Summary
כאן, אנו מציגים עבור שיתוף L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized מחומרים פשוטים המוצא הגנטי ויישומו חלבון ההטיה פרוטוקול.
Abstract
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) היא חומצת אמינו נמצאו ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. בשל תכונותיו הביוכימי מסוים, חומצת אמינו ביותר יש שימושים מרובות יישומים ביוכימיים. הדו ח מתאר פרוטוקול עבור שיתוף גנטי biosynthesized DOPA ויישומו חלבון ההטיה. DOPA היא biosynthesized על-ידי טירוזין פנול-lyase (TPL) catechol, פירובט, אמוניה, חומצת אמינו ביותר מעוגנת ישירות לחלבונים בשיטת התאגדות גנטי באמצעות aminoacyl מפותחת-tRNA וזוג המעביר aminoacyl-tRNA. מערכת ישירה התאגדות זו משלבת ביעילות DOPA התאגדות הקטן של חומצות אמינו טבעיות אחרות, עם התשואה חלבון טוב יותר מאשר מערכת גנטית התאגדות הקודם עבור DOPA. ההטיה חלבון עם DOPA המכילים חלבונים הם יעילים גם בייעודי לאתר ויראה תועלתו ליישומים שונים. פרוטוקול זה מספק חלבון למדענים הליכים מפורטים ביוסינתזה יעיל של מוטציה חלבונים המכילים DOPA האתרים המבוקשים, ההטיה שלהם עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.
Introduction
DOPA היא חומצת אמינו מעורב ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. זו חומצת אמינו הוא מסונתז מן Tyr טירוזין hydroxylase, חמצן מולקולרי (O2)1. כי DOPA הוא סימן מקדים של דופמין, יכולים לחדור את מחסום דם - מוח, זה נעשה שימוש בטיפול של מחלת פרקינסון2. DOPA נמצא גם חלבונים אדהזיה מאסל (מפות), אשר אחראים על המאפיינים דבק של מולים ב התנאים הרטובים3,4,5,6,7. Tyr מקודד בתחילה על העמדות איפה DOPA הוא נמצא במפות, ואז מומר DOPA ב8,tyrosinases9. בשל תכונותיו הביוכימי מעניין, DOPA השתמשו במגוון רחב של יישומים. קבוצת dihydroxyl DOPA כימית נוטה ל, חומצת אמינו ביותר מומר בקלות L-dopaquinone, סימן מקדים של melanins. בגלל electrophilicity גבוהה שלה, L-dopaquinone ונגזרותיו שימשו crosslinking, ההטיה עם תיולים ו אמינים10,11,12,13. 1, 2-קווינונס יכול לפעול גם diene לתגובות cycloaddition, שימשו bioconjugation על ידי קידום-זן שבשליטת חמצון cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. בנוסף, הקבוצה dihydroxyl יכול chelate יונים מתכתיים כגון Fe3 + ו- Cu2 +, כבר מנוצל חלבונים המכילים DOPA עבור משלוח סמים ויון מתכת חישה15,16.
יש כבר שולב חלבונים על-ידי שימוש aminoacyl-tRNA אורתוגונלית (aa-tRNA), ו aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג17 ונועד לשמש חלבון ההטיה, crosslinking10,11, גנטית DOPA 12,13. בדו ח זה, מתוארות תוצאות ניסויית ופרוטוקולים כהכנה לסיפוח DOPA biosynthesized של חומרי המוצא זול ושימושיה bioconjugation גנטית. DOPA הוא biosynthesized באמצעות TPL ו החל מ- catechol פירובט, אמוניה ב- Escherichia coli. Biosynthesized DOPA הוא ישירות שולב חלבונים על ידי הבעת זוג aa-tRNA, aaRS מפותחת עבור DOPA. בנוסף, החלבון biosynthesized המכיל DOPA הוא site-specifically מצומדת עם בדיקה פלורסנט, תפור לייצר חלבון oligomers. פרוטוקול זה להיות שימושי עבור מדענים חלבונים, חלבונים מוטציה biosynthesize המכיל DOPA, נזווג את החלבונים עם הגששים ביוכימי או סמים עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פלסמיד בנייה
- לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-כפול-TPL-GFP-WT) המבטאת את הגן TPL מן Citrobacter freundii תחת השליטה של מקדם מכוננת, הגן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עם שלו6-תג תחת השליטה של יזם araBAD. עבור pBAD-כפול-TPL-GFP-E90TAG, החלף את codon עבור האתר (E90) של DOPA עם codon ענבר (תג), באמצעות פרוטוקול מוטגנזה. הפרטים לבנייה של פלסמיד זו תוארה בשנת הדוח הקודם שלנו18.
