Summary
ここでは、単純な開始材料から L-ジヒドロキシフェニルアラニン生合成の遺伝的定款及びタンパク質接合への応用のためのプロトコルを提案する.
Abstract
L-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) は、動物や植物中のカテコールアミンの合成に存在するアミノ酸です。アミノ酸の特定の生化学的な特性のため生化学的アプリケーションで複数用途があります。このレポートでは、生合成されるドーパの定款の遺伝的プロトコルとその共役タンパク質への応用をについて説明します。ドーパは、チロシン フェノール-リアーゼ (TPL) カテコール、ピルビン酸とアンモニア、によって生合成とアミノ酸は直接進化したアミノアシル tRNA とアミノアシル tRNA 合成酵素のペアを使用して遺伝的結合法による蛋白質に組み込まれています。この直接混入システムは少し定款その他天然アミノ酸と DOPA の前の遺伝的結合システムよりもより良い蛋白質収量、DOPA 効率的に組み込まれています。ドーパ含有タンパク質とタンパク質共役なサイトと様々 な用途にその有用性を示しています。このプロトコルは、蛋白質科学者目的サイト、医薬・工業用の活用でドーパを含む突然変異体蛋白質の効率的な生合成のための詳細な手順を提供します。
Introduction
ドーパは、動物と植物のカテコールアミンの生合成に関与するアミノ酸です。このアミノ酸はチロシン水酸化酵素と分子酸素 (O2)1により Tyr から合成されます。ドーパはドーパミンの前駆体である、血液脳関門を透過することができますので、2パーキンソン病の治療に使用されています。DOPA はウェットコンディション3,4,5,6,7でムール貝との接着は、ムール貝の接着性蛋白 (地図) にもあります。Tyr は、当初ドーパがマップ内にある tyrosinases8,9によってドーパに変換されます位置でエンコードされます。その興味深い生化学的な特性のためドーパは、さまざまなアプリケーションで使用されています。ドーパの dihydroxyl グループは、化学的に酸化しやすく、アミノ酸、L-dopaquinone、粕の前駆体に簡単に変換します。おかげでその高の有する L dopaquinone およびその誘導体は、架橋とチオール化合物とアミン10、11,12,13と活用のため使用されています。1, 2-ベンゾキノンは環化付加反応のジエンとしても機能することができますおよびひずみ促進酸化制御 cyclooctyne-1, 2-キノン (SPOCQ) 環化付加反応による14化反応に使用されています。さらに、dihydroxyl グループは、Fe3 +と Cu2 +などの金属イオンをキレートすることができます、DOPA を含んでいる蛋白質は薬剤配達および15,16を検出金属イオンのため利用されています。
DOPA を遺伝的直交アミノアシル tRNA (aa tRNA) とアミノアシル tRNA 合成酵素 (aaRS) のペア17を使用して蛋白質に組み込まれて、タンパク質共役および架橋10、11,用12,13。本報告では, 実験結果と安価な開始材料と化反応への応用から DOPA 生合成の遺伝の混入のためのプロトコルを説明します。ドーパは、TPL を使用して大腸菌におけるアンモニア、ピルビン酸、カテコールから生合成されます。生合成されるドーパはドーパの進化した aa tRNA と aaRS のペアを表現することによってタンパク質に直接組み込まれます。また、ドーパを含む生合成タンパク質の蛍光プローブとオリゴマー蛋白質を生成する架橋共役は site-specifically。このプロトコルはドーパを含む動植物の突然変異体蛋白質に蛋白質科学者にとって役に立つ、生化学的プローブまたは医薬・工業用薬剤でタンパク質を共役します。
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Protocol
1. プラスミド構築
- 表現シトロバクター属 freundiiから TPL 遺伝子構成のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子発現プラスミド (pBAD-デュアル-TPL-GFP-WT) を構築6-タグの制御の下で、araBAD プロモーター。PBAD-デュアル-TPL-GFP-E90TAG サイト指示された突然変異誘発のプロトコルを使用してオレンジ色のコドン (タグ)、DOPA のサイト (E90) のコドンを交換してください。このプラスミッドの構造の詳細は、当社の以前のレポート18で説明しました。
- ドーパの定款の遺伝して、tRNA/aaRS 表現のプラスミド (pEVOL-DHPRS2)18,の19を構築します。pEVOL は独立したプロモーターの aaRS 遺伝子の 2 つのコピーを表現する特別なプラスミッドのベクトルとプラスミドの詳細な情報は以前報告19に記載されています。
- 市販のプラスミド調製キットを使用すると、高純度の保有するプラスミド Dna を取得できます。必要に応じて、agarose のゲルの電気泳動を使用して準備された Dna の純度を確認します。
2. 文化準備
-
エレクトロポレーション
- この実験に使用電気有能なエシェリヒア属大腸菌DH10β ひずみ。有能なセルの 20 μ L に 1 μ L のそれぞれのプラスミッド DNA (pEVOL DHPRS2 と pBAD デュアル TPL GFP E90TAG) を追加します。ピペットを使用して、均質の混合物をように優しく混ぜます。
- エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュヴェットをエレクトロポレーション室。キュベットを押し込むようにしっかりキュベット商工会議所商工会議所にお問い合わせください。
- キュベット、25 μ F を使用して衝撃を与えると 2.5 kV 0.1 cm キュヴェットのため。
- 2% (w/v) トリプトンを含む prewarmed 超最適スープ (SOC) の 1 mL を追加し、0.5% (w/v) 酵母エキス、10 mM の NaCl、2.5 mM KCl、MgCl2、10 mM と 20 mM グルコース、キュヴェットへ文化管にセルを転送します。セルを救出するには、揺れで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
- 35 μ g/mL クロラムフェニ コールと 100 μ g/mL アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート上救出のセルの 10-100 μ L を広めます。16 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
-
スターター文化準備
- 抗生物質を含む LB 培地 5 ml 変形単一コロニーを接種します。揺れで 37 ° C で 12 h のコロニーを孵化させなさい。
3. 発現・精製合成システムによって GFP E90DOPA
-
生合成システムによる GFP E90DOPA の発現
- ペンシルバニア 5052 中20 (50 mM ナ2HPO4、50 ミリメートル KH2PO4、25 mM [NH4]24、2 mM MgSO40.1% [w/v] 微量金属、0.5% [w/v] グリセロール、100 mL にスターター文化 (2 mL) を転送します。0.05% [w/v] グルコースとアミノ酸 5% [w/v] [pH 7.25]) 続いて 35 μ g/mL クロラムフェニ コール、100 μ g/mL アンピシリン、100 mM ピルビン酸、カテコール 10 mM、25 mM アンモニア、および 300 μ M ジチオトレイトール (DTT) を含む振動 30 ° C で培養。
- 0.2% (w/v) L-アラビノースの 2 mL を追加し、550 nm に達すると 0.8 の光学濃度 (OD)。揺れで 30 ° C で 12 h サンプルをインキュベートします。
- スピン ・ ダウン 5 分 11,000 x g で細胞、上澄みを廃棄し、-80 ° C で細胞ペレットを凍結
-
セル換散
- 氷の上細胞ペレットを解凍し、50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を含む換散バッファーの 10 mL の細胞を再懸濁します 10 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
- 25 の 10 分使用 80% 超音波振幅パルスで氷の上再懸濁細胞を超音波 s オフと 35 s。
- 細胞ライセート 15 分浄化新鮮なチューブに上清転送のための 4 ° C で 18,000 × g でスピンダウンし、ペレットを破棄します。
-
Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
- 上清に Ni 国税庁 (ニトリロ三酢酸) 樹脂 (樹脂懸濁液 100 mL 文化のための 300 μ L) を追加し、1 h の懸濁液を優しく揺することによって蛋白質を 4 ° C で Ni NTA ガレージにバインドします。
- ポリプロピレン列に懸濁液を転送させ、樹脂 3 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を含む洗浄バッファーの 5 ml x 20 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
- 3 タンパク質を溶出 300 μ L の溶出バッファーを含む 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) x 250 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
- 280 で吸光度を測定することによりタンパク質の濃度を決定する nm。280 GFP E90DOPA の消散係数 (24,630 M-1cm-1) nm を求めた蛋白質消光係数電卓 (例えばhttps://web.expasy.org/protparam/) と独立して消光ドーパの coefficiennt (2630 M-1cm-1)。別の方法として、蛋白質の集中の決定のためブラッドフォード蛋白質の試金21を使用します。
4. 精製 GFP E90DOPA の重合
- H2O (6 mM) の過ヨウ素酸ナトリウムの 1 μ L を追加 (1.0 GFP E90DOPA に当量) GFP E90DOPA の 20 μ L の溶液に (300 μ M) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーで、300 mM の NaCl。
