HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.
암 전이 암 치의 90% 원인으로 알려져 있다. 전이 인접 조직으로 종양 세포의 침투/침공과는 다단계 프로세스입니다. 따라서, 침략 전이, 매우 중요 한 침공 과정 연구와 반대로 전이성 약물의 개발을 하는 중요 한 단계입니다. 이 수요를 해결 하기 위해 단단한 종양의 구조를 모방 하는 3 차원 생체 외에서 모델을 개발할 필요가 있다 그리고 vivo에서 상태 한 손으로, 하지만 동시에 가장 밀접 하 게 그들의 microenvironment 재현, 강력 하 고 적합 고수익 고 높은 콘텐츠 측정입니다. 현재, 대부분 침공 분석 적절 한 정교한 미세 기술을 의지할 연구 하지만 대량 약물 검사. 각 잘에서 격리 된 개별 spheroids와 플레이트 기반 장치를 사용 하 여 다른 분석 실험 자료 소모 고 조건 당 낮은 샘플 크기. 현재 프로토콜의 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 우리는 종양 침입과 반대로 전이성 신약의 연구에 대 한 HMCA 이미징 플레이트에 따라 침입 분석 결과 대 한 3D 모델을 개발 했다. 이 장치는 지속적으로 하 고 동시에 관찰 하 고 측정 하는 매체에 대 한 단일 요소 해상도에서 spheroids 동안 ECM 구성 요소에 의해 포위 잘 (조건 당 높은 샘플 크기) 당 수많은 균일 한 spheroids의 생산 수 있습니다. 반대로 전이성 약물의 처리량 심사입니다. 이 플랫폼 여기 헬러와 MCF7 예증 단일 셀 및 집단의 침략에 대 한 spheroids의 생산에 의해 제공 됩니다. 우리는 헬러 spheroids 주위의 콜라겐의 침략 적 용량에 ECM 성분 히 알루 론 산 (HA)의 영향을 비교 합니다. 마지막으로, 우리 소개 Fisetin (침공 억제제) 헬러 spheroids 및 산화 질소 (NO) (침공 활성 제) MCF7 spheroids. 결과 다중 매개 변수 검사를 용이 하 게 하는 반자동, 간단 하 고 빠른 분석을 가능 하 게 사내 소프트웨어에 의해 분석 된다.
암 사망은 먼 위치에 전이성 세포의 보급에 주로 기인 합니다. 암 치료에 많은 노력 대상 또는 전이성 식민지의 형성과 조직의 전이성 질환1의 진행 방지에 초점. 암 세포 마이그레이션 종양 전이 과정에서 중요 한 단계 이다, 따라서, 암 침입 캐스케이드의 연구는 매우 중요 하 고 필수 안티 전이성 치료제를 찾는 데는.
전이성 질환 연구 도구로 동물 모델의 사용은 매우 비싼 고 하지 항상 인간의 종양의 대표적인 발견 되었습니다. 또한, 세포 외 microenvironment 토폴로지, 역학 및 구성 강하게 영향을 암 세포 행동2. Vivo에서 모델은 본질적으로 분리 및 암 내 습 및 전이에 공헌 하는 같은 특정 매개 변수를 제어 하는 능력 부족, 이후 제어 생체 모방 체 외에서 모델에 대 한 필요가 있다.
먼 장기에 전이 하기 위해서는 암 세포 치료에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 철새와 침략 phenotypic 특성 전시 한다. 그러나, 때문에 대부분의 시험관에 암 모델 고체 종양3의 실제 기능을 모방 하지 않는, 순수 관련 고기 감지 하 매우 도전 이다. 또한, 종양, 내 존재 하는 phenotypic이 지시 형 감독 요법, 예를 들어, 전이 시작 셀을 대상으로 검색 하려면 단일 요소 해상도 종양 마이그레이션 분석 필요 다른 유형의 종양4내의 인구입니다.