- לבנות tRNA/aaRS-ביטוי פלסמיד (pEVOL-DHPRS2)18,19 כהכנה לסיפוח DOPA גנטי. pEVOL הוא וקטור פלסמיד מיוחד להביע שני עותקים של גנים aaRS עם היזמים עצמאית, מידע מפורט של פלסמיד המתואר בדוח הקודם19.
- להשתמש ערכות הכנה פלסמיד זמינים מסחרית כדי להשיג טוהר גבוהה פלסמיד DNAs. לבדוק את טוהר DNAs שומר. על פרופיל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל agarose, במידת הצורך.
2. תרבות הכנה
-
אלקטרופורציה
- שימוש המוסמכת-אלקטרו DH10β e. coli אסנן את הניסוי הזה. להוסיף 1 µL של כל פלסמיד דנ א (pEVOL-DHPRS2 ו- pBAD-כפול-TPL-GFP-E90TAG) 20 µL של תאים המוסמכת. מערבבים אותם בעדינות כדי להפוך את תערובת הומוגנית, באמצעות פיפטה.
- להעביר את התערובת וואקום אלקטרופורציה. מניחים את cuvette בבית הבליעה אלקטרופורציה. לדחוף את cuvette לתוך החדר כדי להפוך cuvette המשרד-לשכת קשר.
- לזעזע את cuvette, באמצעות 25 µF ו- 2.5 kV עבור כימיקלים 0.1-ס"מ.
- להוסיף 1 מ"ל prewarmed מרק סופר אופטימלית (SOC), המכיל 2% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) שמרים תמצית 10 מ מ NaCl, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, גלוקוז 20 מ מ, כדי cuvette, ולהעביר את התאים צינור תרבות. להציל את התאים על ידי המקננת בהם עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
- מורחים 10-100 µL של התאים שניצלו על צלחת אגר מרק (ליברות) lysogeny המכילה 35 µg/mL כלורמפניקול, אמפיצילין µg/mL 100. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
-
הכנה תרבות starter
- לחסן מושבה טרנספורמציה יחיד ב 5 מ ל LB בינוני המכיל אנטיביוטיקה. דגירה המושבה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
3. ביטוי ולטיהור GFP-E90DOPA על-ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר
-
ביטוי של GFP-E90DOPA על-ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר
- להעביר את התרבות המתנע (2 מ"ל) 100 מ של הרשות הפלסטינית-5052 בינוני20 (50 מ מ נה2HPO4, 50 מ מ ח'2PO4, 25 מ מ [NH4]24, 2 מ מ MgSO4, 0.1% [w/v] לאתר מתכות, 0.5% [w/v] גליצרול. 0.05% [w/v] גלוקוז, חומצות אמינו 5% [w/v] [pH 7.25]) המכילה 35 µg/mL כלורמפניקול אמפיצילין µg/mL 100, 100 מ מ פירובט, catechol 10 מ מ, 25 מ מ אמוניה, dithiothreitol 300 מיקרומטר (DTT) ואחריו דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות.
- להוסיף 2 מ של 0.2% (w/v) L-אראבינוז כאשר הצפיפות האופטית (OD) ב 550 ננומטר מגיע ל 0.8. דגירה המדגם עבור 12 h ב- 30 מעלות צלזיוס ברעידות.
- ספין למטה התאים ב 11,000 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, להקפיא בגדר תא ב-80 מעלות צלזיוס.
-
פירוק התא
- הפשרת בגדר תא בקרח, resuspend התאים 10 מ"ל של פירוק מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 10 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
- Sonicate התאים resuspended בקרח במשך 10 דקות שימוש 80% sonication משרעת עם דופק של 25 s s ו-35 על ביטול.
- ספין למטה התא lysate ב g x 18,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להעביר תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים לטיהור וזורקים בגדר.
-
כרומטוגרפיית זיקה Ni-נ
- Ni-נ (חומצה nitrilotriacetic) שרף (300 µL של שרף השעיה על תרבות 100-mL) להוסיף תגובת שיקוע, לאגד את החלבונים שרף Ni-נ ב 4 ° C ע י ניעור בעדינות את המתלים לשעה.
- להעביר את המתלים עמודה פוליפרופילן ולשטוף את השרף 3 x 5 מ של שטיפת מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 20 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
- Elute את החלבונים 3 x עם 300 µL • תנאי מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 250 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
- לקבוע ריכוז החלבון על ידי מדידת את ספיגת ב 280 ננומטר. הכחדה המקדם (24,630 ז-1ס מ-1) עבור ה-GFP-E90DOPA-280 ננומטר מחושב על ידי חלבון הכחדה מקדם מחשבון (למשל, https://web.expasy.org/protparam/) והכחדה נמדד באופן עצמאי coefficiennt (2630 M-1ס מ-1) עבור DOPA. כאמצעי חלופי, השתמש assay חלבון21 ברדפורד קביעת ריכוז חלבון.
4. oligomerization של GFP מטוהרים-E90DOPA
- להוסיף 1 µL של נתרן periodate H2O (6 מ מ) (1.0 equiv. ל GFP-E90DOPA) את הפתרון של 20 µL של GFP-E90DOPA (300 מיקרומטר) ב בופר פוספט המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl.
- לאפשר את התגובה oligomerization להמשיך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- לנתח את תערובת התגובה ידי נתרן גופרתי-לזיהוי dodecyl בג'ל) (מרחביות-עמוד) כפי שמתואר בשלב 6.
5. ההטיה של GFP-E90DOPA עם בדיקה אלקין על ידי SPOCQ
- להוסיף 1 µL של מקושרים-Cy5.5 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 מ"מ) (10 equiv. ל GFP-E90DOPA) את הפתרון של 20 µL של GFP-E90DOPA (20 מיקרומטר) ב בופר פוספט המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl.
- להוסיף 1 µL של נתרן periodate H2O (400 מיקרומטר) (1.0 equiv. ל GFP-E90DOPA) לתערובת התגובה.
- לאפשר את התגובה SPOCQ להמשיך 25 ° c עבור 1 h. אם בדיקה רגישים לאור, מכסים את כלי הקיבול של התגובה ברדיד אלומיניום.
6. טיהור של ה-GFP שכותרתו
- לדלל את התערובת תגובה SPOCQ על-ידי הוספת בופר פוספט, המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl, µL עד 500.
- להעביר את הפתרון מדולל עמודה ספין צנטריפוגלי מסנן. Centrifuge העמודה ספין-x 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וזורקים את הזרימה דרך. חזור על שלב 3 x כדי להסיר את כל העודפים של Cy5.5-ADIBO.
- להעביר את הדגימה מטוהרים מן העמודה ספין צינור 1.5-mL microcentrifuge.
- לחלופין, לבצע טיהור על-ידי דיאליזה נגד המאגר אותו.
- החנות GFP מטוהרים ב 4 º C.
