Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la constitution génétique de L-dihydroxyphénylalanine biosynthétisée à partir de matières premières simples et son application à la conjugaison de la protéine.

Abstract

L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) est un acide aminé présent dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. En raison de ses propriétés biochimiques particulières, l’acide aminé a des utilisations multiples applications biochimiques. Ce rapport décrit un protocole pour la constitution génétique de biosynthétisée DOPA et son application à la conjugaison de la protéine. DOPA est biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase (TPL) de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac et l’acide aminé est incorporé directement dans des protéines par la méthode de constitution génétique utilisant un aminoacyl-tRNA évoluée et paire d’aminoacyl-tRNA synthétase. Ce système d’incorporation directe intègre efficacement DOPA avec peu d’incorporation d’autres acides aminés naturels et avec le meilleur rendement de protéine que le précédent système de constitution génétique pour DOPA. Conjugaison de protéine avec des protéines contenant de DOPA est efficace et spécifique au site et montre son utilité pour des applications diverses. Ce protocole prévoit scientifiques de protéine avec des procédures détaillées pour la biosynthèse efficace de protéines mutantes contenant DOPA aux sites désirés et leur conjugaison pour applications industrielles et pharmaceutiques.

Introduction

DOPA est un acide aminé impliqué dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. Cet acide aminé est synthétisé à partir de Tyr par la tyrosine hydroxylase et la molécule de dioxygène (O2)1. Parce que la DOPA est un précurseur de la dopamine et peut pénétrer la barrière hémato - encéphalique, il a été utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson,2. DOPA se trouve également dans les protéines d’adhérence moule (cartes), qui sont responsables des propriétés adhésives des moules dans des conditions humides3,4,5,6,7. Tyr est initialement codé dans les positions où la DOPA se trouve dans les cartes et est ensuite converti en DOPA par tyrosinases8,9. En raison de ses propriétés biochimiques intéressantes, DOPA a été utilisé dans une variété d’applications. Le groupe dicarbométhoxyl de DOPA est chimiquement sujets à l’oxydation, et l’acide aminé est facilement transformé en L-dopaquinone, un précurseur des mélanines. En raison de son caractère électrophile haut, L-dopaquinone et ses dérivés ont été utilisés pour la réticulation et conjugaison avec les thiols et amines10,11,12,13. 1, 2-quinones peuvent également fonctionner comme un diène pour les réactions de cycloaddition et ont été utilisés pour bioconjugaison par contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. En outre, le groupe dicarbométhoxyl peut chélater les ions métalliques tels que Fe3 + et Cu2 +, et les protéines contenant DOPA ont été utilisés pour l’administration des médicaments et des ions métalliques détection15,16.

DOPA a été génétiquement incorporé dans les protéines en utilisant un orthogonal aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) et aminoacyl-ARNt synthétase (RAA) paire17 et utilisé pour la protéine conjugaison et réticulation10,11, 12,,13. Dans le présent rapport, les résultats expérimentaux et des protocoles pour la constitution génétique de DOPA biosynthétisée à partir de matières premières bon marchés et de ses applications à bioconjugaison sont décrits. DOPA est biosynthétisée à l’aide d’un TPL et à partir de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac chez Escherichia coli. La biosynthèse DOPA est directement incorporée dans les protéines en exprimant une paire aa-ARNt et aaRS évoluée pour DOPA. En outre, la protéine biosynthétisée contenant la DOPA est relativement conjuguée avec une sonde fluorescente et réticulé pour produire des oligomères de protéine. Ce protocole sera utile pour les scientifiques de protéine, à biosynthétiser les protéines mutantes contenant DOPA et conjuguer les protéines avec sondes biochimiques ou de médicaments destinés à des applications industrielles et pharmaceutiques.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Construction de plasmide

