि स्वचालित विभाजन गलत है, तो "हटाएँ" या "जोड़ें" बटन दबाएँ और अनुरोधित सुधार मैन्युअल रूप से करें. क्रमिक छवियों के लिए एक ही चरणों को दोहराएँ ।
  7. spheroids संख्या और सॉफ्टवेयर समय चूक छवियों में से प्रत्येक में प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए एक ही नंबर प्रदान करेगा करने के लिए "ट्रैकिंग" बटन दबाएँ. फिर, "माप" बटन दबाएँ, जो सभी पैरामीटर्स के साथ एक स्प्रेडशीट जेनरेट करेगा. excel सॉफ़्टवेयर में परिणाम संसाधन और आंकड़ों में आगे उपयोग के लिए इस स्प्रेडशीट को excel फ़ाइल के रूप में सहेजें ।

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Representative Results

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यूनिक HMCA इमेजिंग प्लेट का इस्तेमाल 3डी ट्यूमर spheroids के आक्रमण की परख के लिए किया जाता है । पूरे परख, अंडाकार आकृति गठन और आक्रमण की प्रक्रिया और अतिरिक्त जोड़तोड़ के साथ समाप्त होने के साथ शुरुआत, एक ही थाली के भीतर किया जाता है । अंडाकार आकृति गठन के लिए, हेला कोशिकाओं सरणी बेसिन में लोड कर रहे हैं और गुरुत्वाकर्षण द्वारा hydrogel MCs में बसा. hydrogel MCs, जो गैर अनुयाई/कम लगाव विशेषताओं, सेल सेल बातचीत और 3 डी ट्यूमर spheroids के गठन की सुविधा है । चित्रा 2a MCs में बसे कोशिकाओं को दर्शाता है, १५० x 103 कोशिकाओं के उपयोग के बाद/एमएल लोडिंग समाधान (यानी, ~ MC परिकलित मूल्य प्रति 16 कोशिकाओं) । यह स्पष्ट है कि mc प्रति कोशिकाओं के अधिभोग समान रूप से सरणी के माध्यम से वितरित नहीं है, और औसत प्राप्त आंकड़ा वितरण एम सी प्रति १४.७८ ± ३.६० कोशिकाओं है । तालिका में चित्रा बी सी पूरे HMCA प्लेट के लिए एम सी प्रति सेल वितरण संक्षेप । मैक्रो-well के भीतर कक्ष वितरण की भिंनता (CV) का औसत गुणांक ४३.३३% है, जबकि मैक्रो-वेल्स के बीच यह २४.३७% है । सेल अधिभोग में मतभेद महत्वपूर्ण है और सीधे spheroids के आकार का गठन और थाली भर में उनकी एकरूपता हुक्म । कम करने के लिए/MC प्रति कक्षों की संख्या के द्वारा बनाई गई परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, परिणामों का विश्लेषण एकल-तत्व रिज़ॉल्यूशन पर किया जाता है । चित्रा 2cडी में भूखंडों 3 दिन spheroids के आकार (अनुभागीय क्षेत्र) वितरण उदाहरण देकर स्पष्ट करना । यह आंकड़ा 2d में स्पष्ट रूप से उदाहरण है कि प्रत्येक अंडाकार आकृति के विकास के अनुपात की गणना (3 दिन में अनुभागीय क्षेत्र/2) निरपेक्ष आकार वितरण की तुलना में अधिक सजातीय वितरण किया है (चित्रा 2c), १५.४८% की एक CV उपज और ५२.८०%, क्रमशः. 3 के अंडाकार आकृति व्यास वितरण दिवस spheroids पैदावार २४.५२% की एक CV और विकास अनुपात (day3/day2 पर व्यास) ७.४५% है । इन CV मान17 या अधिक से अधिक18 अंय गुरुत्वाकर्षण द्वारा सेल लोडिंग प्राप्त करने की रिपोर्ट के समान हैं । आदेश में मापा पैरामीटर के लिए एम सी प्रति प्रारंभिक वरीयता प्राप्त कोशिका संख्या में परिवर्तनशीलता से उत्पंन प्रसरण को खत्म करने के लिए, यह प्रारंभिक कक्ष संख्या या एक ही वस्तु के किसी भी अंय मापा पैरामीटर के लिए चयनित मापदंडों को सामान्य करने के लिए बेहतर है, ऐसे कि प्रत्येक अंडाकार आकृति अपने आंतरिक नियंत्रण है । यह तरीका आसानी से HMCA इमेजिंग प्लेट पर वस्तु ट्रैकिंग द्वारा लागू किया जा सकता है ।