7. מרחביות-דף ניתוח, קרינה פלואורסצנטית ג'ל סריקה
- להכין דגימות חלבון לניתוח מרחביות-דף על-ידי הוספת µL 5 חלבונים דוגמת המאגר (ראה טבלה של חומרים) 2 µL של DTT (1.00 מ') כדי µL 13 מטוהרים או גסה, ומתויגים GFP (13.6 מיקרומטר או 0.38 מ"ג/מ"ל). לשימוש ניתוח של oligomeric ה-GFP, ריכוז גבוה יותר של ה-GFP (67.8 מיקרומטר או 1.9 מ"ג/מ"ל). Denature את החלבונים על ידי המקננת בהם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מקום קלטת ג'ל Bis-טריס מרחביות-דף 4-12% (ג'ל שנרכשו, premade מגרות) לתא אלקטרופורזה ולהוסיף מאגר הפעלה (ראה טבלה של חומרים). לטעון את דגימות חלבון, סמן משקל מולקולרי. הפעל את אלקטרופורזה במשך 35-40 דקות ב- 200 וולט.
הערה: יש להימנע בכל חשיפה של הדגימות חלבון לאור על-ידי ביצוע כל התהליכים בחושך, כדי למזער את הלבנת לצילום של המכשיר פלורסנט. - להשתמש בסורק זריחה זריחה הדמיה. לעטוף את ג'ל חלבון מ אלקטרופורזה ומניחים אותו על סורק זריחה. סרוק את הג'ל באמצעות הגדרה של אורך גל המתאים. עבור Cy5.5, לבחור את מצב Cy5 הניתנים שתוכנת הסורק.
- מכתים את הג'ל עם חלבון מסחרי מכתים מגיב.
8. MALDI-TOF MS ניתוח על ידי טריפסין עיכול
- דגירה µL 100 של מטוהרים GFP-E90DOPA (2.2 מ"ג/מ"ל או 80 מיקרומטר) במאגר המכיל 50 מ מ (pH 8.0), טריס-HCl 0.1% (w/v) מרחביות, ו- 25 מ מ DTT ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 h.
- להוסיף 1 µL של Iodoacetamide H2O (רשות העתיקות, 4.0 מ') (500 equiv. ל GFP-E90DOPA) אל הפתרון GFP-E90DOPA מטוהרים (80 מיקרומטר) במאגר אותו. דגירה התערובת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם הגנה מפני אור.
- לעכל את הדגימה GFP-E90DOPA על-ידי הוספת טריפסין (יחס פרוטאז-כדי-המצע-חלבון מטריים [w/w]), דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- לטהר את הדגימה פפטיד מתעכל באמצעות שיטה desalting סטנדרטית עם C18 ספין עמודות.
- לנתח את פפטידים מתעכל על ידי פרוטוקול דיווח עבור לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) באמצעות חומצה אלפא-cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) כמו מטריקס23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת הביטוי עבור שיתוף ישיר DOPA biosynthesized מ TPL מוצג באיור1. הגנים עבור הזוג aa-tRNA, aaRS מפותחת ממוקמות על פלסמיד, גן ה-GFP (GFP-E90TAG) המכילה של codon ענבר במיקום 90 ממוקם פלסמיד אחר כדי להעריך את תיאגוד DOPA על-ידי קרינה פלואורסצנטית GFP. הגן TPL להציב את פלסמיד באותו ביטוי המכיל גן ה-GFP, הביע צורונים כדי למקסם את התשואה של ביוסינטזה DOPA. בעזרת המערכת ביטוי תנאים אופטימליים של הביוסינתזה DOPA מיסוך. התקשורת הצמיחה בשימוש עבור ניסוי הכיל 25 מ מ אמוניה ו פירובט 100 מ מ, עם ריכוזים שונים של catechol (0 - 10 מ מ). ריכוז catechol היה קריטי ביוסינתזה DOPA, תוך ריכוזי אמוניה ו פירובט מעל 25 מ מ, 100 מ מ, בהתאמה, לא השפיע על ביוסינטזה של תיאגוד DOPA. ריכוז אופטימלי של catechol הייתה 10 מ מ, ריכוז של יותר מ 10 מ מ ירד באופן משמעותי את צמיחת תאים חיידקיים בגלל cytotoxicity שלה. במצב האופטימלי זה, היה DOPA biosynthesized על ידי TPL מחומרי המוצא שלו את biosynthesized ש-DOPA סופחה ישירות GFP. המוטציה ביטוי GFP (GFP-E90DOPA) היה טהור ולא נותחו על ידי עמודים מרחביות (איור 2א). ה-GFP באורך מלא היה טהור, שיתוף DOPA אושר ע י ניתוח MALDI-TOF MS (איור 2B). החלבון היה מתעכל עם טריפסין, ניתחנו את השבר פפטיד המכיל DOPA, התוצאה הראתה שיתוף DOPA עם-טיר לזיהוי אין בלעדיות או התאגדות חומצת אמינו טבעיים אחרים. יעילות התאגדות DOPA biosynthesized על ידי TPL היה דומה היעילות התאגדות עם 3 מ מ DOPA, המהווה הריכוז המרבי של DOPA בגלל שלה cytotoxicity19. למרות 10 מ מ catechol הראה רעילות בינונית, צפיפות התאים לאחר 16 שעות של זמן תרבות היה 3-ל גבוה פי ארבעה יותר בנוכחות 3 מ מ DOPA. התשואה חלבון מטוהרים מאת ביוסינטזה היה גבוה פי שלושה מזה של הניסוי באמצעות 3 מ מ DOPA (איור 3).
המוטציה GFP המכיל DOPA שימש חלבון ההטיה. DOPA יכול להיות תחמוצת לתוך L-dopaquinone על ידי חמצון מתון, ו quinone electrophilic מגיב עם alkynes מאומצות, נוקלאופילים עם, כגון תיולים ו אמינים, יכול לשמש bioconjugation (איור 4). GFP-E90DOPA נבדקה SPOCQ cycloaddition על ידי להגיב עם נתרן periodate, ואחריו טיפול עם Cy5.5-ADIBO22. כזאתי SPOCQ נותחה על ידי עמודים מרחביות, זריחה הדמיה (איור 5א). הלהקה פלורסצנטיות אינטנסיבי נצפתה עם טיפול של נתרן periodate, Cy5.5-ADIBO, בעוד שום להקה פלורסצנטיות הוצגה בתגובות שליטה עם GFP-WT או בלי נתרן periodate טיפול, המאשרת את יעילות וספציפיות של התגובה ההטיה עם DOPA גנטית incorporated. בנוסף, שימש את GFP המכילות DOPA חלבון oligomerization. L-dopaquinone מגיב עם ליס או Cys בתוך החלבון אותו, וכתוצאה מכך חלבונים oligomeric. GFP-E90DOPA טופלה עם נתרן periodate oligomerization בוצע במשך 48 שעות ואת התגובה נותחה על ידי עמודים מרחביות בהשוואה דגימת הבקרה ללא נתרן periodate טיפול (איור 5B). ניתוח הנתונים הראה דפוס ברור oligomerization עם להקות חלבון המרווחות באופן שווה על המדגם שטופלו periodate, בזמן המדגם שליטה הראו חלבון שלם בלי להקות נוספות.
איור 1 : ישיר תיאגוד DOPA biosynthesized catechol, פירובט, אמוניה. DOPA הוא biosynthesized על ידי TPL heterologously ביטוי catechol, פירובט, אמוניה במדיום הגידול. הזוג tRNA מפותחת/aaRS עבור DOPA הוא שותף ביטוי לשלב את biosynthesized DOPA החלבון היעד, GFP. הגן TPL הושם תחת מקדם מכוננת לצורך הפעלת ביוסינטזה DOPA לפני שייצור את הביטוי GFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ניתוחים מרחביות-דף ו- MS MALDI-תוף של GFP-E90DOPA מבוטא על ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר מעוצב. (א) GFP-E90DOPA היה בא לידי ביטוי על ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר מעוצב בנוכחות 10 מ מ catechol פירובט 100 מ מ, 25 מ מ אמוניה, ולאחר מכן מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיית זיקה Ni-נ. ת. GFP-WT נותחו גם להשוואה. הדגימות היו מופרדים על ידי Bis-טריס 4% - 12% מרחביות-דף, הג'ל היה מוכתם כחול מבריק Coomassie R-250. (B) ניתוח MALDI-TOF MS של השבר פפטיד המכיל DOPA של עיכול GFP-E90DOPA tryptic. השבר פפטיד של GFP-WT מכיל שאריות של 86-96 (SAMPEGYVQER). Glu ב השבר של GFP-WT מוחלף על-DOPA ב השבר פפטיד של GFP-E90DOPA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : השוואה של תיאגוד biosynthesized DOPA ישירה עם תיאגוד גנטי כללי DOPA. לוחות אלה מראים GFP-E90DOPA לידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר מעוצב וסוכם גנטי בנוכחות 3 מ מ DOPA ללא פירובט נוספים, אמוניה, catechol. (א) התשואות, התקבלו מטוהרים GFP-E90DOPA ו- (B) הצפיפויות תא נמדדו ב 16 h לאחר אינדוקציה החלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : התגובה בסכמה bioconjugation של ה-GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA תחמוצת להמרת DOPA dopaquinone. התגובה של החלבון המכיל dopaquinone עם אלקין מאומצות משיגה חלבון ספציפי לאתר תיוג. הדגירה של החלבון המכיל dopaquinone-ריכוז גבוה במשך זמן רב (48 שעות) גורמת ההטיה עצמית חלבון לייצר חלבון oligomers. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Bioconjugation של מוטציה חלבונים המכילים DOPA. (א) SPOCQ תגובות של חלבון המכיל DOPA עם אלקין מאומצות, ADIBO-Cy5.5. GFP-WT ו- GFP-E90DOPA שטופלו נתרן periodate, הגיבו ADIBO-Cy5.5 עבור 60 דקות. התגובות נותחו על ידי עמודים מרחביות, מוכתם Coomassie (למעלה), מוצגות תמונות קרינה פלואורסצנטית (למטה). Oligomerization (B) של ה-GFP-E90DOPA. GFP המכילות DOPA טופלה עם נתרן periodate, מודגרות במשך 48 שעות. תערובת התגובה נותחה על ידי עמודים מרחביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב פרוטוקול זה, מתוארים ביוסינטזה של ישיר תיאגוד DOPA. לתא חיידקי שנמצא בשימוש בשיטה זו יכול לסנתז חומצה אמינית נוספים ולהשתמש בו בתור הבניין לא טבעי סינתזה של חלבון. שילוב גנטי של חומצות אמינו לא טבעי כבר טכנולוגיה המפתח לפיתוח אורגניזם לא טבעי עם קוד גנטי המורחב. עם זאת, שיטה זו כבר שלם מבחינה טכנית, הוא והידועה כדי לשפר את יעילות שיתוף ולצמצם את ההפרעות למערכות תרגום אנדוגני. לאחרונה, התקדמות משמעותית בשיטה הושגו על ידי הקצאה מחדש codons24,25 חומצות אמינו לא טבעיות, הנדסת רכיבים translational אורתוגונלית26,27,28 ,29. בנוסף לשיפורים הללו, המערכת המתוארת כאן מציע יכולת נוספת אורגניזם לא טבעי עם קוד גנטי המורחב: ביוסינטזה של חומצת אמינו לא טבעי. יכולת זו מעניקה המערכת לא טבעי יותר עצמאות כמו אורגניזם עם רפרטואר גנטי המורחב. יתר על כן, DOPA מראה רעילות בינונית על המתח חיידקי בשימוש בשיטה זו, ו- 3 מ מ DOPA, גדילת התאים הקטינה באופן משמעותי, אשר הביא התשואה חלבון נמוכה. באמצעות מערכת התאגדות ישירה, רעילות צומצם, חלבון התשואה גדל פי שלושה.
