Summary
Здесь мы представляем протокол для генетических включение L-Диоксифенилаланин biosynthesized от простых исходных материалов и его применение к белка спряжение.
Abstract
L-Диоксифенилаланин (ДОПЫ) это аминокислота, в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Из-за его особую биохимические свойства аминокислота имеет несколько использует в биохимических приложений. Этот доклад описывает протокол для генетических включение biosynthesized ДОПЫ и его применение к белка спряжение. ДОПЫ biosynthesized, тирозин фенол лиазы (TPL) от катехол, пируват и аммиака, аминокислота является непосредственно включена и белков методом генетической включения с использованием и развивались аминоацил тРНК аминоацил тРНК синтетазы пара. Это прямое включение системы эффективно включает ДОПЫ с маленькой включение других природных аминокислот и лучше белок доходность, чем предыдущие системы генетических включения для ДОПЫ. Белка конъюгации с ДОПЫ содержащих белков является эффективным и конкретным участкам и показывает свою полезность для различных приложений. Этот протокол обеспечивает белка ученых с подробные процедуры для осуществления эффективного биосинтеза мутантных белков, содержащих ДОПЫ на желаемых сайты и их сопряжения для промышленности и фармацевтической.
Introduction
ДОПЫ это аминокислота участвует в биосинтезе катехоламинов в животных и растений. Эта аминокислота от Tyr синтезируется гидроксилазы тирозин и молекулярного кислорода (O2)1. Потому что ДОПЫ прекурсор допамина и может проникать blood - brain барьер, он был использован в лечении болезни Паркинсона-2. ДОПЫ встречается также в мидий адгезии белков (карты), которые отвечают за адгезионные свойства мидии в влажных условиях3,4,5,6,7. Tyr сначала кодируется в позициях, где ДОПЫ находится в карты и затем преобразуется в ДОПЫ tyrosinases8,9. Из-за его интересные биохимические свойства ДОПЫ был использован в различных приложениях. Dihydroxyl группы ДОПЫ химически подвержен окислению, и аминокислоты легко превращается в L-допаквинон, предшественник Меланины. Благодаря своей высокой electrophilicity L-допаквинон и его производные, были использованы для сшивки и конъюгации с тиолами и амины10,11,12,13. 1,2-хиноны также может функционировать как диеновых для реакции циклоприсоединения и были использованы для bioconjugation штамм способствует окислению контролируется cyclooctyne-1,2-хиноны (SPOCQ) циклоприсоединения14. Кроме того группа dihydroxyl может хелатной ионов металлов Fe3 + и Cu2 +, и белки, содержащие ДОПЫ были использованы для доставки лекарств и Ион металла, зондирования15,16.
ДОПЫ генетически включены в белки с использованием ортогональных аминоацил тРНК (aa тРНК) и аминоацил тРНК синтетазы (Орсе) пары17 и используется для белка спряжение и сшивки10,11, 12,13. В настоящем докладе описаны результаты экспериментов и протоколы для генетических включение ДОПЫ biosynthesized от дешевых исходных материалов и ее применения для bioconjugation. ДОПЫ-biosynthesized с помощью ТПЛ и начиная от катехол, пируват и аммиака в Escherichia coli. Biosynthesized ДОПЫ непосредственно включены в белки, выразив развивались пару aa тРНК и Орсе для ДОПЫ. Кроме того белок biosynthesized, содержащие ДОПЫ site-specifically конъюгированных с флуоресцентного зонда и высокоструктурированные производить белок олигомеров. Этот протокол будет полезным для белка ученых, biosynthesize мутантных белков, содержащих ДОПЫ и конъюгат белки с биохимическими зондов или препаратов для фармацевтической и промышленных приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. плазмида строительство
- Построить выражение плазмида (pBAD двойной ТПЛ-GFP-WT), который выражает ТПЛ ген от Citrobacter freundii под контролем промотора учредительных и Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) гена с его6-тег под контролем araBAD промоутер. Для pBAD двойной ТПЛ-GFP-E90TAG замените ДОПЫ с Янтарный кодон (TAG), используя протокол сайт Направленный мутагенез кодоном для сайта (E90). Детали для строительства этой плазмида была описана в наш предыдущий доклад18.