अंडाकार आकृति गठन और वृद्धि की प्रक्रिया HMCA इमेजिंग प्लेट पर आसानी से पालन किया जा सकता है । चित्रा 3-बी 24 एच हेला सेल समुच्चय और परिपक्व, 5 दिन 3 डी कोशिकीय वस्तुओं, जो और अधिक गोलाकार और सघन होते जा रहे है की संबंधितछवि युक्त HMCA इमेजिंग प्लेट पर एक क्षेत्र के एक BF छवि से पता चलता है । यह स्पष्ट रूप से दिखाया गया है कि ज्यादातर वस्तुओं 5 दिन की गर्मी की अवधि के दौरान अपने स्थान को बनाए रखने । अंडाकार आकृति गठन के दौरान आकार (sphericity) और आकार (अनुभागीय क्षेत्र) का विश्लेषण चित्रा 3सी में प्रस्तुत किया गया है । तितर बितर भूखंड दिन से 1 दिन से दोनों मापदंडों में वृद्धि को दर्शाता है 5; ०.५४४ ± ०.०२० a.u. से ०.६८४ ± ०.०१६ a.u. के लिए sphericity (पी < ०.०५) और ०.००३५६ ± ०.०००१३ एमएम2 से ०.००५३८ ± ०.०००१५ एमएम2 को क्रमश: सेक्शनल एरिया (p < ०.०५) के लिए । जबकि 24-एच समुच्चय छोटे है और गैर नियमित रूप से आकार है, संबंधित 5 दिन spheroids बड़ा और गोलाकार रूप प्राप्त कर रहे हैं ।

अंडाकार आकृति कोशिका व्यवहार्यता का पता लगाने के19 धुंधला जो डाई धोने के लिए की जरूरत को दरकिनार के लिए कम एकाग्रता PI का उपयोग करके मार डाला है । PI कोशिका झिल्ली प्रवेश और फिर गैर व्यवहार्य कोशिकाओं के डीएनए में intercalates । चित्रा 4a 5 दिन हेला spheroids PI के साथ दाग (लाल में) से पता चलता है. प्रत्येक अंडाकार आकृति अनुभागीय क्षेत्र से बाहर लाल क्षेत्र (मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व) के प्रतिशत का विश्लेषण चित्रा 4Bमें संक्षेप है । हिस्टोग्राम पता चलता है कि अंडाकार आकृति जनसंख्या का ८५% 5% लाल दाग क्षेत्र का एक अधिक से अधिक मूल्य है और औसत ३.०१ ± २.३४% (बाएं हिस्टोग्राम) है । spheroids के अनुभागीय क्षेत्र (सही हिस्टोग्राम) ०.०२४४७ ± ०.००४८७ mm2की औसत के साथ एक सामांय वितरण से पता चलता है ।

3 दिन परिपक्व हेला spheroids उत्पादन के बाद, आक्रमण परख HMCA इमेजिंग प्लेट के भीतर किया जाता है । इस तरह के ECM संरचना, अवरोधकों और उत्प्रेरक के रूप में चर का प्रभाव, 3 डी ट्यूमर अंडाकार आकृति आक्रमण की प्रक्रिया पर जांच की जा सकती है । आक्रमण परख प्रदर्शन के लिए, मध्यम धीरे से हटा दिया है और MC सरणी बेसिन में spheroids पर ECM समाधान पिपेट के साथ प्रतिस्थापित । ECM समाधान के पूर्ण जमाना के बाद, पूर्ण माध्यम मैक्रो में जोड़ा जाता है-well. (1) आदेश में हेला अंडाकार आकृति सहज आक्रमण की प्रक्रिया पर हा के प्रभाव की जांच करने के लिए, spheroids कोलेजन और हा मिश्रण समाधान (आंकड़ा 5 ए) के साथ कवर और कोलेजन ही समाधान (चित्रा 5C) के साथ कवर की तुलना में थे, और BF छवियों सही ECM जमाना के बाद अधिग्रहीत किया गया (टी = 0 एच) । आक्रमण प्रक्रिया की काइनेटिक इमेजिंग के बाद किया गया था एक ही क्षेत्र ६३ एच की अवधि के लिए हर 5 एच । ५० के बाद मशीन के एच, spheroids में एंबेडेड कोलेजन और हा (चित्रा 5B) के आसपास ECM में कम सेल फैलाव दिखाया के रूप में spheroids की तुलना में केवल कोलेजन (चित्रा 5d) एंबेडेड । समय के साथ आक्रमण क्षेत्र काइनेटिक के विश्लेषण, एकल अंडाकार आकृति संकल्प पर ९९ spheroids के लिए चित्रा 5Eमें संक्षेप है । चित्रा 5E भूखंड का मतलब है/औसत आक्रमण क्षेत्र के दो समूहों के समय पर, और स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि के लिए हा कोलेजन के अलावा अंडाकार आकृति के बाहर सेल फैलाव को रोकता है, छोटे आक्रमण क्षेत्रों में जिसके परिणामस्वरूप । के रूप में कोलेजन और हा समाधान (०.००१४१० ± ०.०००९४१ mm2/h) में एंबेडेड spheroids में से प्रत्येक के लिए रैखिकप्रतिगमन समायोजन घटता से उत्पंन ढलानों के औसत काफी है भिंन (p = ०.००३, t-परीक्षण: दो-नमूना मान बराबर प्रसरण) । (२) Fisetin के प्रभाव की जांच के क्रम में (एक क्रियाशील flavonoid अनेक फलों और सब्जियों में पाया गया जो phosphatidylinositol ३-कळेनासे (PI3K) सहित अनेक आणविक लक्ष्यों पर अभिनय करके cytostatic और migrastatic कार्यकलाप दिखाता है/Akt/c-Jun N-टर्मिनल kinases (JNK) सिगनल और Wnt/β-catenin सिग्नलिंग downregulates मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) और अन्य20) पर हेला अंडाकार आकृति सहज आक्रमण प्रक्रिया, दवा की बढ़ती सांद्रता को पूर्ण माध्यम से जोड़ा गया और BF छवियों टी पर अधिग्रहीत किया गया = 0 (चित्रा 6A) और 24 एच बाद में (चित्रा घमण्ड-सी) । के रूप में प्रदर्शित किया, Fisetin के 10 µ मीटर (चित्रा 6C) गैर इलाज हेला spheroids (चित्रा घमण्ड) की तुलना में spheroids के आसपास कोशिकाओं के फैलाव को रोकता है । एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग के आक्रमण क्षेत्र विश्लेषण (चित्रा 6D) Fisetin के 10-40 µ मीटर पर महत्वपूर्ण अवरोध प्रदर्शित (पी < ०.००३), 10 µ मीटर की एकाग्रता पर संतृप्ति प्राप्त करने और उच्च । (3) यह दिखाया गया है कि नहीं, एक नैनो-दाढ़ स्तर पर, ट्यूमर विस्तार और प्रवास16उत्तेजक द्वारा एक और अधिक आक्रामक स्तन कैंसर phenotype के लिए योगदान देता है । आदेश में MCF7 spheroids के सामूहिक आक्रमण की प्रक्रिया पर नहीं के प्रभाव की जांच करने के लिए कोलेजन में एंबेडेड, 1 diethylenetriamine के µ एम/नाइट्रिक ऑक्साइड दाता (DETA/पूरा संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था और BF छवियां टी = 0 और टी पर अधिग्रहीत किया गया = 20 एच नाटकीय कोई दाता के लिए जोखिम के दौरान 3 डी spheroids की आकृति विज्ञान और स्थानों में परिवर्तन (चित्रा 7A-बी) स्पष्ट कर रहे हैं । spheroids अपनी sphericity खो देते हैं और अधिक लम्बा क्य amoeboid प्रवासी phenotype बन जाते हैं. Concomitantly, आसपास कोलेजन मैट्रिक्स के भीतर spheroids की बढ़ी translocation (चित्रा 7C) मनाया गया । औसत बढ़ाव मूल्य काफी १.३०५ ± ०.१९३ a.u. से १.४७७ ± ०.२९८ a.u., (पी < ०.०००६) बढ़ गया । एक ही spheroids के लिए मापा औसत माइग्रेशन दूरी काफी बढ़ा दिया गया था, ०.०७८८ ± ०.०५७५ mm और ०.३१६४ ± ०.३३६५ mm अनुपस्थिति में और DETA/NO, क्रमशः (p < 4 x 10-6) की उपस्थिति में ।

अंडाकार आकृति आक्रमण की छवि विश्लेषण अर्द्ध स्वचालित में घर MATLAB सॉफ्टवेयर द्वारा हासिल किया गया था । HMCA के भीतर अंडाकार आकृति गठन और आक्रमण की अधिग्रहीत समय चूक छवियों एक छवि में कई spheroids के होते है (4-6 spheroids पर 10x इज़ाफ़ा और 25-30 spheroids पर 4x वृद्धि) । अंडाकार आकृति गठन, विकास और आक्रमण के विश्लेषण की छवि में सभी spheroids पर concomitantly प्रदर्शन किया गया. अंडाकार आकृति आक्रमण के लिए निकाले गए प्रमुख मापदंडों चित्रा 8A, जो एक ही समय बिंदु (टी = 16 एच) में 4 spheroids के एक प्रतिनिधि छवि विभाजन से पता चलता है में प्रस्तुत कर रहे हैं । मुख्य आक्रमण एक लाल सीमा द्वारा परिभाषित क्षेत्र है, साथ ही अलग कोशिकाओं को जो विभक्त और चारों ओर फैलाया (काले तीर से संकेत), ट्रैक और समय पर प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए गिने थे । टी पर आक्रमण से पहले अंडाकार आकृति आकार = 0 एक नीली सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है । अलग कोशिकाओं सहित आक्रमण क्षेत्र परिधि के लिए जन के अंडाकार आकृति केंद्र से मतलब/औसत आक्रमण दूरी घेर लिया लाल विभाजन से गणना की और पीले तीर से संकेत दिया है । इस समय-चूक प्रयोग से निकाले गए डेटा चित्रा 8B-डीमें संक्षेप है । चित्रा 8B समय के साथ प्रत्येक अंडाकार आकृति केंद्र से मतलब आक्रमण दूरी की पदोंनति दर्शाती है । चित्रा 8C समय के साथ spheroids में से प्रत्येक में कुल आक्रमण क्षेत्र की ऊंचाई दर्शाती है (मुख्य आक्रमण क्षेत्र और अलग से या संलग्न-सेल क्षेत्र सहित) । चित्रा 8D 1-4 अलग की भयावहता से पता चलता है-सेल क्षेत्र प्रत्येक अंडाकार आकृति (समय के साथ) के कुल आक्रमण क्षेत्र की तुलना में । विलिप्त कक्षों की संचयी संख्या क्रमश: ३३, 7, 4 और 5 spheroids #1, #2, #3 और #4 के लिए है । संलिप्त कोशिकाओं की संचई संख्या का विश्लेषण 20 से अधिक आक्रमण के ज १२६ हेला कोलेजन में एंबेडेड spheroids चित्रा 8Eमें दिखाया गया है । यहां यह प्रदर्शित किया जाता है कि वहां की जांच की आबादी में विलिप्त कोशिकाओं की संख्या में एक विशाल वितरण है और औसत मूल्य १२.३ ± १२.८ कोशिकाओं है ।

Figure 1
चित्रा 1: HMCA इमेजिंग प्लेट । () एक स्थूल की छवि-अच्छी तरह से HMCA के साथ उभरा । () HMCA इमेजिंग प्लेट के भीतर एक एम सी के एक पार अनुभाग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल वितरण की एकरूपता और HMCA इमेजिंग प्लेट में अंडाकार आकृति वृद्धि अनुपात । (एक) BF और HMCA की फ्लोरोसेंट छवियों हेला कोशिकाओं के साथ भरी हुई पूर्व Hoechst ३३३४२ १ µ जी/एमएल (लोड हो रहा है एकाग्रता १५० x 10 एमएल प्रति3 कोशिकाओं) के साथ दाग की एक उपरिशाई । छवियों को एम सी में सेल निपटान के बाद सही अधिग्रहीत किया गया । छवि आवर्धन 4x, स्केल बार = ५०० µm । () तालिका HMCA-6-well इमेजिंग प्लेट के भीतर हेला कोशिकाओं के वितरण का सार । कक्षों को ९० MC/मैक्रो-वेल तक से गिना गया । परिणाम के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± मानक विचलन (एसडी), CV (sd/mean100) के भीतर और स्थूल कुओं के बीच की गणना की है । () 3 दिन spheroids के अनुभागीय क्षेत्र के वितरण हिस्टोग्राम, n = ४१८, BF छवियों से निर्धारित । () अंडाकार आकृति वृद्धि अनुपात का वितरण हिस्टोग्राम (दिन ३/2 दिन में अनुभागीय क्षेत्र). वृद्धि अनुपात ४१८ spheroids में से प्रत्येक के लिए एकल तत्व संकल्प पर गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: HMCA इमेजिंग प्लेट में अंडाकार आकृति गठन ट्रैकिंग । हेला कोशिकाओं की BF छवि (लोड हो रहा है एकाग्रता १२० x 10 एमएल प्रति3 कोशिकाओं) 1 दिन (एक) और 5 दिनों के लिए HMCA में मशीन () । छवि इज़ाफ़ा 4x, स्केल बार = ५०० माइक्रोन । () 3 डी वस्तु sphericity के तितर बितर भूखंड अपने अनुभागीय क्षेत्र के एक समारोह के रूप में, 1 दिन (नीले हीरे) और 5 दिनों के बाद मशीन पोस्ट सेल लदान के (ब्राउन चौकों) । प्रत्येक मार्कर एक एकल अंडाकार आकृति, n = ८३ से विश्लेषण डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: परिपक्व spheroids में सेल व्यवहार्यता का पता लगाने । BF और 5 दिन spheroids की फ्लोरोसेंट छवियों का एक उपरिशाई (लोड हो रहा है एकाग्रता ३६० x 103 एमएल प्रति कोशिकाओं) PI ०.२५ µ g/एमएल () के साथ सना हुआ । छवि इज़ाफ़ा 4x, स्केल बार = ५०० µm. () वितरण हिस्टोग्राम अंडाकार आकृति के अनुभागीय क्षेत्र के सापेक्ष PI क्षेत्र के प्रतिशत का (बायां पैनल) और वितरण हिस्टोग्राम अनुभागीय क्षेत्र (दाएँ फलक), n = ८४. PI क्षेत्र का प्रतिशत ८४ spheroids में से प्रत्येक के लिए एकल-तत्व रिज़ॉल्यूशन पर परिकलित की जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: अंडाकार आकृति आक्रमण प्रक्रिया पर ECM संरचना का प्रभाव । 3 दिन हेला spheroids के BF छवियां 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन और 20 µ जी/एमएल हा (के एक मिश्रण में एंबेडेड) और 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन (सी), टी पर = 0 एच और ५० के बाद एच (बी) और (डी), क्रमशः । छवि आवर्धन 10x, स्केल बार = २०० µm । HMCA इमेजिंग प्लेट उल्टे मशीन से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के मंच पर लोड किया गया था । छवियां हर 5 ज अधिग्रहीत और काइनेटिक विश्लेषण भूखंड में प्रस्तुत किया गया है (), n = ९९ । प्रत्येक वक्र समय के साथ आक्रमण क्षेत्र वृद्धि का मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है, के लिए कोलेजन और हा (नीले हीरे) और केवल कोलेजन (ब्राउन चौकों) के लिए । औसत रेखीय प्रतीपगमन वक्र और उसके समीकरण और R-वर्गित मान वक्रों के ऊपर इंगित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Fisetin हेला spheroids के सहज आक्रमण को रोकता है । 3 दिन हेला spheroids के BF छवियां, 3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन का एक मिश्रण में एंबेडेड () टी = 0 पर और फिर, 0 µ एम के अलावा 24 ज () और 10 µ एम Fisetin (सी) पूरा संस्कृति माध्यम के लिए । छवि बढ़ाएं 4x, स्केल बार = ५०० µm । आक्रमण क्षेत्र का विश्लेषण अंत बिंदु (टी = 24 एच) में प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए साजिश (डी), n = ४८८ में प्रस्तुत किया है । वक्र 0-40 µ एम Fisetin के एक समारोह के रूप में आक्रमण क्षेत्र के मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है । Fisetin उपचार काफी 10 µ m पर आक्रमण को रोकता है (p = ४.६५ x 10-6), 20 µ m (p = ०.००२१) और ४० µ m (p = ४.८६ x 10-8), t-परीक्षण का उपयोग कर: दो-नमूना मान बराबर प्रसरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: कोई MCF में सामूहिक आक्रमण प्रेरित-7 स्तन कैंसर spheroids । 2 दिन MCF के BF छवियां-7 स्तन कैंसर spheroids, कोलेजन में एंबेडेड (A) पर (t = 0) और (B) के बाद 20 एच के लिए जोखिम 1 µ m DETA/ अंडाकार आकृति रॉय विभाजन लाल सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है, मढ़ा और पर लाल रंग में गिने bf छवियां A और b. ROIs ब्लू सीमा द्वारा परिभाषित, bf छवि बी पर मढ़ा अंडाकार आकृति आकार और स्थान पर टी = 0 प्रतिनिधित्व करते हैं । आवर्धन 4x, स्केल बार = ५०० µm. () बढ़ाव कारक और व्यक्तिगत स्तन कैंसर के प्रवास दूरी के बीच सहसंबंध की एक तितर बितर साजिश 1 µ m DETA के लिए जोखिम पर () के रूप में नियंत्रण की तुलना में (नीले हीरे) टी पर = 20 ज, n = ५४ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: हेला सेल सहज आक्रमण छवि विश्लेषण । 3 दिन हेला spheroids के BF छवियों, कोलेजन में embedding के बाद 16 ज (एक) । आवर्धन 10x । अंडाकार आकृति आक्रमण क्षेत्र और संलिप्त कोशिकाओं लाल सीमा से परिभाषित कर रहे हैं, टी = 0 पर अंडाकार आकृति आकार नीले रंग की सीमा से परिभाषित किया गया है, द्रव्यमान का अंडाकार आकृति केंद्र से मतलब आक्रमण दूरी पीले तीर और विलिप्त कोशिकाओं द्वारा संकेत दिया जाता है काले तीर से संकेत मिलता है । भूखंड मास के अंडाकार आकृति केंद्र से मतलब आक्रमण दूरी के समय के साथ वृद्धि () और कुल आक्रमण क्षेत्र (सी) । घटता अंडाकार आकृति #1 (नीले हीरे), अंडाकार आकृति #2 (भूरे रंग के चौकों), अंडाकार आकृति #3 (हरे त्रिकोण) और अंडाकार आकृति #4 (बैंगनी Xs) का प्रतिनिधित्व करते हैं । () समय के साथ मुख्य (नीला) और अलग सेल (ब्राउन) आक्रमण क्षेत्र वृद्धि का पट्टी चार्ट । () आक्रमण प्रक्रिया के 20 ज के दौरान प्रति अंडाकार आकृति पृथक कक्षों की संचयी संख्या का वितरण हिस्टोग्राम, n = १२६. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि रहने वाले जीवों, उनके जटिल 3d कोशिकीय संगठन द्वारा विशेषता काफी अलग है आमतौर पर इस्तेमाल किया 2d monolayer प्रसंस्कृत कोशिकाओं से, महत्वपूर्ण सेलुलर मॉडल जो बेहतर कार्यों की नकल का उपयोग करने की आवश्यकता पर बल और दवा स्क्रीनिंग के लिए जीवित जीव की प्रक्रिया । हाल ही में, कोशिकीय spheroids, organotypic संस्कृतियों, organoids और अंगों पर एक चिप मानकीकृत दवा खोज में इस्तेमाल के लिए8 पेश किया गया है । हालांकि, 3d कोशिकीय है मॉडल महान जटिलता काफी अपनी मजबूती, parallelization और डेटा विश्लेषण है जो परख दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है ख़तरे में डालना ।