세포 운동 성 및 집단의 연구는 주로 균질 평면 표면에 상피 세포의 단층 문화에서 실시 됩니다. 암 세포 마이그레이션에 대 한 이러한 기존의 셀룰러 모델 막과 ECM의 구성 요소5를 통해 침입 하는 개별 셀의 인구 분석을 기반으로 하지만 이러한 시스템에서 개별 셀 사이의 본질적인 차이점 수 없습니다. 공부. 건설 기계를 통해 또는 비 계 없는 마이크로 구조에서 우수한 종양 연구 수단으로 간주 됩니다 생성 3D spheroids 세포 성장과 암 침공6,,78. 그러나, 가장 3D 시스템은 높은 처리량 형식에 적합 하 고 격리 된 개별 spheroids 각 마이크로 잘9에서 생성 되므로 간 회전 타원 체 상호 작용 달성 일반적으로 수 없습니다. 그러나 암 마이그레이션 관련 된 최근 연구는 미세 장치3,10,,1112에 근거 하,, 이러한 정교한 미세 도구 생산 하기 어려운 고 수 없습니다. 반 침략 적 약물의 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량에 사용할 수 있습니다.
두 가지 주요 고기, 집단 및 개별 셀 마이그레이션, ECM 장벽을 극복 하는 종양 세포에서 역할을 하 고 주변 조직 침입 되어 시연된13,14, 각 고유 표시 형태학 특성, 생화학, 분자 및 유전적 메커니즘입니다. 또한, 두 가지 형태의 마이그레이션 종양 세포, 섬유 아 세포와 같은 및 amoeboid, 각 표현 형에서 관찰 된다. 둘 다, 이후 침공 고기 및 마이그레이션 모드, 주로 형태학 속성에 의해 정의 됩니다, 그리고 휴대에 대 한 필요 모델 그 사용 영상 기반 탐지와 종양 내 습 및 마이그레이션 모든 형태의 시험 세포.
현재 방법의 전반적인 목표는 종양 spheroids의 큰 인구에서 침략 용량 분석을 위한 간단 하 고 재현성 biomimetic 3D 체 외에서 세포 기반 시스템을 제공 하는입니다. 여기, 종양 침입과 반대로 전이성 치료의 연구에 대 한 HMCA 기반 6-잘 이미징 플레이트를 소개합니다. 기술은 균일 한 3D 종양 spheroids (우물 당 450) 히드로 마이크로-챔버 (MC) 구조에서 다 수의 형성 수 있습니다. 다양 한 ECM 구성 요소는 주변 환경에 셀의 침공 수 있도록 회전 타원 체 배열에 추가 됩니다. 침공 과정 같은 개별 spheroids/침입 세포의 단기 및 장기 관찰에 의해 지속적으로 모니터링 하 고 형태학 상 특성, 형광 얼룩이 지 고 언제 든 지 특정 spheroids의 검색을 용이 하 게. 수많은 spheroids 공유 공간과 매체, 개별 spheroids와 그들의 영향을 서로 사이 용 해 분자를 통해 상호 작용 가능 하다. 자동 이미지 분석은 많은 양의 데이터 빠르고 효율적 컬렉션을 가능 하 게 사내 MATLAB 코드를 사용 하 여 수행 됩니다. 플랫폼 안티 침공 마약의 중간 처리량 심사 허용 시간 효율적인 방식으로 수많은 spheroids/침입 셀의 정확한, 동시 측정을 쉽게 합니다.
그것은 잘 문서화 살아있는 유기 체, 그들의 복잡 한 3D 다세포 조직이 특징으로하는 꽤 다른 일반적으로 사용 되 2 차원 단층 배양 세포, 더 나은 기능을 모방 하는 휴대 전화 모델을 사용 하는 중요 한 필요를 강조 그리고 마약에 대 한 생명체의 프로세스 심사. 최근, 다세포 spheroids, organotypic, organoids 문화와 장기 온 칩 도입된8 표준화 된 약물 발견에 사용 되었습니다. 그러나, 3D ?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 쉐 시몬과 주 디스 Weisbrodt의 유 증에 의해 지원 됩니다.
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |