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Biochemistry

Genetischen Einbeziehung der Biosynthesized L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und seine Anwendung auf Protein-Konjugation

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die genetische Aufnahme von L-Dihydroxyphenylalanine Biosynthesized aus einfachen Ausgangsmaterialien und seine Anwendung auf Protein Konjugation.

Abstract

L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen gefunden. Wegen seiner besonderen biochemischen Eigenschaften hat die Aminosäure Mehrfachnutzung in biochemische Anwendungen. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll für die genetische Einbeziehung der Biosynthesized DOPA und seine Anwendung auf Protein Konjugation. DOPA ist Biosynthesized durch ein Tyrosin Phenol-Lyase (TPL) von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak und die Aminosäure ist direkt durch die genetische Einbau-Methode mit einem weiterentwickelten Aminoacyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA synthestase Paar in Proteine aufgenommen. Dieses direkte Einbindung System beinhaltet effizient DOPA mit wenig Einbindung anderer natürlicher Aminosäuren und bessere Proteinausbeute als das Vorgängersystem genetische Aufnahme für DOPA. Protein-Konjugation mit DOPA-haltige Proteine ist effizient und ortsspezifische und zeigt seine Nützlichkeit für die verschiedensten Anwendungen. Dieses Protokoll bietet Protein Wissenschaftler mit detaillierten Verfahren für die effiziente Biosynthese von mutierten Proteine mit DOPA an gewünschten Standorten und deren Konjugation für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

Introduction

DOPA ist eine Aminosäure, die in die Biosynthese der Katecholamine bei Tieren und Pflanzen beteiligt. Diese Aminosäure wird von Tyr von Tyrosin-Hydroxylase und molekularer Sauerstoff (O2)1synthetisiert. Da DOPA eine Vorstufe von Dopamin ist und die Blut - Hirn-Schranke durchdringen kann, hat es bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit2eingesetzt. DOPA findet sich auch in Muschel Adhäsion Proteine (MAPs), die für die Hafteigenschaften der Muscheln in nassen Bedingungen3,4,5,6,7zuständig sind. Tyr wird zunächst an den Positionen kodiert, wo DOPA findet sich in Karten und dann durch tyrosinasen8,9in DOPA umgewandelt wird. Wegen seiner interessanten biochemischen Eigenschaften wurde DOPA in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt. Die Dihydroxyl Gruppe von DOPA ist chemisch anfällig für Oxidation und die Aminosäure ist in L-Dopaquinone, ein Vorläufer der Melanine umfunktioniert. Aufgrund seiner hohen Electrophilicity wurden für Vernetzung und Konjugation mit Thiole und Amine10,11,12,13L-Dopaquinone und seine Derivate eingesetzt. 1,2-Chinonen können auch als ein Diens für Cycloaddition Reaktionen und werden durch Belastung gefördert Oxidation-gesteuerten Cyclooctyne-1,2-Quinone (SPOCQ) deutscher14seit biokonjugaten. Darüber hinaus die Dihydroxyl Gruppe kann Metallionen wie Fe3 + und Cu2 +Chelat und Proteine mit DOPA haben für Drug Delivery und Metallion sensing15,16verwendet worden.

DOPA hat genetisch in Proteine mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) und die Aminoacyl-tRNA synthestase (AaRS) Paar17 integriert und verwendet für Protein Konjugation und Vernetzung10,11, 12,13. In diesem Bericht werden experimentelle Ergebnisse und Protokolle für die genetische Einbeziehung von DOPA Biosynthesized von billige Ausgangsmaterialien und ihre Anwendungen auf biokonjugaten beschrieben. DOPA ist Biosynthesized mit einem TPL und ausgehend von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak in Escherichia coli. Biosynthesized DOPA ist direkt integriert Proteine ein weiterentwickelter aa-tRNA und AaRS Pair für DOPA zum Ausdruck zu bringen. Darüber hinaus ist das Biosynthesized Protein mit DOPA mit einem fluoreszierenden Sonde und vernetzt zu produzieren Protein Oligomere ortspezifisch konjugiert. Dieses Protokoll wird nützlich sein für Protein Wissenschaftler zur Biosynthese mutierte Proteine mit DOPA und konjugieren der Proteine mit biochemischen Sonden oder Drogen für industrielle und pharmazeutische Anwendungen.

