Summary
En HMCA-baserat imaging tallrik presenteras för invasionen analysens prestanda. Denna platta underlättar bildningen av tredimensionella (3D) tumör spheroids och mätning av cancer cell invasion in i extracellulär matrix (ECM). Invasion assay kvantifiering uppnås genom semi-automatisk analys.
Abstract
Cancer metastaser är kända för att orsaka 90% av cancer dödlighet. Metastaser är en flerstegs process som initierar med penetration/invasionen av tumörceller i närliggande vävnad. Således, invasion är ett avgörande steg i metastaser, att göra invasion process forskning och utveckling av anti metastaserande droger, mycket betydelsefullt. För att möta denna efterfrågan, det finns ett behov av att utveckla 3D i vitro modeller som imiterar arkitekturen av solida tumörer och deras närmiljön närmast till i vivo stat å ena sidan, men samtidigt vara reproducerbara, robust och passar hög avkastning och hög innehåll mätningar. För närvarande, de flesta invasion analyser luta på sofistikerade mikroflödessystem tekniker som är lämpliga för forskning men inte för hög volym drogkontroll. Andra analyser som använder plattan-baserade enheter med isolerade enskilda spheroids i varje brunn är materialet konsumerar och har låg provstorlek per tillstånd. Syftet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Vi utvecklat en 3D-modell för invasionen analys baserat på HMCA imaging plate för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande läkemedelsutveckling. Denna enhet möjliggör produktion av talrika enhetliga spheroids per brunn (höga provstorlek per skick) omgiven av ECM komponenter, medan kontinuerligt och samtidigt att observera och mäta spheroids enda element upplösning för medium Throughput screening av anti metastaserande droger. Denna plattform presenteras här genom uppvisande av HeLa och MCF7 spheroids för exemplifierar enskild cell och kollektiva invasion. Vi jämför påverkan av ECM komponent hyaluronsyra (HA) av kollagen som omger HeLa spheroids invasiv förmåga. Slutligen, vi introducerar Fisetin (invasion-hämmare) till HeLa spheroids och kväveoxid (NO) (invasion aktivare) till MCF7 spheroids. Resultaten analyseras av interna programvara som möjliggör halvautomatiska, enkel och snabb analys vilket underlättar multi-parameter undersökning.
Introduction
Cancerdöd tillskrivs främst spridning av metastaserande celler till avlägsna platser. Många insatser i cancerbehandling fokuserar på inriktning eller förhindra bildandet av metastaserande kolonier och progression av systemisk metastaserande sjukdom1. Cancer cellmigration är ett avgörande steg i processen tumör metastasering, forskningen av cancer invasion kaskad är således mycket viktigt och en förutsättning att hitta anti metastaserande therapeutics.
Användning av djurmodeller som verktyg för att studera metastaserad sjukdom har visat sig vara mycket dyrt och inte alltid representativa för tumören hos människor. Dessutom påverkar extracellulära mikromiljö topologin, mekanik och sammansättning starkt cancer cell beteende2. Eftersom i vivo modeller saknar inneboende förmåga att skilja och kontrollera sådana specifika parametrar som bidrar till cancer invasion och metastasering, finns det ett behov för kontrollerbar biomimetiska in vitro- modeller.
För att metastasera till avlägsna organ, måste cancerceller uppvisar flyttande och invasiv fenotypiska drag som kan vara riktad terapi. Eftersom de flesta i vitro cancer modeller inte efterlikna riktiga funktioner av solida tumörer3, är det emellertid mycket utmanande att upptäcka fysiologiskt relevanta fenotyper. Dessutom dikterar den fenotypiska heterogenitet som finns inom tumören, behovet för att analysera tumör migration enda element upplösning för att upptäcka fenotyp-riktade terapier, till exempel genom att rikta cellen metastas-initiera befolkningen inom heterogen tumörer4.
Studien av cell motilitet och kollektiva migration genomförs främst i enskiktslager kulturer av epitelceller på homogena plana ytor. Dessa konventionella cellular-modeller för cancer cellmigration baseras på en analys av enskilda celler invaderar genom membran och ECM komponenter5, men i sådana system, till inneboende skillnader mellan enskilda celler kan inte studerade. Generera 3D spheroids antingen via ställningar eller i byggnadsställning-fri mikro-strukturer är ansedd som en överlägsen innebär att studera tumören cell tillväxt och cancer invasion6,7,8. Men mest 3D system lämpar sig inte till hög genomströmning format och Inter sfäroid interaktion vanligtvis uppnås inte eftersom isolerade enskilda spheroids genereras i varje mikro-väl9. Nyligen genomförda studier som involverar cancer migreringen är baserade på mikroflödessystem enheter3,10,11,12, dock dessa sofistikerade mikroflödessystem verktyg är svåra att tillverka och inte kan användas för hög genomströmning screening (HTS) av anti invasiva droger.
Två huvudsakliga fenotyper, kollektiva och individuella cellmigration, som spelar en roll i tumörceller att övervinna ECM barriären och invaderar angränsande vävnad, har varit visat13,14, varje visning distinkta morfologiska egenskaper, biokemiska och molekylära genetiska mekanismerna. Dessutom kan två former av migrerar tumörceller, fibroblast-liknande och amoeboid, observeras i varje fenotyp. Eftersom båda, invasion fenotyper och migration lägen, definieras främst av morfologiska egenskaper, det finns ett behov av cellular modeller att aktivera imaging-baserad detektion och granskning av alla former av tumör invasion och migrera celler.