आक्रमण क्षमता के मात्रात्मक मूल्यांकन आमतौर पर hydrogel सामग्री के माध्यम से कोशिकाओं के आंदोलन के उपाय । आदेश में ट्यूमर पारंपरिक माइक्रो अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर आक्रमण को मापने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं की बड़ी संख्या दौर नीचे प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे है और कुल केंद्रापसारक द्वारा21,22मजबूर । इन प्लेटों के आसपास के कुओं में सेल/अंडाकार आकृति बातचीत सीमित है, जबकि दौर नीचे ऑप्टिकल गुणवत्ता नुकसान पहुंचा और छवि अधिग्रहण पेचीदा । अंय तरीकों में, व्यक्तिगत कोशिकाओं बेतरतीब ढंग से hydrogel के भीतर समझाया, बढ़ने और एक 3 डी वातावरण में काम करते हैं, लेकिन जरूरी परिपक्व spheroids23,24में विकसित नहीं है । इसके अलावा, hydrogel के भीतर सेल पोजिशनिंग के लिए जटिल प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है, जैसे चुंबकीय बल आधारित सेल patterning25 या दो-फोटॉन लेजर विकिरण के साथ क्रियाशील hydrogels26

HMCA आधारित प्रौद्योगिकी प्रस्तुत इस के साथ साथ उपरोक्त विधियों पर लाभप्रद साबित होता है: सेल पोजिशनिंग, सहज एकत्रीकरण और कुछ फैलाया कोशिकाओं से spheroids के निर्माण आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, मूल्यवान सीमित सेलुलर के उपयोग को सक्षम करने नमूना (जैसे, कैंसर स्टेम कोशिकाओं या प्राथमिक रोगी नमूनों से व्युत्पंन कोशिकाओं की तरह) । प्रणाली दोनों कोशिकाओं है कि spheroids रचना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने सटीक स्थानिक स्थान पर दीर्घकालिक प्रयोगों के दौरान की प्रकृति पर नियंत्रण है । इसके अलावा, एम सी के फ्लैट नीचे एक ही फोकल योजना पर कई spheroids की पीढ़ी की सुविधा, इसलिए तेजी से रोशनी और एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के माध्यम से बड़े क्षेत्रों की छवि अधिग्रहण संभव है, जटिल के लिए की जरूरत को नष्ट करने समय लेने वाली फोकल माइक्रोस्कोपी । प्रणाली को संभालने के लिए आसान है और उसकी व्यावहारिकता संभव है । सरल परिचालन प्रक्रियाओं को लागू करके, हम अंडाकार आकृति आबादी है जिसमें लगभग ५०% spheroids की तुलना आकार और कैंसर सेल आक्रमण क्षमता का एक विश्वसनीय विश्लेषण है की उच्च अधिभोग हासिल की । इसके अलावा, आक्रमण क्षमता पर दवाओं के प्रभाव के साथ एक साथ उच्च सामग्री विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करके अपने cytostatic और/या साइटोटोक्सिक प्रभाव के साथ विश्लेषण किया जा सकता HMCA डिवाइस के साथ कई spheroids के साथ प्रसंस्कृत । इसके अलावा, HMCA में, सभी सेलुलर तत्व एक ही स्थान और माध्यम का हिस्सा है, यह अंडाकार आकृति-अंडाकार आकृति बातचीत जो आम तौर पर सेल के माध्यम से मध्यस्थता की है की जांच करने के लिए संभव बनाने के स्रावित साइटोकिंस, chemokines, हार्मोन और ECM27. इस पार बात अस्तित्व और व्यक्तिगत कोशिकाओं के समारोह/स्थूल-well मात्रा में छोटे सेल समूहों की सुविधा ।

प्रोटोकॉल के निष्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम spheroids के शीर्ष पर ECM मिश्रण के अलावा और उसके उचित बहुलकीकरण मांय है । spheroids प्रवासी व्यवहार नहीं दिखा भी अगर वे ECM के भीतर एंबेडेड हैं, जब तक विधानसभा और पार से जोड़ने होते हैं, और उपयुक्त कोलेजन फाइबर का गठन कर रहे है नहीं होगा । कोलेजन फाइबर BF रोशनी से मनाया जा सकता है, और हम एक खुर्दबीन के नीचे थाली की जांच की सलाह के लिए इस चरण के अंत में कोलेजन फाइबर के निर्माण की पुष्टि करें । spheroids की संख्या के बाद से प्रारंभिक कोशिका एकाग्रता पर निर्भर है और कब्जा कर लिया MCs का प्रतिशत, सरणी प्रारंभिक सेल लदान के बाद जांच की जानी चाहिए, और यदि सेल अधिभोग इष्टतम नहीं है, फिर से एक ही सरणी के बोने की जा सकती है । दरअसल, आकार और HMCA की ज्यामिति यहां वर्णित के लिए अपेक्षाकृत छोटे सेल क्लस्टर (व्यास में १५० µm तक) को समायोजित डिजाइन किए गए थे । यह सरणी के एक नए प्रकार के डिजाइन के बाद से एक सीमा माना जा सकता है बड़ा सेल संरचनाओं से सेल माइग्रेशन विश्लेषण के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

वर्तमान मंच न्यूनतम कक्ष संख्या और छोटे एजेंट मात्रा का उपयोग करता है, जबकि एक ही समय में एक बड़ा नमूना आकार प्रदान (प्लेट प्रति spheroids के हजारों). आदेश में विरोधी मेटास्टेटिक गतिविधि के लिए 12 अलग यौगिकों का विश्लेषण करने के लिए, 2 एकल 6-अच्छी तरह से HMCA आधारित प्लेटों की आवश्यकता होगी, के बारे में ५,००० spheroids से परिणाम उपज, जबकि कम से १४६ अच्छी तरह से प्लेटें एक ही परिणाम प्राप्त करने की जरूरत होगी । HMCA में व्यक्तिगत वस्तु संकल्प पर प्रवास का विश्लेषण करने की क्षमता सांख्यिकीय मजबूती और सटीकता के एक उच्च स्तर प्रदान करता है, कई spheroids में संरचनात्मक और कार्यात्मक आक्रमण विविधता के अध्ययन को सक्षम करने ।