המוטציה aaRS המשמש עבור שיתוף גנטי DOPA יש יעילות בינונית ונאמנות, משלב Tyr בריכוז נמוך של DOPA. 18 . לפיכך, ביוסינטזה של DOPA תאים חיידקיים צריך להיות מספיק יעיל כדי למנוע Tyr התאגדות. ביוסינטזה DOPA מאת TPL מ catechol, אמוניה ו פירובט הוא תגובה הפיכה, ריכוזים גבוהים של חומרי המוצא יש צורך הביוסינתזה יעיל. עם זאת, catechol אינו יכול לשמש מעל 10 מ מ כי זה רעיל המתח בקטריאלי בשימוש בפרוטוקול זה. ריכוז DTT חשוב גם פרוטוקול זה. DOPA מראה שלה רעילות כאשר הוא מומר L-dopaquinone, DTT מוסיפים מדיום הגידול להקטין את קצב חימצון. הבחנו בירידה צמיחת תאים כאשר הריכוז DTT היה מעל 300 מיקרומטר. לכן, עבור ביוסינטזה אופטימלית וגם תיאגוד DOPA, הרכיבים (במיוחד catechol ו- DTT) תרבות בינוני אמור לשמש בריכוזים המתאימים כמתואר פרוטוקול זה.
פרוטוקול זה מתאר גם יישומים של חלבונים המכילים DOPA עבור חלבון ספציפי לאתר ההטיה. L-dopaquinone שנוצר על ידי החמצון של DOPA ביעילות מגיב עם אלקין מאומצות מקושר בדיקה ביוכימית. כזאתי cycloaddition בדרך כלל מהיר יותר תגובות תוספת נוקלאופילית על-ידי אמינים או תיולים. למרות זאת, החמצון של DOPA צריך להתבצע בנוכחות חלבון המכיל DOPA והן של אלקין מאומצות, כדי למזער את התוספת נוקלאופילית על ידי נוקלאופילים עם-החלבון. לכן, הסדר של התוספת של ריאגנטים התגובה הזו היא קריטית.
חומצות אמינו לא טבעיות רבות זמינות עבור חלבון ההטיה, ולהשיג כמה מהם על קצב התגובה מהירה, ההטיה מעולה יעילות30,31,32,33. החומצות הללו מכילים biorthogonal קבוצות פונקציונליות כגון azides, alkynes, alkenes מאומצות או alkynes ו- tetrazines. למרות שהם שימושיים חלבון ספציפי לאתר ההטיה, רבים מהם הם יקרים או מסחרית נגיש, אשר מגביל את היישומים שלהם, במיוחד באלה הדורשים חלבונים בקנה מידה גדול. לכן, ביוסינטזה של DOPA זול חומרי המוצא, התאגדות ישירה שלה יהיה שימושי עבור תרופות ותעשייתיים יישומים המחייבים חלבונים מוטציה בקנה מידה גדול המכיל בדיקה ביוכימית או תרופה (נוגדן-סמים המספר המשלים, ADC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הכללית הגבול (ה-NRF-2015M3A6A8065833), יסוד מדע מחקר התוכנית (2018R1A6A1A03024940) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
- Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
- Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
- Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
- Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
- Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
- Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
- Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
- Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
- Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
- Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
- Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
- Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
- Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
- Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
- Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
- Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
- Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
- Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
- Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
- Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
- Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
- Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
- Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
- Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
- Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).