- 48 h の 25 ° C で進行する重合反応を許可します。
- 反応混合物を分析すると、ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって) (SDS-PAGE) 手順 6 で説明しました。
5. SPOCQ でアルキン探針を用いた GFP E90DOPA の活用
- Cy5.5 リンク azadibenzocyclooctyne (Cy5.5 ADIBO)22 H2O (4.0 mM) 1 μ L を追加 (10 GFP E90DOPA に当量) GFP E90DOPA の 20 μ L の溶液に (20 μ M) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーで、300 mM の NaCl。
- H2O の過ヨウ素酸ナトリウムの 1 μ L を追加 (400 μ M) (1.0 GFP E90DOPA に当量) 反応混合物に。
- SPOCQ 反応を 25 ° C、1 h で実行を許可します。光に敏感なプローブを使用する場合は、アルミ箔で反作用の容器をカバーしてください。
6. ラベルの GFP の浄化
- 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーを追加して SPOCQ 反応混合物を希薄化と 300 mM NaCl、最大 500 μ L。
- 希釈した溶液を遠心フィルター スピン列に転送します。スピン列 4 ° C 15 分で 14,000 × gで遠心分離し、流れを破棄します。任意の余分な Cy5.5 ADIBO を除去するために 3 x この手順を繰り返します。
- 1.5 mL 遠心チューブにスピン列から精製サンプルを転送します。
- また、同じバッファーに対して透析による浄化を行います。
- 4 ° C で精製された GFP を格納します。
7. SDS-PAGE 解析およびスキャン蛍光ゲル
- SDS-PAGE 分析用蛋白質のサンプルバッファーの 5 μ L を追加することによって蛋白質のサンプルを準備する (材料の表を参照してください)、精製、または原油の 13 μ L に地デジ (1.00 M) 2 μ L ラベル GFP (13.6 μ M または 0.38 mg/mL)。オリゴマーの GFP の解析、GFP (67.8 μ M または 1.9 mg/mL) の高濃度を使用します。95 ° C 10 分にそれらをインキュベートし、蛋白質を変化します。
- 電気泳動セルに 4%-12% ビス トリス SDS-PAGE ゲル カセット (カセット購入、あらかじめ作られたゲル) を配置し、実行バッファーを追加 (材料の表を参照してください)。蛋白質のサンプルと分子量マーカーを読み込みます。200 V で 35-40 分間電気泳動を実行します。
注: は、蛍光プローブの光退色を最小限に抑えるため、暗闇の中のすべてのプロセスの遂行によって光に蛋白質のサンプルの任意の露出を避けてください。 - 蛍光イメージングのための蛍光スキャナーを使用します。タンパク質ゲル電気泳動からをラップし、蛍光スキャナーの上に置きます。ゲルをスキャンするには、適切な波長の設定を使用します。Cy5.5、スキャナー ソフトウェアで提供されている Cy5 モードを選択します。
- 試薬を汚す商業蛋白質のゲルを染色します。
8. MALDI-TOF MS を用いたトリプシンの消化力
- 精製の GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL または 80 μ M) 50 mM トリス-HCl (pH 8.0) 0.1% を含むバッファー (w/v) SDS のと 60 ° C 1 時間で 25 mM DTT の 100 μ L を孵化させなさい。
- ヨードアセトアミド H2O (IAA、4.0 M) 1 μ L を追加 (500 GFP E90DOPA に当量) 同じバッファーにおける精製 GFP E90DOPA 液 (80 μ M) へ。光からの保護と 30 分のための 25 の ° C で混合物を孵化させなさい。
- トリプシン (1: 100 プロテアーゼの基質タンパク質比/w) を追加することによって GFP E90DOPA サンプルを消化し、4 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
- C18回転カラムを用いた標準脱塩法による消化ペプチドのサンプルを浄化します。
- マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) をマトリックス23として α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) を使用して、報告されたプロトコルによって消化ペプチドを分析します。
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Representative Results