इस अध्ययन के विशिष्ट स्तन कैंसर अंडाकार आकृति आबादी के सामूहिक आक्रमण को दर्शाता है DETA के लिए जोखिम पर/ MCF7 कोशिकाओं के सेल क्लस्टर amoeboid प्रवासी phenotype दिखाने के लिए, और प्रत्येक अंडाकार आकृति की आकृति विज्ञान और स्थान में मात्रात्मक परिवर्तन स्वचालित रूप से प्राप्त किया जा सकता है । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली सरणी प्रणाली है कि निगरानी और कई 3d संरचनाओं में सामूहिक आक्रमण के विश्लेषण की सुविधा है । प्रत्येक अंडाकार आकृति के लिए सापेक्ष दिशाओं और आक्रमण की दूरी का विश्लेषण करके, जनसंख्या के भीतर spheroids के बीच पारस्परिक संपर्क का अध्ययन संभव है । इसके अतिरिक्त, कैंसर सेल व्यवहार28 पर extracellular microenvironment कारकों के स्थापित प्रभाव यहां सचित्र है । इन कारकों के अलावा, कठोरता और microenvironment की संरचना के लिए जोरदार सेल प्रवास को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है । HMCA प्रौद्योगिकी एक परिभाषित प्रदान करता है, biomimetic, इन विट्रो मंच, जिसमें ECM के इन गुणों को आसानी से पहुंचा जा सकता है और नियंत्रित । शुद्ध कोलेजन प्रकार की कठोरता मैं 3 मिलीग्राम/एमएल जो इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था की एकाग्रता पर hydrogel, लगभग 50-600 Pa29,30,31 और के अलावा होने की सूचना है (20 µ g/ml; ०.४ wt%) नहीं बदला hydrogel की कठोरता काफी३२,३३। इस प्रकार, मध्यम आणविक भार के दमन प्रभाव (एमएमडब्ल्यू)-3 डी हेला spheroids के आक्रमण पर हा जो यहां प्रदर्शन किया गया था कठोरता में परिवर्तन के कारण नहीं है । इन परिणामों के पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में है जो हा आणविक वजन पर उच्च निर्भरता के साथ कैंसर सेल आक्रमण पर हा के एक bimodal प्रभाव दिखाया३४,३५,३६,३७

तरीकों के भविष्य अनुप्रयोगों के साथ साथ मल्टी सेल प्रकार संवर्धन ट्यूमर और stromal कोशिकाओं के मैक्रो के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में अच्छी तरह से शामिल हैं, और बहाव आणविक विश्लेषण के लिए विशिष्ट spheroids की पुनर्प्राप्ति.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को मोशे शिमॉन और जूडिथ Weisbrodt के वसीयत ने सपोर्ट किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis P06-14-1.5-N Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen 16520100 A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C
Trypsin EDTA solution B Biological Industries 03-052-1A Warmed to 37 °C before use
DMEM medium, high glucose Biological Industries 01-055-1A Warmed to 37 °C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS) Biological Industries 04-122-1A Heat Inactivated
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Biological Industries 02-023-5A Kept on ice before use
NaOH, anhydrous Sigma-Aldrich S5881-500G Used for the preparation of 1 M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL Trevigen 3440-100-01 Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H5542-10MG Kept on ice before use
Fisetin Sigma-Aldrich F505-100MG Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO Enzo Life Sciences alx-430-014-m005 Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI Sigma-Aldrich P4170 Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply Dymax Corporation PN 39823 Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope Olympus Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope Life Imaging Services Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM Marzhauser Wetzlar GmbH Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera Hamamatsu Photonics Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection Chroma Technology Corporation Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software Olympus Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software Mathworks Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software Microsoft Used for data management, calculation, plot creation and statistics

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References

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कैंसर सेल आक्रमण और विरोधी मेटास्टेटिक दवा Hydrogel सूक्ष्म चैंबर सरणी (HMCA) का उपयोग कर स्क्रीनिंग के विश्लेषण-प्लेट्स आधारित
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Ravid-Hermesh, O., Zurgil, N., Shafran, Y., Afrimzon, E., Sobolev, M., Hakuk, Y., Bar-On Eizig, Z., Deutsch, M. Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates. J. Vis. Exp. (140), e58359, doi:10.3791/58359 (2018).More

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