- Постройте tRNA/Орсе выражая плазмида (pEVOL-DHPRS2)18,19 для генетических включения ДОПЫ. pEVOL — это вектор специальной плазмиды, выражая две копии Орсе генов с независимыми промоутеров, и подробную информацию о плазмида описан в предыдущем докладе19.
- Использование коммерчески доступных плазмида подготовки комплектов для получения высокой чистоты плазмида ДНК. Проверьте чистоту prepped ННО с помощью геля агарозы, при необходимости.
2. Культура подготовка
-
Электропорация
- Использование электро компетентных E. coli DH10β штамма для этого эксперимента. 1 мкл каждого плазмидной ДНК (pEVOL-DHPRS2 и pBAD двойной ТПЛ-GFP-E90TAG), до 20 мкл компетентных клеток. Смешайте их осторожно, чтобы сделать однородной смеси, с помощью пипетки.
- Передача смеси электропорации кюветы. Поместите кювету в зале электропорации. Нажмите кювета в камеру чтобы фирмы кювет палата контакт.
- Шок, кювет, используя 25 МКФ и 2,5 кв для кюветок 0.1-см.
- Добавьте 1 mL подогретую супер оптимального бульона (SOC), содержащие Триптон 2% (w/v), 0,5% (w/v) дрожжевой экстракт, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl2и 20 мм глюкозы, кювет и передать трубку культуры клетки. Спасти клетки путем инкубации их за 1 ч при 37 ° C при встряхивании.
- Распространение 10-100 мкл спасли клеток на табличке агар lysogeny бульон (LB), содержащие хлорамфеникол 35 мкг/мл и 100 мкг/мл ампициллин. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 16 h.
-
Стартовые культуры подготовка
- Прививать колонии одного превращается в 5 мл LB среды, содержащие антибиотики. Инкубируйте в колонию на 12 ч при 37 ° C при встряхивании.
3. выражение и очистки GFP-E90DOPA биосинтетических системой
-
Выражение гена GFP-E90DOPA биосинтетических системой
- Перевести 100 мл ПА-5052 средний20 (50 мм Na2HPO4, 50 мм х2PO4, 25 мм [NH4]2,4, 2 мм MgSO4, 0.1% [w/v] проследить металлов, 0,5% [w/v] глицерина, закваски (2 мл) 0,05% [w/v] глюкозы и аминокислоты 5% [w/v] [рН 7,25]) содержит 35 мкг/мл хлорамфеникол, 100 мкг/мл ампициллин, пируват 100 мм, 10 мм катехол, аммиак 25 мм и 300 мкм Дитиотреитол (DTT) следуют инкубации при 30 ° C с встряхивания.
- Добавить 2 мл 0,2% (w/v) L-арабинозы когда оптической плотности (OD) на 550 Нм достигает 0,8. Инкубируйте образца для 12 ч при 30 ° C с встряхивания.
- Спин вниз клетки на 11000 x g 5 минут, удалить супернатант и заморозить клетки Пелле-80 ° c.
-
Лизис клеток
- Оттепель Пелле клеток на льду и Ресуспензируйте клетки в 10 мл буфера lysis, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 10 мм и 300 мм NaCl.
- Sonicate ресуспензированы клеток на льду на 10 мин амплитуда sonication 80% использования с пульсом 25 s на и 35 s выкл.
- Спин вниз ячейки lysate на 18,000 x g при 4 ° C на 15 мин супернатант передать свежие трубка для очищения и отбросить гранулы.
-
Хромотография сродства Ni-НТА
- Добавить Ni-НТА (Нитрилотриуксусная кислота) смолы (300 мкл смолы подвески для культуры 100 мл) в надосадке и связать Ni-НТА смолы при температуре 4 ° C белки, осторожно встряхивая подвеска за 1 ч.