直接混入防止から DOPA 生合成の発現システムを図 1に示します。進化した aa tRNA と aaRS のペアのための遺伝子はプラスミドに配置され、GFP 蛍光で 90 の位置に黄色のコドンを含む GFP 遺伝子 (GFP E90TAG) DOPA の取り込みを評価するもう一つのプラスミドであります。TPL 遺伝子は GFP 遺伝子を含んでいる同じ発現プラスミドと DOPA の生合成の収率を最大限に発現を示した。この式のシステムを使用して、DOPA 生合成の最適条件が上映されました。この含まれている実験 25 mM アンモニアと 100 mM ピルビン酸、カテコール (0 - 10 mM) のさまざまな濃度で使用される成長媒体。カテコール濃度はドーパ生合成、アンモニア、ピルビン酸の濃度以上 25 mM と 100 mM 間の重要なそれぞれ影響しなかった生合成と DOPA の設立。カテコールの最適濃度は 10 mM と 10 mM 以上の濃度がその細胞毒性による細菌細胞の成長を大幅に減少します。この最適な状態でドーパは、TPL によってその原料から生合成と生合成されるドーパは GFP に直接組み込まれただった。発現変異 GFP (GFP E90DOPA) は精製され、SDS ページ (図 2A) によって分析します。フルレングスの GFP を精製したと DOPA 定款は MALDI-TOF 質量分析 (図 2B) によって確認されました。タンパク質はトリプシンで消化された、ドーパを含むペプチド フラグメントを分析し、結果を示したない検出 Tyr と DOPA の排他的な定款又はその他の天然のアミノ酸取り込み。TPL によってドーパ生合成の取り込み効率は 3 mm のドーパは、DOPA の最大濃度は、その細胞毒性19 のため混入効率に似ていた。中程度の毒性を示したが, 10 mM カテコール、培養時間の 16 時間後の細胞密度は 3-3 mM ドーパの存在下で 4 倍以上だった。生合成によって浄化された蛋白質収量が 3 mM ドーパ (図 3) を用いた実験からよりも 3 倍高かった。
ドーパを含む GFP を用いてタンパク質共役の変異体。DOPA 酸化は穏やかな酸化剤、L dopaquinone に、求キノン緊張アルキンとチオール、アミンなどの求核剤と反応して化反応 (図 4) に使用することができます。GFP E90DOPA ナトリウムとの反応による SPOCQ の環化付加反応のテストされた過ヨウ素酸、Cy5.5 ADIBO22治療が続きます。この SPOCQ の反応は、SDS-PAGE および蛍光イメージング (図 5A) によって分析されました。強烈な蛍光バンド観察されたナトリウムの治療過ヨウ素酸 Cy5.5 ADIBO、制御反応 GFP WT のナトリウム有無で蛍光バンドは示されてない過ヨウ素酸治療、効率性と特異性を確認、遺伝子組み込まれた DOPA との共役反応。また、ドーパ含む GFP は多量に使用されました。L dopaquinone は、オリゴマー蛋白質の結果同じタンパク質の Lys やシステインと反応します。GFP E90DOPA を施した過ヨウ素酸ナトリウムと 48 時間、重合を行った治療 (図 5B) 過ヨウ素酸、ナトリウムなし反応がコントロールのサンプルと比較して SDS-PAGE により解析しました。分析は、コントロールのサンプルを示した他のバンドなしそのまま蛋白質に過ヨウ素酸処理のサンプルでは、等間隔の蛋白質バンドと明確な重合パターンを示した。
図 1: カテコール、ピルビン酸とアンモニアから DOPA 生合成の設立を指示します。ドーパは、培地にアンモニア、ピルビン酸、カテコール発現クローン TPL によって生合成されます。ドーパの進化した tRNA/aaRS ペアは共に生合成されるドーパを組み込む対象タンパク質 GFP 発現です。TPL 遺伝子は、GFP 発現を誘導する前に DOPA 生合成を開始するために構成のプロモーター下に置かれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: GFP E90DOPA 設計された生合成システムによって表現の SDS-PAGE と MALDI-TOF MS 解析します。(A) GFP E90DOPA 10 mM カテコール、100 mM ピルビン酸と 25 mM アンモニア存在下で設計された生合成システムによって表される、Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによってそれから浄化されます。GFP WT も比較のため行った。Bis トリス 4%-12 %sds のページでサンプルを分離し、ゲルが R-250 Coomassie ブリリアント ブルーに染まっていました。(B) GFP E90DOPA のトリプシンの消化力からドーパを含むペプチド フラグメントの MALDI-TOF 質量分析。GFP WT からペプチド フラグメントには、86-96 (SAMPEGYVQER) 残基が含まれています。GFP WT からフラグメントの Glu GFP E90DOPA からペプチド フラグメント ドーパに置き換えられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: DOPA の一般的な遺伝の設立に直接生合成されるドーパ定款の比較。これらのパネルは、GFP E90DOPA 設計された生合成システムと 3 mM ドーパ追加ピルビン酸、アンモニア、およびカテコールなし存在下で遺伝的結合で表現を表示します。(A) 収穫された精製 GFP-E90DOPA、および (B) 誘導後 16 時間で細胞密度を測定したから得られるタンパク質です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: の GFP E90DOPA 化反応の反応機構。Dopaquinone ドーパに変換する GFP E90DOPA は酸化されます。緊張のアルキンの dopaquinone 含有タンパク質の反応部位特異的タンパク質ラベリングを実現します。長い間 (48 h) 高濃度の dopaquinone を含むタンパク質の潜伏蛋白自己共役オリゴマー蛋白質を生成するが発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ドーパを含む突然変異体蛋白質の化反応。(A) SPOCQ 緊張アルキン、ADIBO Cy5.5 とドーパ含有タンパク質の反応。GFP WT と GFP E90DOPA ナトリウムで処理した過ヨウ素酸し、60 分 ADIBO Cy5.5 と反応しました。反応は SDS のページ、および Coomassie ステンド グラス (上) によって分析された、蛍光 (下) 画像が表示されます。GFP E90DOPA (B) 重合。DOPA 含む GFP がナトリウムで処理した過ヨウ素酸し、48 時間培養しました。反応混合物は、SDS-PAGE によって分析されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは生合成と DOPA の直接の混入を説明します。このメソッドで使用される細菌の細胞は、他のアミノ酸を合成でき、タンパク質合成の不自然なビルディング ブロックとして使用します。遺伝的非天然型アミノ酸定款は、展開された遺伝コードと不自然な有機体の開発のためのキー技術をされています。ただし、このメソッドは技術的に完成されているし、定款の効率を改善し、内因性の翻訳システムに摂動を最小限に抑えるために変更されています。コドン24,25非天然型アミノ酸・26,直交直線移動成分工学27,28 を再割り当てする方法の著しい進歩が達成されている最近では、 ,29。拡張遺伝暗号と不自然な生物にこれらの改良に加えてここで説明したシステムが別の能力を提供しています: 不自然なアミノ酸の生合成。この機能は、不自然なシステムに拡張遺伝的レパートリーで有機体としてより自立した生活を提供します。また、ドーパは、低蛋白質収量につながった 3 mM ドーパ、細胞の成長が大幅に低下、このメソッドで使用される細菌の歪みで中程度の毒性を示しています。直接混入システムを使用して、毒性が減少したし、蛋白質収量が 3 倍に増加しました。
AaRS 変異ドーパの定款の遺伝的使用は適度な効率と忠実度と DOPA の低濃度で Tyr が組み込まれています。18したがって、DOPA 細菌細胞での生合成は Tyr の混入を防ぐために十分に効率的にする必要があります。カテコール、アンモニア、ピルビン酸から TPL による DOPA 生合成は可逆反応、効率的な生合成に必要な開始材料の高濃度です。しかし、このプロトコルで使用される細菌の歪みに有毒であるので、10 mM 以上をカテコールに使用できません。DTT の濃度もこのプロトコルでは重要です。ドーパは、L-dopaquinone に変換され、酸化速度を減らすために培地に DTT を追加、その毒性を示しています。DTT 濃度が以上 300 μ M、細胞の増殖の減少を見ました。したがって、最適な生合成と DOPA の定款は、培養液中の成分 (特にカテコールと DTT) すべき濃度で使用する適切なこのプロトコルで説明されているよう。
このプロトコルはまた、ドーパ含有タンパク質部位特異的タンパク質共役用のアプリケーションを説明します。L dopaquinone 効率的にドーパの酸化によって生成されるは、生化学的なプローブにリンクされている緊張したアルキンと反応します。この環化付加反応は、通常アミンやチオールによる求核付加反応よりも高速です。それにもかかわらず、DOPA の酸化はドーパ含有タンパク質とタンパク質の求核試薬による求核付加を最小限に抑えるための緊張したアルキン存在下で実施されなければなりません。したがって、この反応の試薬の付加の順序は重要です。
タンパク質共役用非天然型アミノ酸の多くがあり、それらのいくつかを達成する高速反応速度と優れた活用効率30,31,32,33です。これらのアミノ酸には、直交官能アザイド、アルキン、緊張したアルケンまたはアルキン、tetrazines などが含まれています。部位特異的タンパク質共役に役立ちますが、それらの多くは高価なまたは商業的アクセスできない大規模なタンパク質を必要とするものを中心に、彼らのアプリケーションを制限します。したがって、安い原料直接設立からドーパの生合成は生化学的プローブまたは医薬品 (抗体医薬を含む大規模な突然変異体蛋白質を必要とする医薬・工業用アプリケーションの役に立つでしょうADC 共役)。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、地球フロンティア研究プログラム (NRF 2015M3A6A8065833)、によって支えられた、基本的な科学研究プログラム (2018R1A6A1A03024940) 韓国国立研究権財団 (NRF) を通じて韓国政府によって資金を供給します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
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