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Protocol

(1) Plasmid Bau

  1. Konstruieren ein expressionsplasmid (Madothertrucker-Dual-TPL-GFP-WT), die das TPL-gen aus Citrobacter Freundii unter der Kontrolle der konstitutiven Promoter und das grün fluoreszierende Protein (GFP) Gen mit einem seiner drückt6-Tag unter der Kontrolle der AraBAD Förderer. Ersetzen Sie für Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG das Codon für den Standort (E90) von DOPA mit einem Bernstein-Codon (TAG), mit einem Site-verwiesene Mutagenese-Protokoll. Die Details für den Bau dieses Plasmid wurde in unserem vorherigen Bericht18beschrieben.
  2. Ein tRNA/AaRS-Ausdruck Plasmid (pEVOL-DHPRS2)18,19 für die genetische Einbeziehung von DOPA zu konstruieren. pEVOL ist ein spezielles Plasmid-Vektor zwei Kopien des AaRS Gene mit unabhängigen Veranstaltern zum Ausdruck zu bringen, und die detaillierte Informationen des Plasmids wird in einem früheren Bericht19beschrieben.
  3. Verwenden Sie im Handel erhältlichen Plasmid Vorbereitung Kits, um hochreine Plasmid DNA zu erhalten. Überprüfen Sie die Reinheit der vorbereitet DNAs mit Agarose-Gelelektrophorese, falls erforderlich.

(2) Kultur Vorbereitung

  1. Elektroporation
    1. Verwendung der Elektro-kompetente E. Coli DH10β Belastung für dieses Experiment. 1 µL jedes Plasmid DNA (pEVOL-DHPRS2 und Madothertrucker-Dual-TPL-GLP-E90TAG) zu 20 µL kompetente Zellen hinzufügen. Mischen Sie sie vorsichtig, um eine homogene Mischung, mit einer Pipette zu machen.
    2. Übertragen Sie die Mischung auf die Elektroporation Küvetten. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Schieben Sie die Küvette in die Kammer zu festen Küvette-Kammer zu kontaktieren.
    3. Die Küvette mit 25 µF schockieren und 2,5 kV für 0,1 cm-Küvetten.
    4. Fügen Sie 1 mL vorgewärmte super optimale Brühe (SOC), mit 2 % (w/V) Tryptone, 0,5 % (w/V) Hefe-Extrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2und 20 mM Glukose, die Küvette und die Zellen zu einem Kultur-Schlauch übertragen. Die Zellen zu retten, indem sie Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit schütteln.
    5. 10-100 µL der geretteten Zellen auf einer Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit 35 µg/mL Chloramphenicol und 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C 16 h.
  2. Starter-Kultur-Vorbereitung
    1. Eine einzige transformierte Kolonie in 5 mL LB-Medium mit Antibiotika immun. Inkubieren Sie die Kolonie für 12 h bei 37 ° C mit schütteln.

3. Ausdruck und Aufreinigung von GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen System

  1. Ausdruck der GFP-E90DOPA von einem biosynthetischen system
    1. Übertragen Sie die Starterkultur (2 mL) auf 100 mL PA-5052 mittleren20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 % [w/V] Spur Metalle, 0,5 % [w/V] Glycerin, 0,05 % [w/V] Glucose und Aminosäuren 5 % [w/V] [pH 7.25]) mit 35 µg/mL Chloramphenicol, 100 µg/mL Ampicillin, 100 mM Pyruvat, brenzcatechins 10 mM, 25 mM Ammoniak und 300 µM Dithiothreitol (DTT) gefolgt von einer Inkubation bei 30 ° C mit schütteln.
    2. Fügen Sie 2 mL 0,2 % (w/V) L-Arabinose wenn die optische Dichte (OD) bei 550 nm erreicht 0,8. Inkubation der Probe für 12 h bei 30 ° C mit schütteln.
    3. Spin-down der Zellen bei 11.000 x g für 5 min, den überstand verwerfen und Einfrieren der Zelle Pellet bei-80 ° C.
  2. Zell-Lyse
    1. Die Zelle Pellet auf Eis Auftauen und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL Lyse-Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    2. Beschallen die resuspendierte Zellen auf Eis für 10 min. Einsatz 80 % Beschallung Amplitude mit einem Puls von 25 s ein und 35 s aus.
    3. Spin-down der Zelle lysate bei 18.000 x g bei 4 ° C für 15 min. Transfer der Überstand zu einem frischen Schlauch für Reinigung und das Pellet zu verwerfen.
  3. NI-NTA Affinitätschromatographie
    1. Der Überstand Ni-NTA (Nitrilotriacetic Säure) Harz (300 µL der Harz-Aussetzung für eine 100-mL-Kultur) hinzu und binden Sie die Proteine, die Ni-NTA-Harz bei 4 ° C durch sanft schütteln Sie die Suspension für 1 h.
    2. Die Aussetzung einer Polypropylen Spalte übertragen und waschen Sie das Harz 3 X mit 5 mL Waschpuffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    3. Eluieren Proteine 3 X mit 300 µL der Elution Puffer mit 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl.
    4. Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Absorption bei 280 nm. Die vom Aussterben bedroht-Koeffizient (24.630 M-1cm-1) für GLP-E90DOPA bei 280 nm wurde berechnet, indem ein Protein Aussterben Koeffizient Rechner (z.B. https://web.expasy.org/protparam/) und das unabhängig gemessene Aussterben Coefficiennt (2630 M-1cm-1) für DOPA. Als eine alternative Methode verwenden Sie die Bradford Protein Assay21 für eine Bestimmung der Konzentration des Proteins.

4. Oligomerisierung von gereinigten GLP-E90DOPA

  1. Fügen Sie 1 µL Sodium periodate H2O (6 mM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (300 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.
  2. Die Oligomerisierung Reaktion bei 25 ° C für 48 h Vorgehen zu ermöglichen.
  3. Analysieren Sie das Reaktionsgemisch durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) (SDS-PAGE), wie in Schritt 6 beschrieben.

(5) Konjugation von GFP-E90DOPA mit einem Alkinen Sonde durch SPOCQ

  1. Fügen Sie 1 µL der Cy5.5 Verbindung Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4,0 mM) (10 Äquiv, GFP-E90DOPA) zu einer Lösung von 20 µL des GFP-E90DOPA (20 µM) in einem Phosphatpuffer mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl.
  2. Fügen Sie 1 µL des Natriums in H2O periodate (400 µM) (1.0 Äquiv, GFP-E90DOPA) zum Reaktionsgemisch.
  3. Lassen Sie die SPOCQ Reaktion bei 25 ° C für 1 Stunde gehen. Wenn eine lichtempfindliche Sonde verwendet wird, decken Sie das Reaktionsgefäß mit Alufolie ab.

6. Reinigung der beschrifteten GLP

  1. Verdünnen Sie das Reaktionsgemisch SPOCQ durch Zugabe von Phosphatpuffer, mit 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 300 mM NaCl, bis zu 500 µL.
  2. Übertragen Sie die verdünnte Lösung auf eine zentrifugale Filterspalte Spin. Zentrifugieren Sie die Spin-Spalte bei 14.000 X g bei 4 ° C für 15 min und entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X um jede überschüssige Cy5.5-ADIBO zu entfernen.
  3. Übertragen Sie die gereinigte Probe aus der Spalte "Spin" auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
  4. Alternativ führen Sie eine Reinigung durch Dialyse gegen den gleichen Puffer.
  5. Speichern Sie die gereinigten GFP bei 4 ° C.

(7) SDS-PAGE-Analyse und Fluoreszenz-Gel Scannen

  1. SDS-PAGE-Analyse durch Zugabe von 5 µL Probenpuffer Protein Proteinproben vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien) und 2 µL von DVB-t (1,00 M), 13 µL des gereinigten oder derbe, beschriftet GFP (13,6 µM oder 0,38 mg/mL). Eine Analyse der Oligomere GFP verwenden Sie eine höhere Konzentration von GFP (67,8 µM oder 1,9 mg/mL). Denaturieren Sie die Proteine durch sie bei 95 ° C für 10 min Inkubation.
  2. Legen Sie eine 4 % - 12 % Bis-Tris SDS-PAGE Gel Kassette (gekaufte, vorgefertigten Gel Kassetten) auf die Elektrophorese-Zelle und fügen einen laufenden Puffer (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie die Proteinproben und einem Molekulargewicht Marker. Laufen Sie die Elektrophorese für 35-40 min. bei 200 V.
    Hinweis: Vermeiden Sie jegliche Exposition die Proteinproben Licht durch die Durchführung aller Prozesse in der Dunkelheit, um Foto-Bleichen der fluoreszierenden Sonde zu minimieren.
  3. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Scanner für die Fluoreszenz-Bildgebung. Wickeln Sie eine Protein-Gel von Elektrophorese und legen Sie es auf einem Fluoreszenz-Scanner. Scannen Sie das Gel mit einem geeigneten Wellenlänge-Einstellung. Wählen Sie für Cy5.5 den Cy5-Modus in der Scanner-Software zur Verfügung gestellt.
  4. Färben Sie das Gel mit einem kommerziellen Protein Beflecken Reagenz.

8. MALDI-TOF-MS-Analyse durch Trypsin-Verdauung

  1. Inkubieren Sie 100 µL der gereinigten GLP-E90DOPA (2,2 mg/mL oder 80 µM) in einem Puffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 % (w/V) SDS und 25 mM DTT bei 60 ° C für 1 h.
  2. Fügen Sie 1 µL Iodoacetamide in H2O (IAA, 4.0 M) (500 Äquiv, GFP-E90DOPA) auf die gereinigte GLP-E90DOPA Lösung (80 µM) in den gleichen Puffer. Inkubieren Sie die Mischung bei 25 ° C für 30 min mit Lichtschutz.
  3. Verdauen Sie die GLP-E90DOPA Probe durch Zugabe von Trypsin (1: 100-Protease-Substrat-Protein-Verhältnis [w/w]) zu und inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 37 ° C für 4 h.
  4. Reinigen Sie die verdaute Peptid-Probe C18 Spin Spalten eine Entsalzung Standardmethode mit.
  5. Analysieren Sie die verdauten Peptide durch die gemeldeten Protokoll für Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) mit Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) als ein Matrix-23.

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Representative Results

Expressionssystem für die direkte Einbindung von DOPA Biosynthesized von einer TPL ist in Abbildung 1dargestellt. Die Gene für das weiterentwickelte aa-tRNA und AaRS paar befinden sich in ein Plasmid, und das GFP-gen (GFP-E90TAG) mit einem Bernstein Codon an Position 90 befindet sich in einer anderen Plasmid, die Einbeziehung von DOPA zu bewerten von GFP-Fluoreszenz. Das TPL-gen werden in das gleiche expressionsplasmid mit der GFP-gen und konstitutiv ausgedrückt, um die Ausbeute an die DOPA-Biosynthese zu maximieren. Mit diesem Ausdruck System wurden optimale Bedingungen für die Biosynthese von DOPA überprüft. Das Wachstumsmedium für dieses Experiment enthalten 25 mM Ammoniak und 100 mM Pyruvat, mit unterschiedlichen Konzentrationen von brenzcatechins (0 - 10 mM) verwendet. Die brenzcatechins-Konzentration war entscheidend für die DOPA-Biosynthese, während Ammoniak und Pyruvat Konzentrationen über 25 mM und 100 mM, bzw. nicht die Biosynthese und Aufnahme von DOPA berührten. Die optimale Konzentration von brenzcatechins war 10 mM und eine Konzentration von mehr als 10 mM deutlich verringert die bakterielle Zelle Wachstum aufgrund ihrer Zytotoxizität. In diesem optimalen Zustand war DOPA Biosynthesized von TPL aus seiner Ausgangsmaterialien und die Biosynthesized von die Dopa GFP direkt integriert wurde. Die ausgedrückte Mutante GFP (GFP-E90DOPA) wurde gereinigt und analysiert durch SDS-PAGE (Abb. 2A). In voller Länge GFP wurde gereinigt und die DOPA-Aufnahme wurde von MALDI-TOF MS-Analyse (Abbildung 2B) bestätigt. Das Protein wurde mit Trypsin verdaut, das Peptid Fragment mit DOPA wurde analysiert und das Ergebnis zeigte die exklusive Aufnahme von DOPA mit keine nachweisbaren Tyr oder andere natürliche Aminosäure-Aufnahme. Die Einbeziehung Effizienz von DOPA Biosynthesized von TPL war ähnlich, die Einbeziehung Effizienz mit 3 mM DOPA, ist die maximale Konzentration von DOPA wegen seiner Zytotoxizität19. Obwohl 10 mM brenzcatechins mäßiger Toxizität zeigte, war die Zelldichte nach 16 h der Kulturzeit drei-bis Vierfache höher als in Anwesenheit von 3 mM DOPA. Die gereinigten Protein-Ausbeute durch Biosynthese war das Dreifache höher als die aus dem Experiment mit 3 mM DOPA (Abbildung 3).

Der Mutant GFP mit DOPA für Protein Konjugation verwendet wurde. DOPA in L-Dopaquinone oxidiert werden kann, durch milde Oxidationsmittel und elektrophiler Quinone reagiert mit angespannten Alkinen und nukleophile, wie Thiole und Amine, und eignet sich für biokonjugaten (Abbildung 4). GLP-E90DOPA wurde getestet für SPOCQ Cycloaddition durch Reaktion mit Natrium periodate, gefolgt von einer Behandlung mit Cy5.5-ADIBO22. Diese SPOCQ Reaktion wurde von SDS-PAGE und Fluoreszenz-imaging (Abb. 5A) analysiert. Die intensive Fluoreszenz-Band wurde mit einer Behandlung von Natrium periodate und Cy5.5-ADIBO, während keine Fluoreszenz-Band Kontrollreaktionen mit GFP-WT oder ohne eine Natrium zeigte periodate Behandlung, bestätigen die Effizienz und die Spezifität der beobachtet die Konjugation Reaktion mit gentechnisch eingebaute DOPA. Darüber hinaus diente die DOPA-haltigen GFP Protein Oligomerisierung. L-Dopaquinone reagiert mit Lys oder Cys des gleichen Proteins Oligomere Proteine führt. GLP-E90DOPA wurde behandelt mit Natrium periodate und die Oligomerisierung wurde für 48 h durchgeführt, und die Reaktion war im Vergleich zu einer Kontrollprobe von SDS-PAGE analysiert, ohne eine Sodium periodate Behandlung (Abb. 5B). Die Analyse zeigte eine klare Oligomerisierung Muster mit gleichmäßig angeordneten Protein Bands für das Beispiel Periodate behandelt, während der Kontrollprobe das intakte Protein ohne irgendwelche anderen Bands zeigte.

