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Biochemistry

Incorporación genética de biosintetizada a partir de L-dopa (DOPA) y su aplicación a la conjugación de proteínas

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la incorporación genética de L-dopa biosintetizada a partir de materiales partidos simples y su aplicación a la conjugación de proteínas.

Abstract

L-dopa (DOPA) es un aminoácido encontrado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Debido a sus propiedades bioquímicas, el aminoácido tiene múltiples usos en aplicaciones bioquímicas. Este informe describe un protocolo para la incorporación genética de biosynthesized DOPA y su aplicación a la conjugación de proteínas. El DOPA es biosintetizada a partir de una tirosina fenol-liasa (TPL) de catecol, piruvato y amoníaco, y el aminoácido se incorpora directamente a las proteínas por el método de incorporación genética mediante un evolucionado aminoacil-tRNA y aminoacil-tRNA sintetasa par. Este sistema de incorporación directa incorpora eficientemente DOPA con poca incorporación de otros aminoácidos naturales y con mejor rendimiento de proteína que el sistema anterior de la incorporación genética de DOPA. Conjugación de proteínas con proteínas que contienen el DOPA es eficiente y site-specific y demuestra su utilidad para diversas aplicaciones. Este protocolo proporciona a los científicos de la proteína con los procedimientos detallados para la eficiente biosíntesis de proteínas del mutante que contiene DOPA en sitios deseados y su conjugación para aplicaciones industriales y farmacéuticas.

Introduction

DOPA es un aminoácido implicado en la biosíntesis de catecolaminas en animales y plantas. Este aminoácido es sintetizado de Tyr por tirosina hidroxilasa y oxígeno molecular (O2)1. Porque se DOPA es un precursor de la dopamina y puede penetrar la barrera hematoencefálica, se ha utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson2. DOPA también se encuentra en proteínas de la adherencia del mejillón (mapas), que son responsables de las propiedades adhesivas de los mejillones en condiciones mojadas3,4,5,6,7. Tyr se codifica inicialmente en las posiciones donde DOPA se encuentra en los mapas y luego se convierte en DOPA tyrosinases8,9. Debido a sus interesantes propiedades bioquímicas, la DOPA se ha utilizado en una variedad de aplicaciones. El grupo dihydroxyl de DOPA es químicamente propenso a la oxidación, y el aminoácido se convierte fácilmente en L-dopaquinona, un precursor de la melanina. Debido a su alta electrophilicity, L-dopaquinona y sus derivados se han utilizado para la reticulación y la conjugación con tioles y aminas10,11,12,13. 1, 2-quinonas también pueden funcionar como un dieno de reacciones de cicloadición y han utilizado para bioconjugation promovido de tensión controlada por oxidación cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadición14. Además, el grupo dihydroxyl puede quelar iones metálicos como el Fe3 + y Cu2 +, y las proteínas que contienen DOPA se han utilizado para el suministro de medicamentos e iones metálicos detección15,16.

DOPA ha sido genéticamente incorporado en las proteínas mediante una ortogonal Aminoacil-ARNt (aa-ARNt) y el aminoacil-tRNA sintetasa (aaRS) par17 y utiliza para proteína Conjugación y reticulación10,11, 12,13. En este informe, se describen los resultados experimentales y protocolos para la incorporación genética de DOPA biosintetizada a partir de materias primas baratas y sus aplicaciones a bioconjugation. El DOPA es biosynthesized usando una TPL y a partir de catecol, piruvato y amoníaco en Escherichia coli. Biosynthesized DOPA se incorpora directamente en proteínas expresando un par aa-tRNA y aaRS evolucionado para DOPA. Además, la proteína biosynthesized con DOPA site-specifically se conjuga con una sonda fluorescente y reticulado para producir oligomeros de proteína. Este Protocolo será útil para los científicos de la proteína, para sintetizar las proteínas mutantes con DOPA y conjugar las proteínas con sondas bioquímicas o drogas para aplicaciones industriales y farmacéuticas.

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Protocol

1. construcción de plásmido

  1. Construir un plásmido de expresión (pBAD-doble-TPL-GFP-WT) que expresa el gen de la TPL de Citrobacter freundii bajo el control de un promotor constitutivo y el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) con sus6-etiqueta bajo el control de la promotor de araBAD. PBAD-doble-TPL-GFP-E90TAG, sustituya el codón para el sitio (E90) de DOPA con un codón ámbar (etiqueta), utilizando un protocolo de mutagénesis sitio-dirigida. Los detalles para la construcción de este plásmido fue descrito en el informe anterior18.
  2. La construcción de un tRNA/aaRS-expresando plásmido (pEVOL-DHPRS2)18,19 para la incorporación genética de DOPA. pEVOL es un vector plásmido especial expresando dos copias de genes de aaRS con promotores independientes, y toda la información del plásmido se describe en un anterior informe19.
  3. Utilizar kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente para obtener alta pureza plásmido DNAs. Comprobar la pureza de los DNAs preparados mediante electroforesis en gel de agarosa, si es necesario.

2. cultura preparación

  1. Electroporación
    1. Uso electro-competente e. coli cepa de DH10β para este experimento. Añadir 1 μl de cada plásmido ADN (pEVOL DHPRS2 y pBAD-doble-TPL-GFP-E90TAG) a 20 μl de células competentes. Mezclar ligeramente para hacer una mezcla homogénea, utilizando una pipeta.
    2. Transferir la mezcla a las cubetas de electroporación. Colocar la cubeta en la cámara de electroporación. Empuje la cubeta hacia la cámara para hacer firme cubeta-cámara de contacto.
    3. Choque de la cubeta, usando 25 μF y 2,5 kV para cubetas de 0.1 cm.
    4. Añadir 1 mL de caldo super óptima precalentado (SOC), que contiene 2% (w/v) triptona, 0.5% (p/v) de levadura extracto, NaCl 10 mM, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl2y 20 mM de glucosa, a la cubeta y transferir las células a un tubo de cultivo. Rescatar a las células por la incubación por 1 h a 37 ° C con agitación.
    5. Extensión 10-100 μl de las células rescatadas en una placa de agar de lisogenia caldo (LB) que contiene 35 μg/mL cloranfenicol y ampicilina 100 de μg/mL. Incube las células a 37 ° C por 16 h.
  2. Preparación de la cultura de arrancador
    1. Inocular una colonia transformada solo en 5 mL de medio LB que contengan antibióticos. Incubar la colonia durante 12 h a 37 ° C con agitación.

3. expresión y purificación de GFP-E90DOPA por un sistema de biosíntesis

  1. Expresión de GFP-E90DOPA por un sistema de biosíntesis
    1. Transferencia de la cultura de arrancador (2 mL) en 100 mL de medio de PA-505220 (50 mM de Na2HPO4, 50 m m KH2PO4, 25 mM [NH4]2para4, 2 mM MgSO4, 0.1% [p/v] trazar metales, 0.5% [p/v] de glicerol, 0.05% [p/v] de glucosa y aminoácidos 5% [p/v] [pH 7.25]) que contiene 35 cloranfenicol μg/mL, 100 ampicilina μg/mL, 100 mM piruvato, catecol de 10 mM, amoníaco 25 mM y 300 μm dithiothreitol (DTT) seguido de una incubación a 30 ° C con agitación.
    2. Añadir 2 mL de 0.2% (w/v) L-arabinose cuando la densidad óptica (OD) a 550 nm alcanza 0.8. Incubar la muestra durante 12 h a 30 ° C con agitación.
    3. Desactivación de las células a 11.000 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y congelar el precipitado de células a-80 ° C.
  2. Lisis de la célula
    1. Descongelar el precipitado de células en el hielo y resuspender las células en 10 mL de tampón de lisis que contienen 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol de 10 mM y 300 mM de NaCl.
    2. Someter a ultrasonidos las células resuspendidas en hielo durante 10 minutos amplitud de sonicación de 80% de uso con un pulso de 25 s s 35 y en off.
    3. Desactivación de la célula lisada a 18.000 x g a 4 ° C por 15 min. traslado el sobrenadante a un tubo nuevo para la purificación y descartar el precipitado.
  3. Cromatografía de afinidad ni-NTA
    1. Añadir resina (ácido nitrilotriacético) de Ni-NTA (300 μL de suspensión de la resina para una cultura de 100 mL) en el sobrenadante y las proteínas se unen a la resina de Ni-NTA a 4 ° C agitando suavemente la suspensión durante 1 hora.
    2. Transferir la suspensión a una columna de polipropileno y resina 3 x con 5 mL de tampón de lavado que contiene 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol de 20 mM y 300 mM de NaCl.
    3. Eluir las proteínas 3 x con 300 μL de tampón de elución que contiene 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol de 250 mM y 300 mM de NaCl.
    4. Determinar la concentración de proteína mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. El coeficiente de extinción (24.630 M-1cm-1) para la GFP-E90DOPA a 280 nm se calculó mediante una calculadora de coeficiente de extinción de la proteína (e.g., https://web.expasy.org/protparam/) y la extinción independientemente medida coefficiennt (2630 M-1cm-1) para DOPA. Como método alternativo, utilizar la proteína de Bradford ensayo21 para una determinación de la concentración de proteína.

4. Oligomerización de GFP-E90DOPA purificado

  1. Añadir 1 μl de sodio periodato en H2O (6 mM) (1,0 equiv a GFP-E90DOPA) a una solución de 20 μl de GFP-E90DOPA (300 μm) en un tampón fosfato que contiene 50 mM de Na2HPO4 (pH 8.0) y 300 mM de NaCl.
  2. Permita que la reacción de Oligomerización proceder a 25 ° C durante 48 h.
  3. Analizar la mezcla de reacción por electroforesis dodecyl del gel del sulfato-poliacrilamida del sodio) (SDS-PAGE) como se describe en el paso 6.

5. la conjugación de GFP-E90DOPA con una sonda de alquino por SPOCQ

  1. Añadir 1 μl de azadibenzocyclooctyne Cy5.5-ligado (Cy5.5 ADIBO)22 en H2O (4,0 mM) (10 equiv a GFP-E90DOPA) a una solución de 20 μl de GFP-E90DOPA (20 μm) en un tampón fosfato que contiene 50 mM de Na2HPO4 (pH 8.0) y 300 mM de NaCl.
  2. Añadir 1 μl de sodio periodato en H2O (400 μm) (1,0 equiv a GFP-E90DOPA) a la mezcla de reacción.
  3. Permita que la reacción de SPOCQ proceder a 25 ° C durante 1 hora. Si se utiliza una sonda sensible a la luz, cubra el recipiente de la reacción con papel de aluminio.

6. purificación de la GFP marcado

  1. Diluir la mezcla de reacción de SPOCQ mediante la adición de un tampón de fosfato, que contiene 50 mM de Na2HPO4 (pH 8.0) y 300 mM de NaCl, hasta 500 μl.
  2. Transferencia de la solución diluida a una columna de spin filtro centrífugo. Centrifugar la columna vuelta a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min y descartar el flujo a través. Repita este paso x 3 para quitar cualquier exceso Cy5.5-ADIBO.
  3. Transferir la muestra purificada de la columna de spin a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Por otra parte, llevar a cabo una purificación por diálisis contra el mismo buffer.
  5. Tienda la GFP purificada a 4 ° C.

7. fluorescencia y análisis SDS-PAGE Gel análisis

  1. Preparar muestras de proteínas para análisis de SDS-PAGE al añadir 5 μl de tampón de proteínas (véase Tabla de materiales) y 2 μl de la TDT (1.00 M) a 13 μl de purificado, o crudo, GFP (13,6 μm o 0,38 mg/mL). Para un análisis de los GFP, use una concentración más alta de GFP (67,8 μm o 1,9 mg/mL). Desnaturalizar las proteínas por incubar a 95 ° C durante 10 minutos.
  2. Coloque un cassette de 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel (gel comprado, premade cassettes) a la célula de electroforesis y añadir un buffer de corriente (véase Tabla de materiales). Cargar las muestras de proteína y un marcador de peso molecular. Correr la electroforesis durante 35-40 min a 200 V.
    Nota: Evite cualquier exposición de las muestras de proteínas a la luz llevando a cabo todos los procesos en la oscuridad, para minimizar la foto-blanqueo de la sonda fluorescente.
  3. Utilizar un escáner de fluorescencia para imágenes de fluorescencia. Envuelva un gel de electroforesis de proteína y coloque en un escáner de fluorescencia. Escanear el gel con un valor de longitud de onda adecuada. Para Cy5.5, selecciona el modo de Cy5 en el software del escáner.
  4. Teñir el gel con una proteína comercial reactivo de tinción.

8. uso de MALDI-TOF MS análisis por digestión de la tripsina

  1. Incubar 100 μl de purificada GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL o 80 μm) en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0.1% (p/v) de SDS y TDT de 25 mM a 60 º C durante 1 hora.
  2. Añadir 1 μl de Yodoacetamida en H2O (IAA, 4.0 M) (500 equiv a GFP-E90DOPA) a la solución purificada de GFP-E90DOPA (80 μm) en el mismo buffer. Incubar la mezcla a 25 ° C por 30 min con la protección de la luz.
  3. Digerir la muestra de GFP-E90DOPA mediante la adición de tripsina (1: 100 proteasa-a-sustrato-relación [w/w]) e incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 4 horas.
  4. Purificar la muestra digerida péptido mediante un método estándar de desalación con columnas de vuelta C18 .
  5. Análisis de los péptidos digeridos por el protocolo reportado por láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) utilizando ácido de alfa-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) como una matriz de23.

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Representative Results

El sistema de expresión para la incorporación directa de DOPA biosintetizada a partir de una TPL se muestra en la figura 1. Los genes para el par de aa-tRNA y aaRS evolucionado se colocan en un plásmido y el gen de la GFP (GFP-E90TAG) que contiene un codón ámbar en la posición 90 se encuentra en otro plásmido para evaluar la incorporación de la DOPA por la fluorescencia de GFP. El gen de la TPL se coloca en el mismo plásmido de expresión que contiene el gen de la GFP y expresa constitutivamente para maximizar el rendimiento de la biosíntesis DOPA. Mediante este sistema de expresión, se revisaron las condiciones óptimas para la biosíntesis de la DOPA. El medio de crecimiento utilizado para este experimento contenida 25 mM amoníaco y piruvato de 100 mM, con diferentes concentraciones de catecol (0 - 10 mM). La concentración de catecol fue fundamental para la biosíntesis DOPA, mientras que las concentraciones de amoníaco y piruvato más de 25 mM y 100 mM, respectivamente, no afectó la biosíntesis y la incorporación de DOPA. La óptima concentración de catecol era 10 mM, y una concentración de más de 10 mM disminuyó significativamente el crecimiento de la célula bacteriana debido a su citotoxicidad. En esta condición óptima, DOPA fue biosynthesized por TPL de sus materias primas y la biosynthesized que dopa se incorporó directamente a GFP. El mutante expresado GFP (GFP-E90DOPA) fue purificado y analizado por SDS-PAGE (figura 2A). Se purificó la GFP de larga duración, y la incorporación de DOPA fue confirmada por análisis por MALDI-TOF MS (figura 2B). La proteína fue digerida con tripsina, se analizó el fragmento del péptido que contiene DOPA y el resultado mostró la incorporación exclusiva de DOPA con no detectable Tyr o incorporación de otro aminoácido natural. La eficacia de la incorporación de DOPA biosynthesized por TPL fue similar a la eficacia de incorporación con 3 mM DOPA, que es la máxima concentración de DOPA debido a su citotoxicidad19. Aunque catecol 10 mM mostraron toxicidad moderada, la densidad celular después de 16 h de tiempo de la cultura fue-de tres a cuatro veces mayor que en presencia de 3 m m DOPA. El rendimiento de proteína purificada por la biosíntesis fue tres veces mayor que el del experimento usando 3 mM DOPA (figura 3).

Los mutantes GFP con DOPA se utilizó para la conjugación de proteínas. DOPA puede ser oxidado en L-dopaquinona por oxidantes suaves, y la quinona electrofílico reacciona con alquinos filtradas y nucleófilos, como aminas, tioles y puede ser utilizado para bioconjugation (figura 4). GFP-E90DOPA ha sido probada la cicloadición SPOCQ por reacción con sodio periodato, seguido de un tratamiento con Cy5.5 ADIBO22. Esta reacción SPOCQ fue analizada por SDS-PAGE y fluorescencia (figura 5A) la proyección de imagen. La banda de fluorescencia intensa se observó con un tratamiento de sodio periodato y Cy5.5-ADIBO, mientras que ninguna banda de fluorescencia fue demostrada en reacciones de control con GFP-WT o sin sodio periodato tratamiento, confirmando la eficacia y la especificidad de la reacción de conjugación con la DOPA genéticamente incorporado. Además, la GFP que contiene la DOPA se utilizó para la Oligomerización de proteínas. L-dopaquinona reacciona con Lys o Cys en la misma proteína, resultando en proteínas oligoméricas. GFP-E90DOPA fue tratado con periodato de sodio y la Oligomerización se llevó a cabo durante 48 h, y la reacción fue analizada por SDS-PAGE en comparación con una muestra control sin sodio periodato de tratamiento (figura 5B). El análisis mostró un patrón de Oligomerización claro con bandas de proteínas equidistantes para la muestra tratada con periodate, mientras que la muestra de control demostró la proteína intacta sin otras bandas.

Figure 1
Figura 1 : Directa incorporación de DOPA biosynthesized de catecol, piruvato y amoníaco. El DOPA es biosynthesized por TPL heterologously expresada de catecol, piruvato y amoniaco en el medio de crecimiento. El par de tRNA/aaRS evolucionado para DOPA es co expresado biosynthesized DOPA incorporar la proteína diana, GFP. El gen de la TPL fue colocado bajo un promotor constitutivo para la biosíntesis DOPA antes de inducir la expresión de GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análisis de SDS-PAGE y MALDI-TOF MS de GFP-E90DOPA expresada por el sistema diseñado biosintético. GFP-E90DOPA (A) fue expresada por el sistema diseñado biosintético en presencia de catecol de 10 mM, 100 mM piruvato y amoníaco 25 mM y luego purificada mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. También se analizó la GFP-WT para la comparación. Las muestras se separaron por SDS-PAGE de Bis-Tris 4% - 12%, y el gel fue teñido con azul brillante de Coomassie R-250. (B) análisis de MALDI-TOF MS del fragmento del péptido que contiene DOPA de la digestión tríptica de GFP-E90DOPA. En el fragmento del péptido de GFP-WT contiene los residuos de 86-96 (SAMPEGYVQER). El Glu en el fragmento de GFP-WT se sustituye por DOPA en el fragmento del péptido de GFP-E90DOPA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Comparación de una incorporación directa de biosynthesized DOPA con una incorporación genética general de DOPA. Estos paneles muestran GFP-E90DOPA expresada por el sistema diseñado de la biosíntesis y la incorporación genética en la presencia de 3 m m DOPA sin adicional piruvato, amoníaco y catecol. (A) la proteína se obtuvieron rendimientos de purificada GFP-E90DOPA y (B) las densidades de célula fueron medidas a las 16 h después de la inducción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de reacción del bioconjugation de GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA se oxida para convertir DOPA a dopaquinona. La reacción de la proteína que contiene la dopaquinona con un alquino filtrada alcanza proteína específica de etiquetado. La incubación de la proteína que contiene la dopaquinona en alta concentración durante mucho tiempo (48 h) causa verbal la proteína producir oligomeros de proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Bioconjugation de proteínas del mutante que contiene DOPA. (A) SPOCQ reacciones de una proteína que contiene la DOPA con un alquino filtrada, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT y GFP-E90DOPA fueron tratados con sodio periodato y reaccionó con ADIBO Cy5.5 de 60 minutos. Las reacciones fueron analizadas por SDS-PAGE y tinción de Coomassie (arriba) y se muestran imágenes de fluorescencia (abajo). (B) Oligomerización de GFP-E90DOPA. La GFP que contiene DOPA fue tratado con sodio periodato y se incubaron durante 48 h. La mezcla de reacción se analizó por SDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este protocolo, se describen la biosíntesis y la incorporación directa de DOPA. La célula bacteriana utilizada en este método puede sintetizar un aminoácido adicional y utilizarlo como un bloque de construcción natural para la síntesis de proteínas. La incorporación genética de aminoácidos no naturales ha sido una tecnología clave para el desarrollo del organismo artificial con un código genético expandido. Sin embargo, este método ha sido técnicamente incompleta y se está modificando para mejorar la eficiencia de incorporación y minimizar las perturbaciones a los sistemas de traducción endógeno. Recientemente, se han logrado avances significativos en el método por reasignación de codones24,25 aminoácidos no naturales y componentes ortogonales de traslación ingeniería26,27,28 ,29. Además de estas mejoras, el sistema aquí descrito ofrece capacidad de otro para un organismo artificial con un código genético expandido: biosíntesis del aminoácido natural. Esta capacidad da el sistema artificial más independencia como un organismo con un repertorio genético expandido. Además, DOPA muestra toxicidad moderada en la cepa bacteriana utilizada en este método y en 3 mM DOPA, crecimiento de las células se redujo significativamente, que resultó en el rendimiento baja en proteínas. Mediante el sistema de incorporación directa, toxicidad fue reducida y rendimiento de proteína se incrementó tres veces.

El mutante de aaRS utilizado para la incorporación genética de DOPA tiene moderada eficacia y fidelidad e incorpora a Tyr en una baja concentración de DOPA. 18 por tanto, la biosíntesis de DOPA en células bacterianas debe ser lo suficientemente eficiente como para evitar la incorporación de Tyr. La biosíntesis de la DOPA por TPL de catecol, el amoníaco y el piruvato es una reacción reversible, y altas concentraciones de las materias primas son necesarias para una eficiente biosíntesis. Sin embargo, catecol no puede utilizarse más de 10 mM ya que es tóxico para la cepa bacteriana utilizada en el presente Protocolo. La concentración de la TDT también es importante en el presente Protocolo. DOPA muestra su toxicidad cuando se convierte en L-dopaquinona, y TDT se agrega en medio del crecimiento para reducir la tasa de oxidación. Se observó una disminución en el crecimiento de la célula cuando la concentración de la TDT era más de 300 μm. Por lo tanto, para una biosíntesis óptima y la incorporación de DOPA, los componentes (catecol y TDT) para medio de cultivo deben ser usados en concentraciones adecuadas como se describe en este protocolo.

Este protocolo también describe aplicaciones de proteínas que contiene la DOPA para Conjugación proteína específica. L-dopaquinona generado por la oxidación de DOPA eficientemente reacciona con un alquino filtrada vinculado con una sonda de bioquímica. Esta reacción de cicloadición es generalmente más rápida que las reacciones de adición nucleófila de aminas o tioles. Sin embargo, la oxidación de DOPA debe llevarse a cabo en presencia de una proteína que contiene la DOPA y un alquino filtrada, para reducir al mínimo la adición nucleófila por nucleófilos en la proteína. Por lo tanto, el orden de la adición de los reactivos para esta reacción es fundamental.

Muchos aminoácidos no naturales están disponibles para la conjugación de proteínas, y algunos de ellos lograr una tasa de reacción rápida y verbal excelente eficiencia30,31,32,33. Estos aminoácidos contienen grupos funcionales de biorthogonal como azidas, alquinos, alquenos filtradas o alquinos y tetrazines. Aunque son útiles para Conjugación proteína específica, muchos de ellos son caros o comercialmente inaccesible, que limita sus aplicaciones, especialmente en aquellos que requieren proteínas a gran escala. Por lo tanto, la biosíntesis de DOPA de materias primas baratas y su incorporación directa será útil para aplicaciones industriales y farmacéuticas a gran escala proteínas del mutante que contiene una sonda bioquímica o un medicamento (droga de anticuerpo conjugado, ADC).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el programa Global de investigación de frontera (NRF-2015M3A6A8065833), y la ciencia investigación programa básico (2018R1A6A1A03024940) a través de la Fundación de investigación nacional de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

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References

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Bioquímica número 138 DOPA constitución genética biosíntesis tirosina fenol-liasa verbal de proteína cicloadición promovido de tensión controlada por oxidación cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ)
Incorporación genética de biosintetizada a partir de L-dopa (DOPA) y su aplicación a la conjugación de proteínas
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Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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