- Передача подвеска полипропиленовых столбцов и мыть смола 3 x с 5 мл мыть буфер, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 20 мм и 300 мм NaCl.
- Элюировать белки 3 x с 300 мкл Элюирующий буфер, содержащий 50 мм NaH2PO4 (рН 8,0), имидазола 250 мм и 300 мм NaCl.
- Определить концентрацию протеина путем измерения поглощения в 280 Нм. Коэффициент вымирания (24,630 M-1см-1) для GFP-E90DOPA на 280 Нм был рассчитан путем калькулятор Коэффициент вымирания белков (например, https://web.expasy.org/protparam/) и самостоятельно измеренных вымирания coefficiennt (2630 М-1см-1) для ДОПЫ. Как альтернативного метода используйте assay протеина Брэдфорд21 для определения концентрации белка.
4. олигомеризации очищенный GFP-E90DOPA
- Добавить 1 мкл натрия Периодат H2O (6 мм) (1.0 экв GFP-E90DOPA) к раствору 20 мкл GFP-E90DOPA (300 мкм) в фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl.
- Разрешить реакция олигомеризации приступить при 25 ° C в течение 48 часов.
- Анализировать реакционную смесь электрофорезом геля натрия Додециловый сульфат Полиакриламид) (SDS-PAGE), как описано в шаге 6.
5. спряжение GFP-E90DOPA с алкины зонда по SPOCQ
- 1 мкл Cy5.5 связаны azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4,0 мм) (10 экв GFP-E90DOPA) к раствору 20 мкл GFP-E90DOPA (20 мкм) в фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl.
- Добавить 1 мкл натрия Периодат в H2O (400 мкм) (1.0 экв GFP-E90DOPA) в реакционной смеси.
- Разрешить SPOCQ реакции приступить при 25 ° C в течение 1 ч. Если используется зонд светочувствительные, покрывают реакционный сосуд с алюминиевой фольгой.
6. Очистка помечены GFP
- Разбавить SPOCQ реакционную смесь, добавив фосфатного буфера, содержащий 50 мм Na2HPO4 (рН 8.0) и 300 мм NaCl, до 500 мкл.
- Разбавленный раствор передать столбец спин центробежного фильтра. Центрифуга столбце спина в 14.000 x g при 4 ° C на 15 мин и отбросить потока через. Повторите этот шаг 3 x, чтобы удалить любые излишки Cy5.5-ADIBO.
- Передать очищенный образца из столбца спин пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Кроме того осуществляют очищения методом диализа против тот же буфер.
- Хранить очищенную ГФП при 4 ° C.
7. флуоресценции гель сканирование и анализ SDS-страницы
- Подготовить образцы протеина SDS-PAGE анализа, добавив 5 мкл пример буфера белков (см. Таблицу материалы) и 2 мкл DTT (1,00 М) до 13 мкл очищенный, или сырой, помечены GFP (13,6 мкм или 0,38 мг/мл). Для анализа олигомерных GFP используйте более высокую концентрацию GFP (67,8 мкм или 1,9 мг/мл). Денатурируйте белки путем инкубации их на 95 ° C в течение 10 мин.
- Место кассеты гель бис-трис SDS-PAGE 4% - 12% (приобретенные, готовые гель кассеты) для электрофореза ячейки и добавить идущий буфер (см. Таблицу материалы). Загрузите образцы протеина и маркер молекулярного веса. Запустите электрофорез на 35-40 мин на 200 V.
Примечание: Избегайте любой экспозиции образцы протеина для освещения путем проведения всех процессов в темноте, чтобы свести к минимуму обесцвечивания фото флуоресцентного зонда. - Используйте сканер флуоресценции для флуоресценции воображения. Оберните гель белка от электрофореза и поместите его на сканер флуоресценции. Сканируйте гель с помощью параметра соответствующие волны. Для Cy5.5 Выберите режим Cy5, в программное обеспечение сканера.
- Пятно гель с коммерческой белка, окрашивание реактива.
8. MALDI-TOF масс-Спектральный анализ в пищеварении трипсина
- Инкубируйте 100 мкл очищенный GFP-E90DOPA (2,2 мг/мл или 80 мкм) в буфер, содержащий 50 мм трис-HCl (рН 8,0), 0,1% (w/v) SDS, и 25 мм DTT в 60 ° C в течение 1 ч.
- 1 мкл Iodoacetamide в H2O (IAA, 4.0 M) (500 экв GFP-E90DOPA) в очищенной GFP-E90DOPA решение (80 мкм) в тот же буфер. Инкубируйте смесь при 25 ° C за 30 мин с защитой от света.
- Дайджест GFP-E90DOPA пример, добавив трипсина (1: 100 протеаз субстрат белка отношение [w/w]) и инкубировать реакционной смеси при 37 ° C в течение 4 ч.
- Очищайте переваривается пептид образца с помощью стандартного метода опреснительной с C18 спин столбцами.
- Анализировать переваривается пептиды сообщил протоколом для матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) с использованием альфа циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) как матрицы23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выражение системы для прямого включения ДОПЫ biosynthesized от ТПЛ показан на рисунке 1. Гены для пары развивались aa тРНК и Орсе находятся в плазмиды, и гена GFP (GFP-E90TAG), содержащий янтаря кодон в позиции 90 расположен в другом плазмида оценить включение ДОПЫ GFP флуоресценции. ТПЛ ген помещается в же плазмида выражения, содержащие ген GFP и конститутивно выразил максимизировать урожайность биосинтеза ДОПЫ. С помощью этой системы выражения, оптимальные условия для биосинтеза ДОПЫ были экранированы. Рост СМИ, используемые для этого эксперимента содержащиеся Аммиак 25 мм и 100 мм пируват, с различной концентрацией катехол (0 - 10 мм). Концентрация катехол имеет решающее значение для биосинтеза ДОПЫ, при концентрации аммиака и пирувата свыше 25 мм и 100 мм, соответственно, не затрагивают биосинтез и включение ДОПЫ. Оптимальная концентрация катехол было 10 мм, и в концентрации более 10 мм значительно сократили бактериальных клеток роста из-за его цитотоксичности. В этом оптимальном состоянии ДОПЫ был biosynthesized ТПЛ от его исходных материалов и biosynthesized, которую ДОПЫ непосредственно включены в GFP. Выраженной мутант GFP (GFP-E90DOPA) был очищен и анализируемой SDS-PAGE (рисA). Полнометражный GFP был очищен, и включение ДОПЫ было подтверждено MALDI-TOF масс-Спектральный анализ (рис. 2B). Белок был переваривается с трипсином, пептидный фрагмент, содержащий ДОПЫ был проанализирован, и результат показал эксклюзивные включение ДОПЫ с не обнаружено Tyr или других природных аминокислот включения. Включение эффективность ДОПЫ biosynthesized ТПЛ был похож на включение эффективность с 3 мм ДОПЫ, который является максимальная концентрация ДОПЫ из-за своей цитотоксичность19. Хотя 10 мм катехол показал умеренной токсичность, плотность клеток после 16 h время культуры было три-четыре раза выше, чем в присутствии 3 мм ДОПЫ. Очищенный протеин доходность на биосинтез был в три раза выше, чем от эксперимента с помощью 3 мм ДОПЫ (рис. 3).
Мутант, GFP, содержащие ДОПЫ был использован для сопряжения белка. ДОПЫ можно окислить в L-допаквинон, мягкий окислителей, и электрофильное хиноны реагирует с напряженными алкинам и нуклеофилами, например тиолами и амины и может быть использован для bioconjugation (рис. 4). GFP-E90DOPA была протестирована на SPOCQ циклоприсоединения, реагируя с натрием Периодат, после лечения с Cy5.5-ADIBO22. Эта реакция SPOCQ был проанализирован SDS-PAGE и флуоресценции изображений (рис. 5A). Интенсивным флуоресценции группы было отмечено с лечения натрия Периодат и Cy5.5-ADIBO, в то время как отсутствует флуоресценции полоса была показана в реакции управления с GFP-WT или без натрия Периодат лечения, подтверждающие эффективность и специфика Спряжение реакции с генетически включены ДОПЫ. Кроме того содержащие ДОПЫ GFP был использован для олигомеризации протеина. L-допаквинон реагирует с Lys или Cys же белка, что приводит к олигомерных белков. GFP-E90DOPA лечили Периодат натрия и олигомеризации была проведена в течение 48 часов, и реакция была проанализирована SDS-PAGE по сравнению с контрольной пробы без Периодат натрия лечения (рис. 5B). Анализ показал ясно олигомеризации шаблон с равноудаленных белка полосы для periodate лечение образца, в то время как образец элемента управления показал интактных белков без каких-либо других полос.
Рисунок 1 : Прямое включение ДОПЫ biosynthesized от катехол, пируват и аммиака. ДОПЫ является biosynthesized участием выраженной ТПЛ от катехол, пируват и аммиака в среднего роста. Пары развивались tRNA/Орсе для ДОПЫ совместно выразили учесть целевого белка GFP biosynthesized ДОПЫ. ТПЛ ген был помещен под учредительного промоутер для того чтобы начать ДОПЫ биосинтез перед вызывая экспрессия гена GFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : SDS-PAGE и MALDI-TOF MS анализ выраженные биосинтетических система GFP-E90DOPA. (A) GFP-E90DOPA выраженные биосинтетических система присутствии катехол 10 мм, 100 мм пируват и аммиак 25 мм и затем очистить хромотографией сродства Ni-НТА. GFP-WT был также проанализирован для сравнения. Образцы были отделены от Bis-трис 4% - 12% SDS-PAGE, и гель был запятнан Кумасси синим R-250. (B) анализ MALDI-TOF MS Пептидный фрагмент, содержащий ДОПЫ от tryptic пищеварение GFP-E90DOPA. Пептидный фрагмент из GFP-WT содержит остатки 86-96 (SAMPEGYVQER). Glu в фрагменте из GFP-WT заменяется ДОПЫ в Пептидный фрагмент из GFP-E90DOPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сравнение прямое включение biosynthesized ДОПЫ с общей генетической включение ДОПЫ. Эти панели показывают выраженные биосинтетических система и генетические включение при наличии 3 мм ДОПЫ без дополнительных пируват, аммиак и катехол GFP-E90DOPA. (A) белков, которые урожаи были получены из очищенного GFP-E90DOPA и (B) который плотность клеток были измерены в 16 h после индукции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Схема реакции bioconjugation GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA окисляется с конвертировать ДОПЫ в допаквинон. Реакция допаквинон содержащих белков с напряженными алкины достигает конкретных участков белка маркировки. Инкубационный допаквинон содержащих белков в высокой концентрации долгое время (48 h) вызывает белок самостоятельной спряжение производить белок олигомеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Bioconjugation мутантных белков, содержащих ДОПЫ. (A) SPOCQ реакции ДОПЫ содержащих белков с напряженными алкины, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT и GFP-E90DOPA лечили натрия Периодат и прореагировало с ADIBO-Cy5.5 60 мин. Реакции были проанализированы SDS-PAGE и Кумасси Витражи (вверху) и флуоресценции (внизу) изображения отображаются. (B) олигомеризации GFP-E90DOPA. ДОПЫ содержащих GFP лечили натрия Периодат и инкубировали в течение 48 часов. Реакционную смесь был проанализирован SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе биосинтез и прямое включение ДОПЫ описаны. Бактериальные клетки, используемые в этом методе можно синтезировать дополнительные аминокислоты и использовать его как неестественный строительный блок для синтеза белка. Генетическая включение неестественные аминокислоты был ключевой технологией для развития неестественным организма с расширенной генетического кода. Однако этот метод был технически неполной и вносятся изменения для повышения эффективности включения и свести к минимуму возмущений для систем внутреннего перевода. В последнее время достигнуты значительные успехи в методе путем перераспределения кодонов24,25 неестественные аминокислоты и инженерных ортогональных трансляционная компоненты26,27,28 ,29. В дополнение к эти улучшения, системы, описанные здесь предлагает другую возможность неестественным организм с расширенной генетический код: биосинтез неестественные аминокислоты. Эта возможность дает системе неестественным больше независимости как организм с расширенной генетических репертуар. Кроме того ДОПЫ показывает умеренной токсичности на бактериальный штамм, используется в этом методе и 3 мм ДОПЫ, клеточный рост значительно сократились, что привело к низким содержанием белка урожая. С помощью системы прямого включения, токсичность был сокращен и белка доходность выросла втрое.
Мутант Орсе, используется для включения генетической ДОПЫ имеет умеренный эффективность и верности и включает Tyr в низкой концентрации ДОПЫ. 18 поэтому, биосинтез ДОПЫ в бактериальных клетках должна быть достаточно эффективной для того, чтобы предотвратить включение Tyr. ДОПЫ биосинтез ТПЛ от катехол, аммиак и пирувата является обратимой реакции, и высокие концентрации исходных материалов, необходимых для эффективного биосинтеза. Однако катехол не может использоваться в более чем 10 мм, потому что он является токсичным для бактерий штамма, используемые в настоящем Протоколе. Концентрация DTT также имеет важное значение в этом протоколе. ДОПЫ показывает его токсичности, когда он преобразуется в L-допаквинон, и DTT добавляется в средних роста и уменьшить степень окисления. Мы наблюдали снижение роста клеток, когда концентрация DTT было более 300 мкм. Таким образом для оптимального биосинтез и включение ДОПЫ, компоненты (особенно катехол и DTT) для питательной среды следует использовать в соответствующих концентрациях как описано в настоящем Протоколе.
Этот протокол также описывает приложений ДОПЫ содержащих белков для конкретных участков белка спряжение. L-допаквинон, созданного путем окисления ДОПЫ эффективно реагирует с напряженными алкины, связано с биохимическими зонд. Этой реакции циклоприсоединения обычно быстрее, чем реакции нуклеофильного амины или тиолы. Тем не менее окисление ДОПЫ должна осуществляться в присутствии ДОПЫ содержащих белков и напряженными алкины, чтобы свести к минимуму Нуклеофильное Добавление нуклеофилами в протеине. Таким образом порядок добавления реагентов для этой реакции является критическим.
Для белка спряжение доступны многие неестественные аминокислоты, и некоторые из них достичь скорости быстрой реакции и отличные спряжение эффективность30,,3132,33. Эти аминокислоты содержат биортогональный функциональных групп таких азиды, алкины, напряженные алкенов или алкинам и tetrazines. Хотя они полезны для конкретных участков белка спряжение, многие из них являются дорогостоящими или коммерчески недоступными, что ограничивает их применения, особенно в тех, которые требуют крупных белков. Таким образом будет полезным для фармацевтической и промышленных применений, требующих крупномасштабных мутантных белков, содержащих биохимического датчика или наркотиков (антитела наркотиков биосинтеза ДОПЫ от дешевых исходных материалов и его прямого включения сопряжения, ADC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано глобальной программы исследований границы (СР 2015M3A6A8065833), и основные программы исследований науки (2018R1A6A1A03024940) через Национальный фонд исследований Кореи (NRF) финансируется правительством Кореи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
- Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
- Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
- Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
- Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
- Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
- Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
- Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
- Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
- Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
- Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
- Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
- Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
- Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
- Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
- Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
- Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
- Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
- Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
- Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
- Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
- Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
- Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).