Det övergripande målet för den nuvarande metoden är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D i vitro cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Här introducerar vi HMCA-baserade 6-väl tänkbar plattan för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande terapi. Tekniken gör det möjligt för bildandet av ett stort antal enhetliga 3D tumör spheroids (450 per brunn) i en hydrogel mikro-chambers (MC) struktur. Olika ECM komponenter läggs till i arrayen sfäroid aktivera invasionen av cellerna i den omgivande miljön. Invasionen-processen övervakas kontinuerligt av kort - och långsiktiga observationen av samma enskilda spheroids/invaderar celler och underlättar morfologisk karakterisering, fluorescerande färgning och hämtning av specifika spheroids när som helst. Eftersom många spheroids dela utrymme och medium, är interaktion via lösliga molekyler mellan enskilda spheroids och deras inverkan på varandra möjligt. Semi-automatisk bildanalys utförs med hjälp av interna MATLAB-kod som möjliggör snabbare och effektivare insamling av stora mängder data. Plattformen underlättar korrekt, samtidig mätning av många spheroids/invaderar celler på ett tidseffektivt sätt, så att medelstora throughput screening av anti invasion droger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HMCA plattan prägling
Obs: Den kompletta processen för utformning och tillverkning av Polydimetylsiloxan (PDMS) stämpel och HMCA imaging plate används i detta protokoll är beskrivs i detalj i vår tidigare artiklarna15,16. PDMS stämpel (negativ form) används till Relief på HMCA (positiv form) som består av cirka 450 MCs per brunn (figur 1A). Som framgår i figur 1B, alla MCs har en form av en stympad uppochnervänt fyrkantig pyramid (höjd: 190 µm, små basareal: 90 µm x 90 µm och stora basareal: 370 µm x 370 µm). HMCA plattan används för beredning och odling av 3D tumör spheroids och därefter för invasionen assay. Alternativt skulle en kommersiella stämpel kunna användas för produktion av HMCA.
- Bered en lösning av 6% låg smälttemperatur agaros (LMA). Sätt i LMA pulver och steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (LMA 0.6 g per 10 mL PBS) i en glasflaska med en magnetisk omrörare. Placera flaskan på en värmeplattan och rör om lösningen medan värme till 80 ° C för ett par timmar tills en enhetlig lösning uppnås. Förvara lösningen vid 70 ° C fram till användning.
- Förvärm PDMS stämpeln till 70 ° C i ugnen. Hålla den varm fram till användning. Alternativt använda en kommersiell stämpel och Följ instruktionen.
- Placera de kommersiella 6-väl glasbotten plattorna på en torr badkar som förvärmts till 75 ° C. Vänta några minuter tills plattan är helt varm.
- Häll en droppe (400 µL) av förvärmd LMA på glas botten var och en av brunnarna i plattan. Placera försiktigt den förvärmda PDMS-stämpeln över agaros drop. Inkubera vid rumstemperatur (RT) i 5 – 10 min för pre gelbildande och pre-Cooling. Inkubera vid 4 ° C i 20 min att uppnå full agaros gelation. Sedan försiktigt lossna den PDMS, lämnar det agarosgel mönstrad med MCs.
Obs: Detta steg görs samtidigt i alla brunnar. - Placera präglade plattan i en ljus bota system utrustade med ultraviolett (UV) lampa och inkubera i 3 min.
Obs: Nu HMCA plattan är UV-steriliseras. - Fyll makro-brunnarna med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning så att de hålls fuktiga, sedan täcka plattan, Linda den med parafilm och lagra den på 4 ° C fram till användning.
- Före användning, Töm PBS rester från HMCA plattan. Placera den i biologiska huven.
2. Ladda celler och sfäroid bildandet
- Samla in cellerna så här: ta bort alla medium från en 10 cm kultur plattan cell enskiktslager, tvätta två gånger med 10 mL PBS att avyttra serum residualer, tillsätt 5 mL av trypsin (pre värmas till 37 ° C) och inkubera i 3 min i inkubatorn vid 37 ° C. Sedan skaka plattan försiktigt att säkerställa enskiktslager avlossning, tillsätt 10 mL av komplett medium (pre värmas till 37 ° C) och pipett upp och ner tills homogen cellsuspension uppnås. Centrifugera och tvätta cellsuspension med 15 mL färsk medium, då, stänger vid lämpliga koncentrationer i färska komplett medium.
- Försiktigt Ladda cellsuspensionen (50 µL, 150 – 360 x 103 celler/mL i medium, ~ 16 – 40 celler per MC) ovanpå HMCA och låta cellerna sedimentera självtryck i 15 min.
- Försiktigt lägga 6 – 8 portioner 500 µL färskt medium (totalt 3-4 mL) till kanten av makro-väl plast botten utanför ringen och hydrogel matrisen.
- Inkubera HeLa cells för 72 h och MCF7 celler under 48 timmar vid 37 ° C och 5% CO2, i en fuktig atmosfär för bildandet av spheroids.
