إدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد لديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) وتطبيقه على تصريف البروتين
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد ل ديهيدروكسيفينيلالانيني من المواد البداية بسيطة وتطبيقه على تصريف البروتين.
Abstract
لام-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) هو من الأحماض الأمينية الموجودة في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. بسبب خصائصه البيوكيميائية خاصة، قد الحمض الأميني متعددة الاستخدامات في التطبيقات البيوكيميائية. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد دوبا وتطبيقه على تصريف البروتين. دوبا بيوسينثيسيزيد تيروزين فينول-لياز (لافوري) من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا، ومباشرة أدمجت الأحماض الأمينية في البروتينات بواسطة الأسلوب إدراج الوراثية استخدام الحمض الريبي النووي النقال-أمينواسيل تطورت وزوج أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز. ويتضمن النظام الإدماج المباشر هذا كفاءة دوبا مع إدخال القليل من الأحماض الأمينية الطبيعية الأخرى ومع المحصول البروتين أفضل من النظام السابق لإدراج الوراثية دوبا. تصريف البروتين مع البروتينات المحتوية على دوبا هو الكفاءة والمعينة للموقع وتظهر فائدته لمختلف التطبيقات. يوفر هذا البروتوكول العلماء البروتين مع إجراءات مفصلة للتركيب الحيوي كفاءة متحولة البروتينات التي تحتوي على دوبا في المواقع المطلوبة وعلى التصريف للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.
Introduction
دوبا هو من الأحماض الأمينية المتورطين في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. هذه الأحماض الأمينية يتم تصنيعه من صور hydroxylase التيروزين والأوكسجين الجزيئي (س2)1. لأن دوبا سليفة الدوبامين، ويمكن أن تتخلل حاجز الدم في الدماغ، فقد استخدمت في علاج مرض باركنسون2. كما تم العثور على دوبا في بلح البحر التصاق البروتينات (خرائط)، التي المسؤولة عن خصائص لاصقة من بلح البحر في ظروف رطبة3،،من45،،من67. في البداية يتم ترميز طير في المواقف حيث وجدت في الخرائط دوبا ويتم تحويلها بعد ذلك إلى دوبا تيروسيناسيس8،9. بسبب خصائصه البيوكيميائية مثيرة للاهتمام، وقد استخدمت دوبا في مجموعة متنوعة من التطبيقات. مجموعة ديهيدروكسيل دوبا كيميائيا عرضه للأكسدة، والأحماض الأمينية يتم تحويلها بسهولة إلى L-دوباكوينوني، مقدمة ميلانينس. نظراً لأن اليكتروفيليسيتي عالية، قد استخدمت لدوباكوينوني ومشتقاته crosslinking والاقتران مع ثيولس والامينات10،11،،من1213. 1، 2-كوينونس يمكن أن تعمل أيضا ديين لردود فعل سيكلواديشن واستخدمت بيوكونجوجيشن التي تروج لها سلالة تسيطر على أكسدة سيكلوكتيني-1، 2-كينون (سبوكق) سيكلواديشن14. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة ديهيدروكسيل يمكن يخلب الأيونات المعدنية مثل الحديد3 + و Cu2 +، والبروتينات التي تحتوي على دوبا وقد استخدمت لإيصال الأدوية، وأيون معدني الاستشعار عن15،16.
تم دمج البروتينات باستخدام متعامد أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال (أإ-الحمض الريبي النووي النقال) وأمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز (aaRS) زوج17 دوبا وراثيا واستخدامه للبروتين التصريف و crosslinking10،11، 12،13. ويرد في هذا التقرير، النتائج التجريبية والبروتوكولات لإدراج بيوسينثيسيزيد دوبا من مواد انطلاق رخيصة وتطبيقاتها في بيوكونجوجيشن الوراثية. دوبا بيوسينثيسيزيد استخدام لافوري، وبدءا من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا في الإشريكيّة القولونية. بيوسينثيسيزيد دوبا تدمج مباشرة البروتينات بالإعراب عن زوج aa-الحمض الريبي النووي النقال و aaRS تطورت على دوبا. وبالإضافة إلى ذلك، بيوسينثيسيزيد البروتين الذي يحتوي على دوبا هو سيتيسبيسيفيكالي مترافق مع المسبار الفلورسنت وكروسلينكيد لإنتاج البروتين ليغومرات. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة للعلماء البروتين، لبروتينات متحولة biosynthesize المحتوية على دوبا ومترافق البروتينات مع تحقيقات البيوكيميائية أو المخدرات للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد في هذا البروتوكول، الحيوي والإدماج المباشر من دوبا. الخلية البكتيرية المستخدمة في هذا الأسلوب يمكن توليف حمض أميني إضافية واستخدامها بوصفها لبنة غير طبيعي تخليق البروتين. تم إدراج الوراثية للأحماض الأمينية غير طبيعي تكنولوجيا رئيسية لتطوير الكائنات الحية غير طبيعي مع رمز الوراثية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان يدعمها “برنامج بحوث الحدود العالمية” (جبهة الخلاص الوطني-2015M3A6A8065833)، و “علوم البحث البرنامج الأساسي” (2018R1A6A1A03024940) عن طريق الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها حكومة كوريا.
Materials
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
- Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
- Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
- Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
- Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
- Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
- Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
- Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
- Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
- Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
- Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
- Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
- Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
- Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
- Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
- Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
- Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
- Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
- Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
- Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
- Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
- Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
- Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).