Figure 1
Abbildung 1 : Direkte Aufnahme von DOPA Biosynthesized von brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak. DOPA ist Biosynthesized durch heterologously ausgedrückt TPL aus brenzcatechins, Pyruvat und Ammoniak im Wachstumsmedium. Das weiterentwickelte tRNA/AaRS-Paar für DOPA ist Co ausgedrückt, die Biosynthesized DOPA in das Zielprotein, GFP zu integrieren. Das TPL-Gen wurde ein konstitutiver Promoter unterstellt, um die DOPA-Biosynthese vor Induktion des GFP-Ausdrucks zu starten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : SDS-PAGE und MALDI-TOF MS Analysen der GFP-E90DOPA ausgedrückt durch das entwickelte biosynthetischen System. (A) GLP-E90DOPA ausgedrückt durch das entwickelte biosynthetischen System in Anwesenheit von 10 mM brenzcatechins 100 mM Pyruvat und Ammoniak 25 mM war, und dann durch Ni-NTA Affinitätschromatographie gereinigt. GFP-WT wurde auch zum Vergleich analysiert. Die Proben wurden von biz-Tris 4 % - 12 % SDS-PAGE getrennt, und das Gel wurde mit Coomassie Brilliant Blue R-250 befleckt. (B) Analyse der MALDI-TOF MS das Peptid Fragment mit DOPA aus der tryptic Verdauung der GFP-E90DOPA. Das Peptid Fragment von GFP-WT enthält die Rückstände 86-96 (SAMPEGYVQER). Die Glu im Fragment von GFP-WT ist mit DOPA in das Peptid Fragment von GFP-E90DOPA ersetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Vergleich der eine direkte Einbindung von Biosynthesized DOPA mit einem allgemeinen genetischen Einbau von DOPA. Diese Tafeln zeigen GLP-E90DOPA durch das entwickelte biosynthetischen System und die genetische Einbeziehung in Anwesenheit von 3 mM DOPA ohne zusätzliche Pyruvat, Ammoniak und brenzcatechins ausgedrückt. (A) das Protein die Erträge stammen aus gereinigten GLP-E90DOPA und (B), die die Zelldichten um 16 h nach der Induktion gemessen wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Reaktionsschema der biokonjugaten der GFP-E90DOPA. GLP-E90DOPA oxidiert, DOPA in Dopaquinone umzuwandeln. Die Reaktion der Dopaquinone-haltige Protein mit einer angespannten Alkinen erreicht ortsspezifische Protein Kennzeichnung. Die Inkubation von Dopaquinone-haltige Protein mit einer hohen Konzentration für eine lange Zeit (48 h) bewirkt, dass selbst Konjugation Protein, Protein Oligomere zu produzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Biokonjugaten mutierte Proteine mit DOPA. (A) SPOCQ Reaktionen der DOPA-haltige Protein mit einer angespannten Alkinen, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT und GLP-E90DOPA wurden behandelt mit Natrium periodate und reagierte mit ADIBO-Cy5.5 für 60 Minuten. Analysiert wurden die Reaktionen durch SDS-PAGE und Coomassie gefärbt (oben) und (unten) Fluoreszenzbilder angezeigt werden. (B) Oligomerisierung von GFP-E90DOPA. Die DOPA-haltigen GFP wurde behandelt mit Natrium periodate und für 48 h inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde von SDS-PAGE analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In diesem Protokoll werden die Biosynthese und die direkte Einbindung von DOPA beschrieben. Die Bakterienzelle verwendet bei dieser Methode kann eine weitere Aminosäure synthetisieren und verwenden es als unnatürlich Baustein für die Proteinsynthese. Die genetische Einbeziehung der unnatürlichen Aminosäuren ist eine Schlüsseltechnologie für die Entwicklung der unnatürlichen Organismus mit einer erweiterten genetischen Code gewesen. Jedoch diese Methode wurde technisch unvollständigen und zur Effizienzsteigerung der Einbeziehung und minimieren Störung zu endogenen Übersetzungssysteme bearbeitet wird. Vor kurzem wurden bedeutende Fortschritte in der Methode erzielt durch Neuzuweisen von Codons24,25 für unnatürlichen Aminosäuren und engineering orthogonal translationale Komponenten26,27,28 ,29. Zusätzlich zu diesen Verbesserungen, das hier beschriebene System bietet eine weitere Funktion zu einem unnatürlichen Organismus mit einer erweiterten genetischen Code: Biosynthese von eine unnatürliche Aminosäure. Diese Funktion gibt die unnatürlichen System mehr Unabhängigkeit als ein Organismus mit einem erweiterten genetische Repertoire. Darüber hinaus zeigt DOPA moderate Toxizität auf den Bakterienstamm verwendet bei dieser Methode, und bei 3 mM DOPA, Zellwachstum deutlich reduziert, eiweißarme Ertrag geführt. Mithilfe der direkten Aufnahme System Toxizität wurde reduziert und Eiweiß-Ertrag hat sich verdreifacht.

Die AaRS Mutante verwendet für die genetische Einbeziehung von DOPA hat moderate Effizienz und Treue und Tyr in einer niedrigen Konzentration von DOPA beinhaltet. 18 darum, die Biosynthese von DOPA in Bakterienzellen effizient genug, um Tyr Einbeziehung zu verhindern sollte. Die DOPA-Biosynthese von TPL aus brenzcatechins, Ammoniak und Pyruvat ist eine reversible Reaktion und hohe Konzentrationen der Ausgangsstoffe sind erforderlich für eine effiziente Biosynthese. Jedoch kann nicht brenzcatechins mehr als 10 mM verwendet werden, weil es giftig für die in diesem Protokoll verwendeten Bakterienstamm ist. Die DVB-t-Konzentration ist auch wichtig in diesem Protokoll. DOPA zeigt seine Giftigkeit, wenn es in L-Dopaquinone umgewandelt wird, und DVB-t wird im Wachstumsmedium zur Senkung der Oxidation hinzugefügt. Wir beobachten einen Rückgang der Zellwachstum, wenn war die DVB-t-Konzentration mehr als 300 µM. Daher sollte für eine optimale Biosynthese und Aufnahme von DOPA, die Komponenten (vor allem brenzcatechins und DVB-t) für Kulturmedium in entsprechenden Konzentrationen verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben.

Dieses Protokoll beschreibt auch Anwendungen von DOPA-haltige Proteine für standortspezifische Protein Konjugation. L-Dopaquinone erzeugt durch die Oxidation von DOPA effizient reagiert mit einer angespannten Alkinen, verbunden mit einer biochemischen Sonde. Diese Cycloaddition Reaktion ist in der Regel schneller als Reaktionen der nukleophilen Addition von Aminen oder Thiole. Dennoch sollte die Oxidation von DOPA im Beisein von DOPA-haltige Protein und eine angespannte Alkinen Minimierung der nukleophilen Addition durch nukleophile im Protein durchgeführt werden. Daher ist die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien für diese Reaktion entscheidend.

Viele unnatürliche Aminosäuren sind für Protein Konjugation zur Verfügung, und einige von ihnen erreichen eine schnelle Reaktionsgeschwindigkeit und ausgezeichnete Konjugation Effizienz30,31,32,33. Diese Aminosäuren enthalten Biorthogonal Funktionsgruppen wie Azides, Alkinen, angespannte Alkenen oder Alkinen und Tetrazines. Sind nützlich für standortspezifische Protein Konjugation, sind viele von ihnen teuer oder kommerziell nicht zugegriffen werden, die Grenzen ihrer Anwendungen, insbesondere diejenigen, die große Proteine. Daher wird die Biosynthese von DOPA aus billige Ausgangsmaterialien und die direkte Einbindung nützlich für pharmazeutische und industrielle Anwendungen, bei denen große mutierte Proteine mit einer biochemischen Sonde oder ein Medikament (Antikörper-Wirkstoff Konjugat, ADC).

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), und die grundlegende Wissenschaft Research Program (2018R1A6A1A03024940) durch National Research Foundation of Korea (NRF) von der Korea-Regierung finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

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References

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Biochemie Ausgabe 138 DOPA genetische Einarbeitung Biosynthese Tyrosin Phenol-Lyase Protein Konjugation Stamm geförderte Oxidation-gesteuerten Cyclooctyne-1,2-Quinone (SPOCQ)-cycloaddition
Genetischen Einbeziehung der Biosynthesized L-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und seine Anwendung auf Protein-Konjugation
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Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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