3. lönsamheten detektion av Propidium jodid (PI) färgning
- Förbereda en stamlösning av PI (PI 500 µg per 1 mL PBS). Förvara den i 4 ° C i ca 6 månader. Nymalen förbereda en utspädning av 1:2,000 (0,25 µg/mL), genom tillsats av 6 µL av lager till 12 mL komplett medium utan fenolrött, för 6-väl HMCA plattan (2 mL per brunn).
- Överföra HMCA plattan med 48-72 h spheroids, från inkubatorn till biologiska huven. Ta bort alla medium från HMCA genom lutar spetsen slutet på kanten av makro-väl plast botten bredvid matrisen hydrogel, lämnar array tanken fylld med medium.
- Varsamt Tillsätt 2 mL av PI utspädning från steg 3.1 i varje brunn, av lutar spetsen slutet på kanten av makro-väl plast botten. Inkubera HMCA plattan för 1 h vid 37 ° C och 5% CO2, i en fuktig atmosfär. Fortsätt till steg 7.
Obs: Andra färgämnen skulle kunna användas här också, till exempel, Hoechst för nucleus färgning, tetrametylrodamin metylester (TMRM) för mitokondriella membranet potential färgning, fluorescein diacetat (FDA) för levande celler detektering, Annexin V för apoptos upptäckt och andra.
4. kollagen blandningsförberedelsen
- Förbereda sterila dubbel destillerat vatten (DDW) av autoklav och ett lager av 100 mL 1 M NaOH filter-steriliseras lösning. Underhålla material på RT och de tips som används för kollagen blandningsförberedelsen fryst vid-20 ° C fram till användning.
- 10 – 20 min före användning, placera alla intergrades inklusive: sterila DDW, 1 M NaOH steril lösning, steril 10 x PBS, typ I-kollagen från rat tail (lagras vid 4 ° C för 3-månader) och ett sterilt rör i is hink tills helt svalnat. Placera is hink inuti biologiska huven.
- Förbereda 1.800 µL av kollagen blandning med en slutlig koncentration på 3 mg/mL, för 6-väl HMCA invasion assay plattan (300 µL per brunn) enligt följande. Lägg till intergrades i kylda röret i följande ordning: 515 µL av DDW, 24,8 µL av 1 M NaOH och 180 µL 10 x PBS. Blanda väl av vortex och placera tillbaka till isen. Slutligen tillsätt 1080 µL av kollagen till blandningen, vortex igen och sätta tillbaka på isen.
5. HA och kollagen blandningsförberedelsen
- Lös 10 mg i 2 mL steril DDW HA. Inkubera blandningen på RT i några minuter och skaka försiktigt tills pulvret är helt upplöst. Lagra stamlösning vid 4 ° C i upp till två år.
- Precis innan användning, placera HA stamlösning i is hink inuti biologiska huven.
- Förbered en 3 mg/mL kollagen blandningen enligt beskrivningen i Steg4. Tillsätt 36 µg (7,2 µL) HA i 1 800 μL av klar att använda kollagen blandning, för en slutlig koncentration på 20 µg/mL. Då, vortex igen kort och sätta tillbaka till isen.
6. ECM blandning tillägg
- Överföra HMCA plattan, med 48-72 h spheroids, från inkubatorn i biologiska huven och placera den på isen. Inkubera i 10 min tills plåten kyls. Förvärm en lösning av 1% LMA till 37 ° C i ett vattenbad.
- Ta bort alla medium från runt HMCA, genom lutar spetsen slutet på kanten av makro-väl plast botten bredvid matrisen hydrogel. Sedan mycket noga, ta bort alla medium från array tanken med en fin spets/gel lastning spets, av lutar spetsen slutet på array kanten, försiktigt och långsamt sugande alla medellång ut.
Obs: Ta alla medium från runt arrayen hydrogel, array tanken är fortfarande fylld med medium. Detta medium måste tas bort mycket försiktigt för att undvika förstörelse av hydrogel MC och luxerad spheroids. - Ta 150 µL av kollagen blandning eller HA och kollagen blandningen (ECM blandning) med den pre frysta fina spetsen och lägga till i matrisen tanken genom att fästa spetsen till array kanten. Släppa blandningen långsamt för att undvika sfäroid dislokation. Upprepa detta steg med en annan alikvot av 150 µL, för en total 300 µL per brunn. Följ samma procedur för varje brunn tills alla brunnar är fyllda. Sedan placera plattan i inkubatorn för 1 h för den fullständiga gelation av ECM.
- Efter den fullständiga gelation ECM har uppnåtts, Pipettera 400 µL av pre värmde 1% LMA ovanpå ECM gelen. Täck tallriken med lock, inkubera plattan på RT för 5 – 7 min och sedan 2 min vid 4 ° C, för agaros gelation. Slutligen varsamt Tillsätt 2 mL av komplett medium av lutar spetsen slutet på kanten av makro-väl plast botten.
Obs: Agaros skiktet förhindrar avskildheten av kollagen-gelmatrisen från HMCA.
7. invasion Assay förvärv och analys
- Belastning på HMCA plattan på en motoriserad inverterade Mikroskop scenen utrustad med en inkubator, förjusterade till 37 ° C, 5% CO2 och fuktad atmosfär.
- Förhand fastställa positionerna för bild förvärvandet i varje samt för att täcka området hela utbud, och med 10 X eller 4 X mål (det här steget krävs för förvärv bildbehandlingsprogram används här, se Material tabell nedan för detaljer). Alternativt använda någon bild förvärv programvara för att underlätta Automatisk genomsökning av hela krävs området, genom att välja de ”Stich” alternativet.
- Förvärva ljusa fält (BF) bilder varje 2 – 4 h under totalt 24-72 h för att följa invasionen av celler från sfäroid kroppen i omgivande ECM.
- Förvärva fluorescerande bilder för PI upptäckt genom att använda en dedikerad fluorescerande kub (excitation filter 530 – 550 nm, dichroic spegel 565 nm långa pass och utsläpp filter 600 – 660 nm).
- Exportera time-lapse BF/fluorescerande bilder från förvärvet bildbehandlingsprogram och spara dem i format tagged image file format (TIFF) till en dedikerad mapp med hjälp av ”databas” fliken i verktygsfältet och sedan på ”Exportera inspelade filer” -knappen.
Obs: Vi utvecklat en speciell intern analys kod i MATLAB-programvaran som innehåller ett designat grafiskt användargränssnitt (GUI) i vilken invasion analys kunde köras snabbare och enklare. I denna analys kod sker segmentering av området spheroids och invasion halvautomatiskt med Sobel filter följt av morfologiska operatörer Erosion och dilatation. Efter automatisk segmentering av områden, har manuella korrigeringar utförts där det behövs för bättre noggrannhet. Efter segmentering, en uppsättning parametrar var beräknas av programvaran och automatiskt exporteras till en excel-fil för ytterligare manipulation. Listan över parametrar är: grundläggande sfäroid genomskärningsarea som helst = 0, invasion område med celler som ansluten till sfäroid kroppen = huvudsakliga invasion område, område av celler separeras från huvudsakliga invasion område, antalet celler separeras från huvudsakliga invasion område, Genomsnittligt avstånd av invasion från grundläggande sfäroid centrum av massan till omkrets av huvudsakliga invasion området och separerade celler och kollektiva invasion avstånd parameter = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) av den X och Y sfäroid masscentrum koordinater, innan (X1, Y1) och efter (X2, Y2) kollektiva invasion process). Bildanalys kan alternativt göras med annan specialiserad programvara. - Öppna GUI och tryck knappen ”Load BF” . När bilden är öppen, justera parametrarna segmentering (minsta storlek: > 1 och radie nära: > 1) för att uppnå en exakt segmentering på sfäroid och dess invasion, tryck sedan på ”Region av intresse (ROI) segmentering” knappen för utförande och en kantlinje visas runt varje sfäroid. Om den automatiska segmenteringen är felaktiga, tryck på knappen ”Radera” eller ”Lägg till” och göra önskade ändringar manuellt. Upprepa samma steg för efterföljande bilder.
- Tryck på knappen ”spåra” att numrera spheroids och programvaran kommer att tilldela samma nummer för varje sfäroid i varje tid förflutit bilderna. Tryck sedan på knappen ”mätning” , som kommer att generera ett kalkylblad med alla parametrar. Spara kalkylbladet som ett excel-fil för vidare användning i resultat bearbetning och statistik i excel programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den unika HMCA imaging plate används för invasionen analysen av 3D tumör spheroids. Hela analysen, börjar med sfäroid bildandet och slutar med den invasion processen och ytterligare manipulationer, utförs inom samma platta. För sfäroid bildandet, HeLa cells läses in matris bassängen och bosätta sig i hydrogel MCs självtryck. Hydrogel MCs, som har icke-anhängare/låg bifogade egenskaper, underlätta cell cell interaktionen och bildandet av 3D tumör spheroids. Figur 2A visar cellerna bosatte sig i MCs, efter användning av 150 x 103 celler/mL buffertlösning (dvs., ~ 16 celler per MC beräknat värde). Det är klart att beläggningen i celler per MC inte är jämnt fördelad genom matrisen, och den genomsnittliga erhållna statistiska fördelningen är 14.78 ± 3,60 celler per MC. Tabellen i figur 2B sammanfattar cell fördelningen per MC för hela HMCA plattan. Den genomsnittliga variationskoefficienten (CV) av cellen fördelningen inom en makro-väl är 43.33%, medan mellan makro-brunnarna är 24.37%. Skillnader i cell beläggning är avgörande och direkt diktera storlek spheroids bildas och sin homogenitet i hela plattan. För att minska/minimera variabiliteten skapad av antalet celler per MC, utförs analysen av resultaten på enda element upplösning. Tomterna i figur 2 c-D illustrera storlek (genomskärningsarea) fördelningen av 3-dagars spheroids. Det är tydligt exemplifieras i figur 2D att beräkna förhållandet tillväxt varje sfäroid (genomskärningsarea till dag 3 och dag 2) har en mer homogen fördelning än absoluta storleksfördelning (figur 2 c), vilket ger ett CV 15.48% och 52,80%, respektive. Sfäroid diameter distribution av 3-dagars spheroids ger ett CV 24.52% och förhållandet tillväxt (diameter på day3/dag2) är 7,45%. Dessa CV-värden är liknande till17 eller högre än18 andra rapporterar uppnå cell lastning av gravitationen. För att eliminera den uppmätta parameter variansen följd av variabiliteten i de första seedade mobilnummer per MC, är det att föredra att normalisera de valda parametrarna till den första cell nummer eller till andra uppmätta parametrar av samma objekt, sådana att varje sfäroid har sin interna kontroll. Detta synsätt skulle kunna tillämpas enkelt genom att spåra objektet på HMCA bildbehandling plattan.
Sfäroid bildande och tillväxt kunde följas enkelt på den HMCA imaging plate. Figur 3A-B visar en BF bild av en region på HMCA imaging plate som innehåller 24 h HeLa cellen aggregat och respektive bilden av mogen, 5–dag 3D flercelliga anmärker, som blir allt mer sfäriska och tätare. Det är tydligt att de flesta objekt behåller sin plats under inkubationsperioden 5-dagars. Analysen av form (sfärisk) och storlek (genomskärningsarea) under sfäroid bildandet presenteras i figur 3 c. Spridningsdiagrammet demonstrerar ökningarna i båda parametrarna från dag 1 till dag 5. 0.544 ±0.020 a.u. 0.684± 0,016 a.u. för sfärisk (p < 0,05) och 0.00356± 0.00013 mm2 till 0.00538 ± 0.00015 mm2 för genomskärningsarea (p < 0,05), respektive. Medan 24-h aggregat är små och har icke regelbunden form, de respektiva 5-dagars spheroids är större och förvärva sfärisk form.
Påvisande av sfäroid cellviabilitet körs med låg koncentration PI för färgning19 som kringgår behovet av färgämne tvätt. PI tränger igenom cellmembranen och sedan intercalates i DNA hos icke-viabla celler. Figur 4A visar 5-dagars HeLa spheroids färgas med PI (i rött). Analys av andelen röda området (som representerar döda celler) av varje sfäroid genomskärningsarea sammanfattas i figur 4B. Histogrammet visar att 85% av sfäroid befolkning har ett maximal värde av 5% röd färgade område och genomsnittet är 3,01 ± 2,34% (vänster histogram). Genomskärningsarea av spheroids (rätt histogram) visar en normalfördelning med medelvärdet av 0.02447 ± 0.00487 mm2.
Efter att producera 3-dagars mogen HeLa spheroids, utförs invasion analysen inom den HMCA imaging plate. Effekten av variabler såsom ECM sammansättning, hämmare och aktivatorer, på 3D tumör sfäroid invasion processen kunde undersökas. För invasionen assay prestanda, medlet försiktigt avlägsnas och ersättas med ECM lösningen pipett över spheroids i MC array bassängen. Efter den fullständiga gelation av ECM lösningen läggs komplett medium i makro-brunnen. (1) i syfte att undersöka påverkan av HA på HeLa sfäroid spontana invasion processen, spheroids var täckt med kollagen och HA blandningen lösning (figur 5A) och jämfört med de täckt med kollagen enda lösningen (figur 5 c), och BF bilder förvärvades direkt efter ECM gelation (t = 0 h). Den kinetiska invasion processen följdes av imaging samma regioner varje 5 h för en period av 63 h. Efter 50 timmars inkubation, spheroids inbäddade i kollagen och HA (figur 5B) visade lägre cell spridning till omgivande ECM jämfört med de spheroids inbäddade i kollagen endast (figur 5 d). Analys av området invasion kinetiska över tiden, för 99 spheroids på singel-sfäroid resolution sammanfattas i figur 5E. Figur 5E tomter området menar/Genomsnittligt invasion över tid av de två grupperna, och visar tydligt att tillägg av HA till kollagen hämmar cell spridning av sfäroid, vilket resulterar i mindre invasion områden. Genomsnittet av backarna följd linjär regression justeringen kurvor för var och en av de spheroids inbäddade i kollagen (0.001973 ± 0.000894 mm2/h) jämfört med kollagen och HA lösning (0.001410 ± 0.000941 mm2/h) är betydligt olika (p = 0,003, t-test: två sampel antar lika varians). (2) för att undersöka påverkan av Fisetin (en bioaktiva flavonoid finns i flera frukter och grönsaker som visar cytostatika och migrastatic verksamhet genom att agera på flera molekylära mål inklusive fosfatidylinositol 3-Kinas (PI3K) / Akt/c-Jun N-Terminal kinaser (JNK) signalering och Wnt/β-catenin signalering downregulates matrix metalloproteinaser (MMP) och andra20) på HeLa sfäroid spontana invasion process, ökande koncentrationer av läkemedlet har lagts till komplett medium och BF bilder förvärvades vid t = 0 (figur 6A) och 24 h senare (figur 6B-C). Som visat, hämmar 10 µM av Fisetin (figur 6 c) spridning av celler runt spheroids jämfört med icke-behandlade HeLa spheroids (figur 6B). Invasion område analysen av en dos svar experiment (figur 6 d) uppvisar betydande hämning på 10-40 µM av Fisetin (p < 0,003), att uppnå mättnad vid koncentration av 10 µM och högre. (3) det har visat att nej, på nano-molar nivå bidrar till en mer aggressiv bröstcancer cancer fenotyp av stimulerande tumör expansion och migration16. För att undersöka påverkan av nr på kollektiva invasion av MCF7 spheroids inbäddade i kollagen, 1 µM av Dietylentriamin/kväveoxid givare (DETA/NO) lades till komplett odlingsmedium och BF bilder förvärvades vid t = 0 och t = 20 h. dramatiska förändringar i morfologi och platser av 3D spheroids under exponering för ingen givare är uppenbara (figur 7A-B). Spheroids förlorar sin sfärisk och bli mer långsträckt förvärva amoeboid flyttande fenotyp. Samtidigt, observerades förstärkt flyttning av spheroids inom den omgivande kollagenmatrisen (figur 7 c). Det genomsnittliga töjning värde ökade signifikant från 1.305 ± 0.193 a.u. 1.477 ± 0.298 a.u., (p < 0,0006). Det genomsnittliga migration avståndet för de samma spheroids utvidgades betydligt, 0.0788 ± 0.0575 mm och 0.3164 ± 0.3365 mm i frånvaro och närvaro av DETA/Nej, respektive (p < 4 x 10-6).
Bildanalys av sfäroid invasionen uppnåddes genom halvautomatiska in-house MATLAB-programvaran. Förvärvade tid förflutit bilder av sfäroid bildandet och invasion inom HMCA består av talrika spheroids i en bild (4-6 spheroids vid 10 X förstoring och 25-30 spheroids på 4 X förstoring). Analysen av sfäroid bildandet, tillväxt och invasion utfördes samtidigt på alla spheroids i bilden. De centrala parametrar extraheras för sfäroid invasion presenteras i figur 8A, som visar en representativ bild segmentering av 4 spheroids vid en enda tidpunkt (t = 16 h). Det huvudsakliga invasion område som definieras av en röd kant, liksom de separerade celler som frikopplad och spridda runt det (indikeras av svarta pilar), var spåras och numrerade för varje sfäroid över tid. Sfäroid storlek före invasionen vid t = 0 definieras av en blå kantlinje. Medelvärdet/Genomsnittligt invasion avståndet från sfäroid masscentrum till invasionen området omkrets inklusive separerade celler beräknas från den inringade röda segmenteringen och anges med gula pilar. Data som extraheras från detta time-lapse experiment sammanfattas i figur 8B-D. Figur 8B uppvisar genomsnittlig invasion avståndet från varje sfäroid center höjd över tid. Figur 8 c uppvisar området totala invasion i varje av spheroids höjd över tid (inklusive huvudsakliga invasion området och separerade/frikopplad-cell område). Figur 8 d 1-4 visar omfattningen av separerade-cell område jämfört med området totala invasion av varje sfäroid (över tid). Det sammanlagda antalet urkopplad celler är 33, 7, 4 och 5 för spheroids #1, #2, #3 och #4, respektive. Analysen av kumulativa antalet urkopplad celler över 20 h invasion från 126 HeLa spheroids inbäddade i kollagen visas i figur 8E. Det framgår här att det finns en stor spridning i antalet urkopplad celler i den undersökta populationen och det genomsnittliga värdet är 12,3 ± 12,8 celler.
Figur 1: The HMCA imaging plate. (A) bild av en makro-väl präglade med HMCA. (B) ett tvärsnitt av en MC inom den HMCA imaging plate. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: homogenitet av förhållandet om cellen distribution och sfäroid tillväxt i den HMCA imaging plate. (A) en överlagring av BF och fluorescerande bilder av den HMCA laddad med HeLa cells pre färgas med Hoechst 33342 1 µg/mL (lastning koncentration 150 x 103 celler per mL). Bilder har förvärvats direkt efter cell bosättningen i den MC. bild förstoringen 4 X, skalstapeln = 500 µm. (B) tabellen sammanfattas fördelningen av HeLa celler inom HMCA-6-bra bildbehandling plattan. Cellerna räknades från upp till 90 MC/makro-brunn. Resultaten presenteras som menar ± standardavvikelsen (SD), CV (SD/mean100) beräknas inom och mellan makro-brunnarna. (C) Distribution histogram över sektions verksamhetsområde 3 dag spheroids, n = 418, bestäms från BF bilder. (D) Distribution histogram av förhållandet sfäroid tillväxt (genomskärningsarea till dag 3 och dag 2). Baserat på tillväxt beräknas enda element upplösningen för varje av de 418 spheroids. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: spårning sfäroid formation i den HMCA imaging plate. BF bild av HeLa cells (lastning koncentration 120 x 103 celler per mL) inkuberas i HMCA för 1 dag (A) och 5 dagar (B). Bild förstoring 4 X, skalstapeln = 500 μm. (C) Scatter plot 3D objekt sfärisk som en funktion av dess genomskärningsarea, efter 1 dag (blå diamanter) och 5 dagar (bruna rutor) inkubation post cell lastningen. Varje markör representerar de analyserade data från en enda sfäroid, n = 83. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Påvisande av cellernas viabilitet i mogen spheroids. En överlagring av BF och fluorescerande avbildningar av 5 dag spheroids (lastning koncentration 360 x 103 celler per mL) färgas med PI 0,25 µg/mL (A). Bild förstoring 4 X, skalstapeln = 500 µm. (B) Distribution histogram av procent av PI området i förhållande till området sectional sfäroid (till vänster) och distribution histogram över genomskärningsarea (höger panel), n = 84. Procent av PI område beräknas på enda element upplösning för vart och ett av de 84 spheroids. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: påverkan av ECM sammansättning på sfäroid invasion processen. BF bilder av 3 dag HeLa spheroids inbäddade i en blandning av 3 mg/mL kollagen och 20 µg/mL HA (A) och 3 mg/mL kollagen (C), vid t = 0 h och efter 50 h inkubation (B) och (D), respektive. Bild förstoring 10 X, skalstapeln = 200 µm. Den HMCA imaging plate lästes på scenen av inverterade Mikroskop utrustat med inkubator. Bilder förvärvades varje 5 h och kinetiska analysen presenteras i tomt (E), n = 99. Varje kurva representerar det medelvärde ± SD för invasionen området öka med tiden, för kollagen och HA (blå diamanter) och kollagen endast (bruna rutor). Genomsnittliga linjära regressionskurvan och dess ekvation och R-kvadratvärdet indikeras ovanför kurvorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Fisetin hämmar spontan invasion av HeLa spheroids. BF bilder av 3 dag HeLa spheroids, inbäddad i en blandning av 3 mg/mL kollagen (A) vid t = 0 och sedan, 24 h efter tillsats av 0 µM (B) och 10 µM Fisetin (C) till komplett odlingsmediet. Bild förstoring 4 X, skalstapeln = 500 µm. analys av invasion område för varje sfäroid vid slutpunkten (t = 24 h) presenteras i tomt D, n = 488. Kurvan representerar medelvärde ± SD av invasion område som en funktion av 0-40 µM Fisetin. Fisetin behandling signifikant hämmar invasionen på 10 µM (P = 4,65 x 10-6), 20 µM (P = 0.0021) och 40 µM (P = 4,86 x 10-8), använder t-test: två sampel antar lika varians. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: nr inducerar kollektiva invasion i MCF-7 breast cancer spheroids. BF bilder av 2 dagars MCF-7 breast cancer spheroids, inbäddade i kollagen (A) på (t = 0) och (B) efter 20 h exponering för 1 µM DETA/nej. Sfäroid ROI segmentering definieras av röd kant, överlagras och numrerade i rött på BF bilder A och B. ROIs definieras av blå gränsen, överlagras på BF bild B representerar sfäroid storlek och placering vid t = 0. 4 X förstoring, skalstapeln = 500 µm. (C) A spridningsdiagram sambandet mellan töjning faktor och migration avstånd av enskilda breast cancer spheroids vid exponering för 1 µM DETA/ingen (bruna rutor) som jämfört med kontroll (blå diamanter) vid t = 20 h, n = 54. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: HeLa cellen spontana invasion bildanalys. BF bilder av 3 dag HeLa spheroids, 16 h efter inbäddning i kollagen (A). Förstoringen 10 X. Sfäroid invasion område och urkopplad celler definieras av röd kant, sfäroid storlek vid t = 0 definieras av blå gränsen, menar invasion avstånd från sfäroid masscentrum indikeras med gula pilar och urkopplad celler markeras med svarta pilar. Rita ökningen över tid av genomsnittlig invasion avståndet från sfäroid masscentrum (B) och totala invasion område (C). Kurvorna representerar sfäroid #1 (blå diamanter), sfäroid #2 (brun rutor), sfäroid #3 (gröna trianglar) och sfäroid #4 (lila Xs). (D) Bar diagram av huvudsakligt (blå) och åtskilda cell (brun) invasion området öka med tiden. (E) Distribution histogram av det kumulativa antalet separerade celler per sfäroid under 20 h av invasion process, n = 126. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är väl dokumenterat att levande organismer, kännetecknas av sin komplexa 3D multicellulär organisation skiljer sig helt från vanliga 2D enskiktslager odlade celler, betonar avgörande behovet av att använda cellular-modeller som bättre efterliknar funktionerna och processer i den levande organismen för drug screening. Nyligen, flercelliga spheroids, organotypic kulturer, organoids och organ-på-ett-chip har varit införda8 för användning av standardiserade läkemedelsutveckling. Dock äventyrar 3D flercelliga modellens stor komplexitet betydligt dess robusthet, parallelization och dataanalys som är avgörande för analysen effektivitet.
Kvantitativ utvärdering av invasion kapacitet åtgärder vanligtvis förflyttning av celler genom hydrogel material. För att mäta tumör invasionen med traditionella mikro-bra plattor, stort antal cancerceller är seedad i runda bottenplåtar och tvingade sammanvägning av centrifugering21,22. Dessa plåtar begränsa cell/sfäroid interaktion i angränsande brunnar, medan den rund bottnen hindrar den optiska kvaliteten och komplicerar bilden förvärv. I andra metoder, enskilda celler slumpmässigt inkapslade i hydrogel, växa och fungera i en 3D miljö men inte nödvändigtvis utvecklas till mogna spheroids23,24. Dessutom krävs komplicerade förfaranden för cell positionering inom hydrogel, liksom magnetisk kraft-baserade cell mallning25 eller två-photon laser irradiation av bioaktiva hydrogels26.
Den HMCA-baserad teknik som presenteras häri visar sig vara fördelaktiga över ovanstående metoder: cell positionering, spontana aggregering och skapandet av spheroids från några spridda celler enkelt kan uppnås, möjliggör användning av värdefull begränsad cellular prov (t.ex., stem-liknande cancerceller eller primära celler som härrör från patientprover). Systemet har kontroll över såväl arten av de celler som komponerar spheroids samt över deras exakta rumsliga position under lång sikt experiment. Dessutom platt botten av MC underlättar generering av talrika spheroids på samma brännvidd plan, därmed snabb belysning och bild förvärv av stora områden via ett brett fält Mikroskop är möjligt, eliminerande nöden för komplicerat tidskrävande konfokalmikroskopi. Systemet är lätt att hantera och dess praktiska som möjligt. Genom att tillämpa enkla operativa rutiner, uppnått vi hög beläggning av sfäroid populationer där ca 50% av spheroids har jämförbar storlek och en tillförlitlig analys av cancer cell invasion kapacitet. Dessutom kan effekten av läkemedel på invasionen kapacitet analyseras samtidigt med deras cytostatika och cytotoxiska effekter genom att använda hög-innehållsanalys metod tillsammans med HMCA enhet odlade med talrika spheroids. Dessutom i HMCA dela alla cellulära element samma utrymme och medium, vilket gör det möjligt att undersöka sfäroid-sfäroid interaktion som medieras vanligen via cell-utsöndras cytokiner, chemokiner, hormoner och ECM27. Detta överhörning underlättar överlevnaden och funktionen av enskilda celler eller liten cell kluster i makro-bra volym.
Ett avgörande steg i genomförandet av protokollet är tillägg av ECM blandningen ovanpå spheroids och validera dess korrekt polymerisation. Spheroids visas inte flyttande beteende även om de är inbäddade i ECM, såvida inte montering och cross-linking uppstå, och lämpliga kollagenfibrer bildas. Kollagenfibrer kan observeras av BF belysning, och vi rekommenderar att kontrollera plattan under ett mikroskop för att bekräfta skapandet av kollagenfibrer i slutet av denna fas. Eftersom antalet spheroids är beroende på initial cell koncentration och procent av ockuperade MCs, matrisen ska kontrolleras efter initial cell lastning och om cellen beläggningen inte är optimal, re sådd i samma matrisen kan utföras. Faktiskt, storlek och geometri av den HMCA som beskrivs häri var utformad för att rymma relativt liten cell kluster (upp till 150 µm i diameter). Detta kunde betraktas som en begränsning eftersom designa en ny typ av array kommer att vara nödvändigt för att analysera cellmigration från större cellstrukturer.
Den aktuella plattformen använder minimal cell nummer och små reagens volym, medan på samma gång ge en stor provstorlek (tusentals spheroids per platta). För att kunna analysera 12 olika föreningar för anti metastaserande aktivitet, skulle 2 enda 6-väl HMCA baserat plattor krävas, ger resultaten från omkring 5.000 spheroids, medan minst femtio 96 brunnar behövs för att uppnå samma resultat. Förmågan att analysera migreringen med enskilda-objekt upplösning i HMCA ger en hög statistisk robusthet och noggrannhet, möjliggör studiet av strukturella och funktionella invasion heterogenitet i talrika spheroids.
Denna studie visar unikt kollektiva invasionen av bröst cancer sfäroid populationer vid exponering för DETA/nr Cell kluster av MCF7 celler visar amoeboid flyttande fenotyp, och kvantitativa förändringar i morfologi och läge varje sfäroid kan uppnås automatiskt. Till bäst av vår kunskap är detta den första klädd system som underlättar uppföljning och analys av kollektiva invasion i många 3D-strukturer. Genom att analysera de relativa riktningarna och invasion avståndet för varje sfäroid, är det möjligt att studera det ömsesidiga samspelet mellan spheroids inom befolkningen. Dessutom illustreras av extracellulära mikromiljö faktorer etablerade påverkar cancer cell beteende28 här. Bland dessa faktorer har av stelhet och sammansättning av närmiljön visat att starkt påverka cellmigration. HMCA teknik ger en definierad, biomimetiska, in vitro- plattform, där dessa egenskaper av ECM kan lätt nås och kontrolleras. Styvheten i ren kollagen typ I hydrogel på koncentrationen av 3 mg/mL som användes i denna studie rapporteras vara cirka 50-600 Pa29,30,31 och tillsats av HA (20 µg/mL; 0.4 wt %) inte ändrar styvheten i hydrogel betydligt32,33. Således den suppressiva effekten av medelhög molekylvikt (MMW)-HA på invasionen av 3D HeLa spheroids som visades här är inte på grund av stelhet förändringar. Dessa resultat är överens med tidigare studier som visade en bimodal effekt av HA på cancer cell invasion med hög beroende på HA molekylvikt34,35,36,37.
Framtida tillämpningar av metoder inkluderar sida vid sida multi cell typ odling av tumör och stromaceller i olika regioner inom makro-brunnen och hämtning av specifika spheroids för nedströms molekylär analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bequest Moshe Shimon och Judith Weisbrodt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80 °C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37 °C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37 °C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37 °C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1 M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5 mg/mL | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37 °C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
