Summary
여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.
Abstract
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에는 아미노산 이다. 그것의 특정 생 화 확 적인 특성 때문에 아미노산 생화학 응용 프로그램에서 여러 사용 하고있다. 이 보고서 biosynthesized DOPA의 유전자 결합에 대 한 프로토콜 및 단백질 활용의 응용에 설명합니다. DOPA는 티로신 페 놀-lyase (TPL) catechol, pyruvate, 암모니아에서 의해 biosynthesized 이며 아미노산 진화 aminoacyl-tRNA와 aminoacyl-tRNA 합성 쌍을 사용 하 여 유전 결합 방법으로 단백질에 직접 통합 됩니다. 이 직접 설립 시스템 DOPA에 대 한 이전 유전 법인 시스템 보다 더 나은 단백질 수확량과 다른 천연 아미노산의 작은 합동 DOPA을 효율적으로 통합. DOPA 포함 된 단백질 단백질 활용 효율적이 고 사이트 이며 다양 한 응용 프로그램에 대 한 그것의 유용성을 보여줍니다. 이 프로토콜 단백질 과학자를 DOPA 원하는 사이트와 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 그들의 활용을 포함 하는 돌연변이 단백질의 효율적 생 합성에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다.
Introduction
DOPA는 catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에 관련 된 아미노산 이다. 이 아미노산 티로신 hydroxylase 및 분자 산소 (O2)1에 의해 티 르에서 합성 됩니다. DOPA 도파민의 선구자 이며, 혈액-뇌 장벽 침투 수, 때문에 그것은2파 킨 슨 병 치료에 사용 되었습니다. DOPA 홍합 접착 단백질 (지도), 젖은 조건3,,45,,67에 홍합의 접착 속성에 대 한 책임은에 발견 된다. Tyr는 처음 DOPA 지도에서 발견 되는 tyrosinases8,9DOPA로 변환 됩니다 위치에 인코딩됩니다. 그것의 재미 있는 생 화 확 적인 특성 때문에 DOPA 다양 한 응용 프로그램에에서 사용 되었습니다. DOPA의 dihydroxyl 그룹은 화학적으로 산화, 경향이 그리고 아미노산 L-dopaquinone, melanins의 선구자로 쉽게 변환 됩니다. 그것의 높은 electrophilicity 때문에 L-dopaquinone와 그 파생 상품 가교 및 thiols 및 아민10,11,,1213와 활용에 대 한 사용 되었습니다. 1, 2-퀴 논 디 엔 cycloaddition 반응에 대 한 기능을 할 수 하 고 스트레인 승진 산화 제어 cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14bioconjugation에 대 한 사용 되었습니다. 또한, dihydroxyl 그룹 Fe3 + 와 Cu2 +같은 금속 이온을 킬레이트 수 고 DOPA를 포함 하는 단백질 약물 전달 및15,16을 감지 하는 금속 이온에 대 한 이용 되었습니다.
DOPA 유전자 단백질에는 직교 aminoacyl-tRNA (금주 모임-tRNA)와 aminoacyl-tRNA 합성 (aaRS) 쌍17 을 사용 하 여 통합 되었으며 사용 단백질 활용 및 가교10,11, 12,13. 이 보고서에서 실험 결과 프로토콜 DOPA biosynthesized 저렴 한 원자재와 bioconjugation 응용 프로그램에서의 유전 결합을 설명 합니다. DOPA biosynthesized TPL을 사용 하 고 catechol, pyruvate, 및 대장균에서 암모니아에서 출발 이다. DOPA biosynthesized DOPA에 대 한 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍으로 표현 하 여 단백질에 직접 통합 됩니다. 또한, 포함 된 DOPA biosynthesized 단백질 site-specifically 형광 프로브와 단백질 올리고 생산 가교 된 활용 된. 이 프로토콜와 단백질 생화학 프로브 또는 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 약물을 켤레 biosynthesize 돌연변이 단백질 DOPA 포함 된 단백질 과학자에 대 한 유용할 것입니다.
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Protocol
1. 플라스 미드 건설
- 제정 발기인의 통제 Citrobacter freundii 에서 TPL 유전자와는 그의 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 표현 하는 식 플라스 미드 (pBAD-듀얼-TPL-GFP-WT) 생성6-태그의 통제는 araBAD 발기인입니다. PBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG, (E90) 사이트에 대 한 codon의 사이트 지시 된 mutagenesis 프로토콜을 사용 하 여 호박 codon (태그)와 DOPA 교체 합니다. 이 플라스 미드의 건설에 대 한 자세한 내용은 우리의 이전 보고서18에서 설명 했다.
- TRNA/aaRS 표현 플라스 미드 (pEVOL-DHPRS2)18,19 DOPA의 유전자 결합에 대 한 생성 합니다. pEVOL 독립적인 발기인 aaRS 유전자의 두 복사본을 표현 하는 특별 한 플라스 미드 벡터 이며, 플라스 미드의 자세한 정보는 이전 보고서19에서 설명 합니다.
- 고 순도 플라스 미드 DNAs를 상업적으로 사용할 수 있는 플라스 미드 준비 키트를 사용 합니다. 필요한 경우에 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 준비한 DNAs의 순도 확인 합니다.
2. 문화 준비
-
Electroporation
- 이 실험에 대 한 사용 전기 유능한 대장균 DH10β 스트레인. 유능한 세포의 20 µ L를 각 플라스 미드 DNA (pEVOL-DHPRS2와 pBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG)의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 만들기 위해 그들을 피 펫을 사용 하 여 균질 혼합 믹스.
- Electroporation 큐 벳에 혼합물을 전송. 장소 electroporation 약 실에 있는 베트입니다. 회사 베트-챔버 수 있도록 챔버에는 베트를 밀어 문의.
- 멧, 25 µ F를 사용 하 여 충격 및 2.5 kV 0.1 cm 큐 벳을 위해.
- 1 mL prewarmed 슈퍼 최적의 국물 (SOC)의 2% (w/v) tryptone 포함 된 추가, 0.5% (w/v) 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl2, 및 베트에 20 mM 포도 당을 효 모 문화 관에는 셀을 전송. 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 대 한 그들을 배양 하 여 세포를 구출.
- 10-100 µ L 35 µ g/mL 페니와 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된 lysogeny 국물 (파운드) 한 접시에 구조 세포의 확산. 16 h 37 ° C에서 세포를 품 어.
-
초보 문화 준비
- 단일 변환 된 식민지 파운드 매체 포함 된 항생제의 5 mL에 접종 떨고와 37 ℃에서 12 h에 대 한 식민지를 품 어.
3. 표현과 GFP-E90DOPA 생 합성 시스템의 정화
-
GFP E90DOPA 생 합성 시스템에 의해 표현
- PA-5052 중간20 (50 m m 나2HPO4, 50 m m KH2포4, 25 mM [NH4]24, 2mm MgSO4, 0.1% [w/v] 추적 금속, 0.5% [w/v] 글리세롤, 그래서 100 mL를 선발 문화 (2 mL)를 전송 0.05% [w/v] 포도 당, 및 5% [w/v] 아미노산 [pH 7.25]) 떨고와 30 ° C에 외피 다음 35 µ g/mL 페니, 100 µ g/mL 암 피 실린, 100 mM pyruvate, 10 m m catechol, 25 mM 암모니아, 그리고 300 µ M dithiothreitol (DTT).
- 때 0.2% (w/v) L arabinose의 2 개 mL를 추가 550 nm에 도달 0.8에서 광학 밀도 (OD). 떨고와 30 ° C에 12 h에 대 한 샘플을 품 어.
- 5 분 11000 x g에서 셀 아래로 회전, 상쾌한, 삭제 시키고-80 ° c.에 셀 펠 릿을 동결
-
세포 세포의 용 해
- 얼음에 셀 펠 릿을 녹여 및 50 mM NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 셀 resuspend 10 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
- 25의 10 분 사용 80% 쥡니다 진폭 펄스에 대 한 얼음에 resuspended 셀 sonicate s 오프 및 35 s.
- 15 분 이전에 상쾌한 정화에 대 한 신선한 튜브 4 ° C에서 18000 x g에서 lysate 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 펠 릿을 삭제.
-
Ni NTA 친화성 크로마토그래피
- 상쾌한에 Ni NTA (nitrilotriacetic 산) 수 지 (100 mL 문화에 대 한 수 지 서 스 펜 션의 300 µ L)를 추가 하 고 부드럽게 흔들어 1 시간에 대 한 서 스 펜 션으로 단백질을 4 ° C에서 Ni NTA 수 지에 바인딩할.
- 폴 리 프로필 렌의 열 정지를 전송 하 고 3 수 지 세척 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 워시 버퍼의 5 mL x 20 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
- 3 단백질을 elute 50mm NaH2포4 (pH 8.0)를 포함 하는 차입 버퍼의 300 µ L x 250 m m 이미, 및 300 mM NaCl.
- 280에서 흡 광도 측정 하 여 단백질 농도 결정 nm. 280에서 GFP-E90DOPA에 대 한 소멸 계수 (24,630 M-1c m-1) nm 단백질 소멸 계수 계산기를 (예, https://web.expasy.org/protparam/)와 독립적으로 측정 된 멸종에 의해 산출 되었다 coefficiennt (2630 M-1c m-1) DOPA 대체 방법으로 단백질 농도의 결심을 위한 Bradford 단백질 분석 결과21 을 사용 합니다.
4입니다. 순화 GFP-E90DOPA oligomerization
- 나트륨의 1 µ L H2O (6 m m) periodate 추가 (1.0 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (300 μ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에 300 mm NaCl.
- 48 h 25 ° C에서 진행 oligomerization 반응을 수 있습니다.
- 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 반응 혼합물 분석) (SDS 페이지) 6 단계에 설명 된 대로.
5. SPOCQ에 의해 Alkyne 프로브 GFP-E90DOPA의 활용
- Cy5.5 연결 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 m m) 1 µ L을 추가 (10 equiv. GFP E90DOPA를) GFP E90DOPA의 20 µ L의 솔루션 (20 µ M) 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼에서 300 mm NaCl.
- 나트륨의 1 µ L H2O periodate 추가 (400 µ M) (1.0 equiv. GFP E90DOPA에) 반응 혼합물에.
- 1 시간에 25 ° C에서 진행 SPOCQ 반응을 수 있습니다. 빛에 민감한 프로브를 사용 하는 알루미늄 호 일로 반응 배를 커버.
6입니다. 레이블이 GFP의 정화
- 50mm 나2HPO4 (pH 8.0)를 포함 하는 인산 염 버퍼를 추가 하 여 SPOCQ 반응 혼합물을 희석 및 300 mM NaCl, 최대 500 µ L.
- 원심 필터 스핀 열 희석된 솔루션을 전송 합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 스핀 열 원심 그리고 흐름을 통해 삭제. 어떤 초과 Cy5.5 ADIBO를 제거 하려면이 단계 3를 반복 합니다.
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스핀 열에서 정화 샘플을 전송.
- 또는, 동일한 버퍼에 대 한 투 석으로는 정화 실시 합니다.
- 4 ° c.에 순화 된 GFP를 저장
7. SDS 페이지 분석 및 형광 젤 검색
- 5 µ L의 단백질 견본 버퍼를 추가 하 여 SDS 페이지 분석 단백질 견본 준비 ( 재료의 표참조)와 2 µ L DTT (1.00 M)의 정화, 또는 원유, 13 µ L 표시 GFP (13.6 µ M 또는 0.38 mg/mL). Oligomeric GFP의 분석, GFP (67.8 µ M 또는 1.9 mg/mL)의 높은 농도 사용 하 여. 10 분 동안 95 ° C에서 배양 하 여 단백질을 변성.
- 전기 이동 법 셀 4%-12% 두번째-트리 스 SDS 페이지 젤 카세트 (구입, premade 젤 카세트)를 배치 하 고 실행 중인 버퍼 추가 ( 재료의 표참조). 단백질 견본 및 분자량 마커를 로드 합니다. 200 V에서 35-40 분 동안 전기 이동 법을 실행 합니다.
참고: 단백질 샘플 사진 표백 형광 프로브의 최소화 하기 위해 어둠 속에서 모든 프로세스를 수행 하 여 빛의 어떤 노출을 피하십시오. - 형광 스캐너를 사용 하 여 형광 이미징에 대 한. 단백질 젤 전기 이동 법에서 랩 하 고 형광 스캐너에 놓습니다. 적절 한 파장 설정을 사용 하 여 젤을 스캔. Cy5.5, 스캐너 소프트웨어에 제공 Cy5 모드를 선택 합니다.
- 상업적인 단백질 염색 시 약으로 젤을 얼룩.
8. MALDI TOF MS 분석 트립 신 소화
- 순화 된 GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL 또는 80 µ M) (w/v) SDS, 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 0.1%를 포함 하는 버퍼에 및 1 시간에 60 ° C에서 25 mM DTT의 100 µ L를 품 어.
- Iodoacetamide H2O (IAA, 4.0 M)의 1 µ L 추가 (500 equiv. GFP E90DOPA에) 동일한 버퍼에 순화 된 GFP E90DOPA 솔루션 (80 µ M). 빛 으로부터 보호 30 분 동안 25 ° C에 혼합물을 품 어.
- 트립 신 (1: 100 효소-기질 단백질 비율 [w/w])을 추가 하 여 GFP E90DOPA 샘플을 소화 하 고 4 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.
- C18 스핀 열 표준 염 메서드를 사용 하 여 소화 펩 티 드 샘플을 정화.
- 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 질량 분석 (MALDI TOF MS) 매트릭스23으로 알파-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA)를 사용 하 여에 대 한 보고 된 프로토콜에 의해 소화 펩 티 드를 분석 합니다.
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Representative Results
TPL에서 DOPA biosynthesized의 직접 통합 식 시스템은 그림 1에 표시 됩니다. 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍에 대 한 유전자를 플라스 미드에 배치 됩니다 위치 90에서 호박 codon를 포함 하는 GFP 유전자 (GFP-E90TAG) GFP 형광에 의해 DOPA의 평가에 다른 플라스 미드에 위치 하 고. TPL 유전자는 GFP 유전자를 포함 하는 동일한 식 플라스 미드에 배치 하 고 constitutively DOPA 생 합성의 수익률을 극대화 하기 위해 표현. 이 식 시스템을 사용 하 여, DOPA 생 합성에 대 한 최적의 조건은 상영 했다. 이 실험 포함 된 25mm 암모니아 및 100 mM pyruvate, catechol (0-10 m m)의 다양 한 농도와 사용 되는 성장 매체. Catechol 집중 했다 암모니아 그리고 pyruvate 농도 이상 25 m m와 100 m m, 동안 DOPA 생 합성에 대 한 중요 한 각각 미치지 않았다 생 합성 및 DOPA의 설립. Catechol의 최적 농도 10 m m, 그리고 이상의 10 m m의 농도 크게 그것의 세포 독성 때문에 세균성 세포 성장을 감소. 이 최적의 조건에서 DOPA 되었고 그 시작 소재로 TPL에 의해 biosynthesized biosynthesized DOPA 직접 GFP에 통합 되었다. 표현된 돌연변이 GFP (GFP-E90DOPA) 정화 되었고 SDS 페이지 (그림 2A)에 의해 분석. 전체 길이 GFP 정화 했다, 그리고 DOPA 법인 MALDI TOF MS 분석 (그림 2B)에 의해 확인 되었다. 단백질은 트립 신을 소화 했다, 펩 티 드 조각 DOPA를 포함 분석, 그리고 결과 DOPA 아니 감지 Tyr와의 독점 설립 또는 다른 천연 아미노산 관을 보여주었다. TPL에 의해 DOPA biosynthesized의 관 효율 3 m DOPA DOPA의 최대 농도 세포 독성19때문에 관 효율 유사 했다. 10 m m catechol 보였다 온건한 독성, 비록 문화 시간 16 h 후 셀 밀도가 했다 3-사중 3mm DOPA 존재 보다 높은. 생 합성으로 순화 된 단백질 수율 보다 3mm DOPA (그림 3)를 사용 하 여 실험에서 삼 배 높았다.
DOPA 포함 된 GFP 단백질 활용을 위해 사용 되었다 돌연변이. DOPA 온화한 산화 제에 의해 L-dopaquinone로 산화 수 그리고 electrophilic quinone 긴장된 alkynes와 thiols 등 아민, nucleophiles 반응 bioconjugation (그림 4)에 사용할 수 있습니다. GFP-E90DOPA 나트륨과 반응 하 여 SPOCQ cycloaddition에 대 한 테스트 되었습니다 periodate, Cy5.5 ADIBO22와 치료. 이 SPOCQ 반응 SDS 페이지와 형광 이미징(그림 5)에 의해 분석 되었다. 강렬한 형광 밴드 관찰 되었다 나트륨의 치료와 함께 periodate Cy5.5-ADIBO, 형광 밴드 없음 제어 반응 GFP WT와 함께 또는 없이 나트륨에에서 표시 되었다 periodate 처리, 효율성과 특이성의 확인은 유전자 법인된 DOPA와 활용 반응입니다. 또한, DOPA 포함 된 GFP 단백질 oligomerization 위해 사용 되었다. L-dopaquinone 반응 리스 또는 Cys 같은 단백질 oligomeric 단백질에서 발생 합니다. GFP-E90DOPA로 대우 되었다 나트륨 periodate는 oligomerization 48 h에 대 한 실시 및 반응 분석 SDS 페이지 컨트롤 샘플에 비해는 나트륨 periodate 치료 (그림 5B) 없이. 분석은 컨트롤 샘플 보여 다른 밴드 없이 그대로 단백질 동안 동등 하 게 간격 둔된 단백질 밴드 periodate 처리 샘플에 대 한 명확한 oligomerization 패턴을 보였다.
그림 1 : DOPA biosynthesized catechol, pyruvate, 및 암모니아의 직접. DOPA는 catechol, pyruvate, 그리고 성장 매체에서 암모니아에서 heterologously 표현된 TPL에 의해 biosynthesized 이다. DOPA에 대 한 진화 tRNA/aaRS 쌍은 공동 대상 단백질, GFP로 biosynthesized DOPA를 통합 하는 표현 이다. TPL 유전자는 GFP 식 유도 하기 전에 DOPA 생 합성을 시작 하기 위해 제정 발기인에서 배치 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : GFP E90DOPA 생 합성 시스템 설계에 의해 표현의 SDS 페이지 및 TOF MALDI MS 분석. (A) GFP-E90DOPA 10 m m catechol, 100 mM pyruvate, 및 25 mM 암모니아의 존재 생 합성 시스템 설계에 의해 표현 되었고 Ni NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 순화 다음. GFP WT도 비교 분석 했다. 샘플 페이지-두번째-트리 스 4%-12 %SDS, 구분 했다 그리고 젤 Coomassie 화려한 블루 R-250 물 했다. (B) DOPA GFP E90DOPA의 tryptic 소화에서 포함 된 펩 티 드 파편의 MALDI TOF MS 분석. GFP WT에서 펩 티 드 조각 잔류물을 86-96 (SAMPEGYVQER)에 포함 되어 있습니다. GFP WT에서 조각에 Glu DOPA GFP E90DOPA에서 펩 티 드 조각에서 바뀝니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : DOPA의 일반적인 유전자 결합으로 biosynthesized DOPA의 직접 관 비교. 이러한 패널 표시 GFP E90DOPA 생 합성 시스템 설계 및 3mm DOPA 추가 pyruvate, 암모니아, 그리고 catechol 없이 존재 유전자 결합으로 표현. (A) 단백질 수율 순화 GFP-E90DOPA, 그리고 (B) 유도 후 16 h 셀 밀도 측정에서 얻은 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : GFP E90DOPA의 bioconjugation의 반응 계획. GFP E90DOPA dopaquinone DOPA 변환할 산화 이다. 긴장된 alkyne와 포함 하는 dopaquinone 단백질의 반응 사이트 단백질 라벨을 달성 한다. 오랜 시간 (48 h)에 대 한 높은 농도에서 포함 하는 dopaquinone 단백질의 외피 단백질 올리고 생산 단백질 자체 활용 하면 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : DOPA를 포함 하는 돌연변이 단백질의 Bioconjugation. (A) SPOCQ 긴장된 alkyne, ADIBO-Cy5.5 DOPA 포함 된 단백질의 반응. GFP WT와 GFP E90DOPA 나트륨으로 치료 periodate 및 ADIBO Cy5.5와 60 분에 대 한 반응. SDS 페이지 및 Coomassie 스테인드 (위)에 의해 반응을 분석 했다 고 형광 (아래) 이미지가 표시 됩니다. GFP E90DOPA의 (B) Oligomerization. DOPA 포함 된 GFP 나트륨으로 치료 했다 periodate 및 48 h에 대 한 인 큐베이 팅. 반응 혼합물이 SDS 페이지 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 생 합성 및 직접 설립 DOPA의 설명 되어 있습니다. 이 방법에 사용 되는 세균성 셀 추가 아미노산을 합성 하 고 단백질 합성에 대 한 부자연 스러운 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다. 부자연 스러운 아미노산의 유전자 결합 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 생물의 개발을 위한 핵심 기술 되었습니다. 그러나,이 메서드는 기술적으로 완료 되었습니다 하 고 관 효율을 향상 시키고 생 번역 시스템에 섭 동을 최소화 수정 되 고. 최근에, 방법에 상당한 진보가 codons24,25 부자연 스러운 아미노산 및 엔지니어링 직교 변환 구성 요소26,27,28 재할당 함으로써 달성 되었습니다. ,29. 이 개선 이외에 여기에 설명 되어의 시스템 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 유기 체에 다른 기능을 제공: 부자연 스러운 아미노산의 생 합성. 이 기능은 확장 된 유전 레 퍼 토리를 가진 유기 체로 더 많은 독립 부자연 스러운 시스템을 제공합니다. 또한, DOPA 세균 스트레인 3mm DOPA, 크게 감소, 세포 성장에서 그리고이 방법에 사용 되는 낮은 단백질 수율 결과에 온건한 독성을 보여줍니다. 직접 설립 시스템을 사용 하 여 독성은 감소 하 고 단백질 수율 증가 삼 배.
DOPA의 유전 결합 사용 aaRS 돌연변이 적당 한 효율성 및 충실도 고 DOPA의 낮은 농도에서 티 르. 18 그러므로 DOPA 세균성 세포에서의 생 합성 이어야 한다 Tyr 설립을 방지 하기 위해 충분히 효율적. Catechol, 암모니아, 그리고 pyruvate에서 TPL에 의해 DOPA 생 합성은 가역 반응, 그리고 시작 물자의 높은 농도 효율적인 생 합성에 대 한 필요 합니다. 그러나, catechol 사용할 수 없습니다 10 밀리미터 이상 독성 박테리아 스트레인이이 프로토콜에 사용 되는 때문에. DTT 농도 또한이 프로토콜에 중요 하다. DOPA L-dopaquinone로 변환 됩니다 DTT 산화 속도 줄이기 위해 성장 매체에 추가 됩니다 때 그것의 독성을 보여줍니다. DTT 농도 300 µ M 때 세포 성장 감소를 관찰 합니다. 따라서, 최적의 생 합성 및 DOPA의 설립, 문화 매체에 대 한 구성 요소 (특히 catechol 및 DTT) 해야 사용할 수 적절 한 농도에서이 프로토콜에서 설명 된 대로.
이 프로토콜은 또한 사이트별 단백질 활용에 대 한 DOPA 포함 된 단백질의 응용 프로그램을 설명합니다. L-dopaquinone 효율적으로 DOPA의 산화에 의해 생성 된 긴장된 alkyne 생화학 프로브에 연결 된 반응. 이 cycloaddition 반응 아민 또는 thiols 및 추가 반응 보다 일반적으로 더 빠릅니다. 그럼에도 불구 하 고, DOPA 산화 DOPA 포함 된 단백질 및 단백질에서 nucleophiles 여 및 추가 최소화 하기 위해 긴장된 alkyne 존재 밖으로 실행 되어야 한다. 따라서,이 반응에는 시 약의 추가의 순서는 중요 한.
많은 부자연 스러운 아미노산 단백질 활용에 대 한 사용할 수 있으며, 그들 중 일부는 빠른 반응 속도 우수한 활용 효율30,31,,3233달성. 이러한 아미노산 biorthogonal azides, alkynes, 긴장 된 알 켄 또는 alkynes, 및 tetrazines 같은 기능적인 그룹을 포함합니다. 들은 특정 단백질 활용에 대 한 유용한, 그들 중 많은 비싼 또는 상업적으로 액세스할 수, 그들의 응용 프로그램, 특히 필요한 대규모 단백질을 제한 하. 따라서, 저렴 한 원자재와 그것의 직접적인 법인 DOPA의 생 합성에 유용할 것 이다 생 화 확 적인 프로브 또는 약물 (항 체 의약품을 포함 하는 대규모 돌연변이 단백질을 필요로 하는 제약 및 산업 애플리케이션에 공액, ADC)입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 글로벌 프 런 티어 연구 프로그램 (NRF-2015M3A6A8065833)에 의해 지원 되었다 그리고 기본 과학 연구 프로그램 (2018R1A6A1A03024940)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부에 의해 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
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