  1. Construire un plasmide d’expression (pBAD-double-TPL-GFP-WT) qui exprime le gène TPL de Citrobacter freundii , sous le contrôle d’un promoteur constitutif et le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) avec un son6-tag sous le contrôle de la araBAD promoteur. Pour pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG, remplacer le codon pour le site (E90) de DOPA avec un codon ambre (TAG), à l’aide d’un protocole de mutagénèse dirigée. Les détails pour la construction de ce plasmide a été décrit dans notre précédent rapport18.
  2. Construire un ARNt/RAA-exprimant plasmide (pEVOL-DHPRS2)18,19 de la constitution génétique de DOPA. pEVOL est un vecteur plasmidique spécial exprimant deux copies des gènes de l’aaRS avec promoteurs indépendants, et les informations détaillées du plasmide sont décrite dans un précédent rapport19.
  3. Trousses de préparation de plasmide disponibles dans le commerce permet d’obtenir haute pureté plasmide DNAs. Vérifier la pureté de l’ADN préparés à l’aide de gel d’agarose, si nécessaire.

2. préparation de la culture

  1. Électroporation
    1. Utilisation de l’electro-compétente DH10β souche d’e. coli pour cette expérience. Ajouter 1 µL de chaque plasmide d’ADN (pEVOL-DHPRS2 et pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG) à 20 µL de cellules compétentes. Mélanger doucement pour faire un mélange homogène, à l’aide d’une pipette.
    2. Transvaser le mélange dans les cuvettes d’électroporation. Placez la cuve dans le compartiment d’électroporation. Pousser la cuvette dans la chambre faire cuvette-chambre ferme contacter.
    3. Choquer la cuvette, à l’aide de 25 µF et 2,5 kV pour cuvettes de 0,1 cm.
    4. Ajouter 1 mL de bouillon super optimale préchauffée (SOC), contenant 2 % (p/v) tryptone, 0,5 % (p/v), extrait de levure, 10 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl2et 20 mM de glucose, de la cuvette et transférer les cellules dans un tube de culture. Sauver les cellules en les incubant pendant 1 h à 37 ° C sous agitation.
    5. Diffuser 10-100 µL de cellules sauvées sur une gélose de bouillon (LB) de lysogénie contenant 35 µg/mL chloramphénicol et 100 ampicilline µg/mL. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 16 h.
  2. Préparation de la culture de démarreur
    1. Ensemencer une seule colonie transformée dans 5 mL de milieu LB contenant des antibiotiques. Incuber la colonie pendant 12 h à 37 ° C sous agitation.

3. expression et Purification de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse

  1. Expression de GFP-E90DOPA par un système de biosynthèse
    1. Transférer la culture starter (2 mL) pour 100 mL de PA-5052 moyenne20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2pour métaux, 0,5 % [p/v] glycérol, traces de4, 2 mM MgSO4, 0,1 % [p/v] 0.05 % [p/v] glucose et des acides aminés 5 % [p/v] [pH 7.25]) contenant 35 µg/mL chloramphénicol, ampicilline de µg/mL 100, pyruvate de 100 mM, catéchol 10 mM, ammoniaque 25 mM et 300 µM le dithiothréitol (DTT) suivie d’une incubation à 30 ° C sous agitation.
    2. Ajouter 2 mL de 0,2 % (p/v) L-arabinose quand la densité optique (do) à 550 nm atteint 0,8. Incuber l’échantillon pendant 12 h à 30 ° C sous agitation.
    3. Tournez en bas les cellules à 11 000 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et geler le culot cellulaire à-80 ° C.
  2. Lyse cellulaire
    1. Décongeler le culot cellulaire sur la glace et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de lyse contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 10 mM et 300 mM NaCl.
    2. Laisser agir les cellules resuspendues sur glace pendant environ 10 minutes utilisation 80 % sonication amplitude avec une impulsion de 25 s sur et 35 s éteint.
    3. Tournez en bas le lysat à 18 000 x g à 4 ° C pendant 15 min. Transférez le surnageant dans un tube frais pour la purification cellulaire et jeter le culot.
  3. Chromatographie d’affinité ni-NTA
    1. Résine de Ni-NTA (acide nitrilotriacétique) (300 µL de suspension de résine pour une culture de 100 mL) s’ajoute le surnageant et lier les protéines à la résine de Ni-NTA à 4 ° C en le secouant doucement la suspension pendant 1 h.
    2. Transférer la suspension à une colonne en polypropylène et laver la résine 3 x 5 ml de tampon de lavage contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 20 mM et 300 mM NaCl.
    3. Éluer les protéines 3 x 300 µl de tampon d’élution contenant 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), imidazole de 250 mM et 300 mM NaCl.
    4. Déterminer la concentration de la protéine en mesurant l’absorbance à 280 nm. Le coefficient d’extinction (24 630 M-1cm-1) pour GFP-E90DOPA à 280 nm a été évaluée par un calculateur de coefficient protéine extinction (p. ex., https://web.expasy.org/protparam/) et l’extinction mesurée indépendamment coefficiennt (2630 M-1cm-1) pour DOPA. Comme méthode alternative, utiliser la Bradford protéine test21 pour la détermination de la concentration de protéine.

4. l’oligomérisation de purifiée GFP-E90DOPA

  1. Ajouter 1 µL de sodium periodate H2O (6 mM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (300 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
  2. Permettre la réaction de l’oligomérisation de rouler à 25 ° C pendant 48 h.
  3. Analyser le mélange réactionnel par électrophorèse sur gel sodium dodécyl sulfate polyacrylamide) (SDS-PAGE) tel que décrit à l’étape 6.

5. conjugaison de GFP-E90DOPA avec une sonde alcyne par SPOCQ

  1. Ajouter 1 µL de l’azadibenzocyclooctyne lié à Cy5.5 (Cy5.5-ONEMBOTEH)22 H2O (4,0 mM) (10 équivalent à GFP-E90DOPA) à une solution de 20 µL de GFP-E90DOPA (20 µM) dans un tampon phosphate contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl.
  2. Ajouter 1 µL de sodium periodate H2O (400 µM) (1,0 équivalent à GFP-E90DOPA) au mélange réactionnel.
  3. Permettre la réaction SPOCQ de rouler à 25 ° C pendant 1 h. Si on utilise une sonde sensible à la lumière, couvrir la cuve de réaction avec du papier aluminium.

6. la purification de la GFP étiquetée

  1. Diluer le mélange réactionnel de SPOCQ en ajoutant un tampon phosphate, contenant 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) et 300 mM NaCl, jusqu'à 500 µL.
  2. Transférer la solution diluée dans une colonne filtre centrifuge. Centrifuger la colonne à centrifuger à 14 000 x g à 4 ° C pendant 15 min et éliminer les intermédiaires. Répétez cette opération 3 fois afin d’éliminer tout excès de Cy5.5-ONEMBOTEH.
  3. Transférer l’échantillon purifié de la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
  4. Vous pouvez également effectuer une purification par la dialyse contre le même tampon.
  5. Stocker la GFP purifiée à 4 ° C.

7. SDS-PAGE analyse et Gel de Fluorescence Scanning

  1. Préparer des échantillons de protéines pour l’analyse de SDS-PAGE en ajoutant 5 µL de tampon de protéine (voir la Table des matières) et 2 µL de la TNT (1,00 M) à 13 µL de purifiée, ou brut, l’étiquette GFP (13,6 µM ou 0,38 mg/mL). Pour une analyse des oligomère GFP, utiliser une concentration plus élevée de GFP (67,8 µM ou 1,9 mg/mL). Dénaturer les protéines en les incubant à 95 ° C pendant 10 min.
  2. Placer une cassette de gel Bis-Tris SDS-PAGE 4-12 % (cassettes achetées, premade gel) à la cellule de l’électrophorèse et ajouter une mémoire tampon en cours d’exécution (voir la Table des matières). Charger les échantillons de protéine et un marqueur de poids moléculaire. Exécutez l’électrophorèse pour 35-40 min à 200 V.
    Remarque : Évitez toute exposition des échantillons de protéines à la lumière en effectuant tous les processus dans l’obscurité, afin de minimiser la photo-blanchiment de la sonde fluorescente.
  3. Utiliser un scanner de fluorescence pour l’imagerie de fluorescence. Enveloppez un gel de la protéine de l’électrophorèse et placez-le sur un scanner de fluorescence. Scannez le gel à l’aide d’un paramètre de longueur d’onde appropriée. Pour Cy5.5, sélectionnez le mode de Cy5 fourni dans le logiciel de numérisation.
  4. Souillez le gel avec une protéine commerciale réactif de coloration.

8. MALDI-TOF MS analyse par Digestion trypsique

  1. Incuber à 100 µL de GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL ou 80 µM) dans un tampon contenant 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (p/v) SDS purifiée et 25 mM TNT à 60 ° C pendant 1 h.
  2. Ajouter 1 µL d’iodoacétamide H2O (IAA, 4.0 M) (500 équivalent à GFP-E90DOPA) à la solution purifiée de GFP-E90DOPA (80 µM) dans le même tampon. Incuber le mélange à 25 ° C pendant 30 min avec protection contre la lumière.
  3. Digérer l’échantillon de GFP-E90DOPA en ajoutant la trypsine (rapport de protéase-à-substrat-protéine au 1/100 [w/o]) et incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 4 h.
  4. Purifier l’échantillon digéré peptide en utilisant une méthode standard de dessalement avec C18 colonnes à centrifuger.
  5. Analyser les peptides digérées par le protocole signalé pour laser assistée par matrice désorption-ionisation time-of-flight spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) à l’aide de l’acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) comme une matrice23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le système d’expression pour l’incorporation directe de DOPA biosynthétisée à partir d’un TPL est illustré à la Figure 1. Les gènes codant pour la paire aa-ARNt et aaRS évoluée sont placés dans un plasmide, et le gène de la GFP (GFP-E90TAG) contenant un codon ambre à la position 90 se trouve dans un autre plasmide pour évaluer l’incorporation de DOPA par fluorescence GFP. Le gène TPL est placé dans le même plasmide d’expression contenant le gène de la GFP et exprimé constitutivement afin de maximiser le rendement de la biosynthèse de la DOPA. Des conditions optimales pour la biosynthèse de DOPA en utilisant ce système d’expression, ont été projetées. Les milieux de culture utilisés pour cette expérience contenue 25 mM ammoniac et le pyruvate de 100 mM, avec des concentrations variables de catéchol (0 - 10 mM). La concentration de catéchol était critique pour la biosynthèse de la DOPA, tandis que les concentrations d’ammoniac et de pyruvate au-dessus de 25 mM et 100 mM, respectivement, n’a pas affecté la biosynthèse et l’incorporation de DOPA. La concentration optimale de catéchol était de 10 mM, et une concentration de plus de 10 mM diminue significativement la croissance de la cellule bactérienne due à sa cytotoxicité. Dans cette condition optimale, DOPA est biosynthétisée par TPL de ses matières premières et la biosynthétisée que dopa fut incorporée directement de GFP. Le mutant expresse GFP (GFP-E90DOPA) a été purifié et analysé par SDS-PAGE (Figure 2A). La GFP pleine longueur a été purifiée et l’incorporation de DOPA a été confirmée par analyse de MALDI-TOF MS (Figure 2B). La protéine a été digérée avec la trypsine, le fragment peptidique contenant DOPA a été analysé, et le résultat a montré l’intégration exclusive de DOPA avec aucun Tyr détectable ou autre incorporation de l’acide aminé naturel. L’efficacité de l’incorporation de DOPA biosynthétisée par TPL était similaire à l’efficacité de l’incorporation de 3 mM DOPA, qui est la concentration maximale de DOPA en raison de sa cytotoxicité19. Bien que catéchol 10 mM ont montré une toxicité modérée, la densité cellulaire après 16 h de temps de la culture était-de trois à quatre fois plus élevée qu’en présence de 3 mM DOPA. Le rendement de protéine purifiée par biosynthèse est trois fois supérieur à celui de l’expérience à l’aide de 3 mM DOPA (Figure 3).

Le mutant GFP contenant DOPA a été utilisé pour la conjugaison de protéine. DOPA peut être oxydée en dopaquinone-L par oxydants douces et la quinone électrophile réagit avec les alcynes tendues et nucléophiles, comme thiols et amines et peut être utilisée pour bioconjugaison (Figure 4). GFP-E90DOPA a été testé pour la cycloaddition SPOCQ par la réaction avec le sodium periodate, suivie d’un traitement avec Cy5.5-ONEMBOTEH22. Cette réaction de SPOCQ a été analysée par SDS-PAGE et fluorescence imaging (Figure 5A). La bande de fluorescence intense a été observée avec un traitement de sodium periodate et Cy5.5-ONEMBOTEH, alors qu’aucune bande de fluorescence a été montré dans les réactions de contrôle avec GFP-WT ou sans un sodium periodate traitement, confirmant l’efficacité et la spécificité de la réaction de conjugaison avec la DOPA génétiquement incorporé. En outre, la GFP DOPA-contenant a été utilisée pour oligomérisation de la protéine. L-dopaquinone réagit avec Lys ou Cys dans la même protéine, résultant en protéines oligomères. GFP-E90DOPA a été traité avec le periodate de sodium et l’oligomérisation a été réalisée pendant 48 h, et la réaction a été analysée par SDS-PAGE, en comparaison avec un échantillon témoin, sans un sodium periodate de traitement (Figure 5B). L’analyse a montré un motif d’oligomérisation clair avec bandes de protéines équidistants pour l’échantillon périodate-traités, tandis que l’échantillon de contrôle montrait la protéine intacte sans aucune autre bande.

Figure 1
Figure 1 : Direct incorporation de DOPA biosynthétisée à partir du catéchol, le pyruvate et l’ammoniac. DOPA est biosynthétisée par TPL façon hétérologue expresse de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac dans le milieu de croissance. La paire de tRNA/RAA évoluée pour DOPA est exprimée conjointement à intégrer la DOPA biosynthétisée à partir de la protéine cible, GFP. Le gène TPL a été placé sous un promoteur constitutif afin de commencer la biosynthèse DOPA avant d’induire l’expression de la GFP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyses de GFP-E90DOPA exprimée par le système conçu biosynthétique SDS-PAGE et MALDI-TOF MS. (A) GFP-E90DOPA a été exprimée par le système biosynthétique conçu en présence de catéchol 10 mM, 100 mM pyruvate et ammoniaque 25 mM et ensuite purifié par chromatographie d’affinité Ni-NTA. GFP-WT a été également analysée aux fins de comparaison. Les échantillons ont été séparés par Bis-Tris 4-12 % SDS-PAGE, et le gel a été coloré au bleu de Coomassie brillant bleu R-250. (B) analyse de MALDI-TOF MS du fragment peptidique contenant DOPA de la digestion trypsique de GFP-E90DOPA. Le fragment peptidique de la GFP-WT contenait les résidus 86-96 (SAMPEGYVQER). La Glu dans le fragment de la GFP-WT est remplacée par la DOPA dans le fragment peptidique de la GFP-E90DOPA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison d’une incorporation directe de biosynthétisée DOPA avec une constitution génétique générale de DOPA. Ces panneaux montrent GFP-E90DOPA exprimée par le système conçu de biosynthèse et la constitution génétique en présence de 3 mM DOPA sans pyruvate supplémentaire, l’ammoniac et le catéchol. (A) la protéine rendements proviennent de purifiée GFP-E90DOPA et (B) la densité des cellules ont été mesurée à 16 h après l’induction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Schéma réactionnel de la bioconjugaison de GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA est oxydé pour convertir DOPA en dopaquinone. La réaction de la protéine contenant du dopaquinone avec un alcyne tendue réalise le marquage de protéines spécifiques au site. L’incubation de la protéine dopaquinone contenant à une concentration élevée pendant une longue période (48 h) provoque la protéine conjugaison autonome produire des oligomères de protéine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Bioconjugaison de protéines mutantes contenant DOPA. (A) SPOCQ des réactions d’une protéine contenant du DOPA avec un alcyne tendue, ONEMBOTEH-Cy5.5. GFP-WT et GFP-E90DOPA ont été traités avec du sodium periodate et réagit avec ONEMBOTEH-Cy5.5 pendant 60 min. Les réactions ont été analysées par SDS-PAGE et teinté bleu de Coomassie (en haut) et image de fluorescence (en bas) sont affichées. (B) l’oligomérisation de GFP-E90DOPA. La GFP DOPA-contenant a été traitée avec du sodium periodate et incubées pendant 48 h. Le mélange réactionnel a été analysé par SDS-PAGE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans ce protocole, la biosynthèse et l’incorporation directe de DOPA sont décrites. La cellule bactérienne utilisée dans cette méthode peut synthétiser un acide aminé supplémentaire et utilisez-le comme un bloc de construction artificiel pour la synthèse des protéines. La constitution génétique des acides aminés non naturels a été une technologie clé pour le développement de l’organisme contre nature avec un code génétique élargi. Toutefois, cette méthode a été techniquement incomplète et est modifiée pour améliorer l’efficacité de l’incorporation et de minimiser les perturbations pour les systèmes de traduction endogène. Récemment, des avancées significatives dans la méthode ont été atteints en réassignant les codons24,25 pour les acides aminés non naturels et génie composantes orthogonales de translationnelle26,27,28 ,,29. Outre ces améliorations, le système décrit ici offre une autre fonctionnalité à un organisme contre nature avec un code génétique élargi : la biosynthèse d’un acide aminé naturel. Cette capacité donne le système artificiel plus d’indépendance comme un organisme avec un répertoire élargi de génétique. En outre, la DOPA présente une toxicité modérée sur la souche bactérienne utilisée dans cette méthode et à 3 mM DOPA, réduite de façon significative, la croissance cellulaire, qui a abouti à rendement faible en protéines. En utilisant le système de l’incorporation directe, toxicité a été réduite et rendement de protéine a triplé.

Le mutant aaRS utilisé pour la constitution génétique de DOPA est fidélité et efficacité modérée et intègre Tyr à de faibles concentrations de DOPA. 18 c’est pourquoi, la biosynthèse de DOPA dans des cellules bactériennes doit être suffisamment efficace pour empêcher la Constitution de Tyr. La biosynthèse DOPA par TPL de catéchol, ammoniac et pyruvate est une réaction réversible, et des concentrations élevées de produits de départ sont nécessaires pour une biosynthèse efficace. Cependant, catéchol ne peut servir plus de 10 mM parce qu’il est toxique pour la souche bactérienne utilisée dans le présent protocole. La concentration de TNT est également importante dans le présent protocole. DOPA montre sa toxicité lorsqu’il est transformé en L-dopaquinone et TNT est ajouté dans le milieu de croissance pour réduire le taux d’oxydation. Nous avons observé une diminution de la croissance cellulaire lorsque la concentration de TNT a été plus de 300 µM. Donc, pour une biosynthèse optimale et l’incorporation de DOPA, les composants (surtout le catéchol et le DTT) milieux de culture doivent être utilisés dans des concentrations appropriées tel que décrit dans le présent protocole.

Ce protocole décrit également des applications de DOPA-contenant des protéines pour la conjugaison de protéines spécifiques au site. L-dopaquinone généré par l’oxydation de DOPA efficacement réagit avec un alcyne tendu relié à une sonde biochimique. Cette réaction de cycloaddition est généralement plus rapide que les réactions d’addition nucléophile par amines ou thiols. Néanmoins, l’oxydation de DOPA devrait être effectuée en présence une protéine contenant DOPA et un alcyne tendu, pour réduire au minimum l’addition nucléophile par des nucléophiles dans la protéine. Par conséquent, l’ordre de l’addition des réactifs de cette réaction est essentiel.

De nombreux acides aminés non naturels sont disponibles pour la conjugaison de protéine, et certains d'entre eux atteindre une vitesse de réaction rapide et la conjugaison excellente efficacité30,31,32,33. Ces acides aminés contiennent des groupements fonctionnels établies telles que les azotures, alcynes, tendues alcènes ou alcynes et tétrazines. Bien qu’ils soient utiles pour la conjugaison de protéines spécifiques au site, beaucoup d'entre eux sont coûteuses ou commercialement inaccessibles, ce qui limite leurs applications, en particulier dans ceux qui ont besoin de protéines à grande échelle. Par conséquent, la biosynthèse de DOPA à partir des matières premières bon marchés et son incorporation directe vous sera utile pour les applications pharmaceutiques et industrielles nécessitant des protéines mutantes à grande échelle contenant une sonde biochimique ou un médicament (anticorps-médicament conjugué, ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le programme de recherche Global Frontier (FRO-2015M3A6A8065833), et le programme de recherche sciences fondamentales (2018R1A6A1A03024940) grâce à la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

Biochimie numéro 138 DOPA constitution génétique biosynthèse tyrosine phénol-lyase conjugaison de protéine cycloaddition contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ)
Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter