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Biochemistry

Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a incorporação genética de L-dihidroxifenilalanina biossintetizados a partir de matérias-primas simples e sua aplicação à conjugação de proteínas.

Abstract

L-dihidroxifenilalanina (DOPA) é um aminoácido encontrado na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Devido às suas propriedades bioquímicas particulares, o aminoácido tem múltiplos usos em aplicações bioquímicas. Este relatório descreve um protocolo para a constituição genética de biossintetizados DOPA e sua aplicação à conjugação de proteínas. DOPA é biossintetizados por uma tirosina fenol-liase (TPL) de catecol, piruvato e amônia, e o aminoácido é diretamente incorporado em proteínas pelo método de incorporação genética usando um aminoacil-tRNA evoluída e par de aminoacil-tRNA sintetase. Este sistema de incorporação directa eficientemente incorpora DOPA com pouca incorporação de outros aminoácidos naturais e com melhor rendimento de proteína do que o anterior sistema de incorporação genética para DOPA. Conjugação de proteínas com proteínas contendo DOPA é eficiente e site-specific e mostra sua utilidade para diversas aplicações. Este protocolo fornece os cientistas de proteína com procedimentos detalhados para o eficiente biossíntese de proteínas mutantes contendo DOPA em sites desejados e sua conjugação para aplicações industriais e farmacêuticas.

Introduction

DOPA é um aminoácido envolvido na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Este aminoácido é sintetizado a partir de Tyr tirosina hidroxilase e oxigênio molecular (O2)1. Porque DOPA é um precursor da dopamina e pode permear a barreira sangue - cérebro, ela tem sido usada no tratamento da doença de Parkinson2. DOPA também é encontrada em proteínas de adesão de mexilhão (mapas), que são responsáveis para as propriedades adesivas de mexilhões em circunstâncias molhadas3,4,5,6,7. Tyr é inicialmente codificado nas posições onde DOPA é encontrada em mapas e em seguida é convertida em DOPA pela tyrosinases8,9. Devido às suas propriedades bioquímicas interessantes, DOPA tem utilizou uma variedade de aplicações. O grupo de dihydroxyl de DOPA é quimicamente propenso à oxidação, e o aminoácido é facilmente convertido em L-dopaquinone, um precursor de melaninas. Devido à sua alta eletrofilicidade, L-dopaquinone e seus derivados utilizámos para reticulação e conjugação com tióis e aminas10,11,12,13. 1,2-quinonas também podem funcionar como um dieno para reações de cicloadição e têm sido usados para bioconjugation por estirpe-promovido oxidação controlada cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadição14. Além disso, o grupo de dihydroxyl pode quelato íons metálicos como Fe3 + e Cu2 +e proteínas contendo DOPA têm sido utilizadas para a entrega da droga e do íon do metal sensoriamento15,16.

DOPA foi geneticamente incorporado em proteínas usando um aminoacil-tRNA ortogonal (aa-tRNA) e aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) par17 e usado para proteína conjugação e reticulação10,11, 12,13. Neste relatório, são descritos os resultados experimentais e protocolos para a constituição genética de DOPA biossintetizados de matérias-primas baratas e suas aplicações para bioconjugation. DOPA é biossintetizados usando um TPL e a partir de catecol, piruvato e amônia em Escherichia coli. O biossintetizados DOPA é diretamente incorporado proteínas expressando um par aa-tRNA e aaRS evoluiu para DOPA. Além disso, a proteína biossintetizados contendo DOPA site-specifically está conjugada com uma sonda fluorescente e quitosana para produzir oligómeros de proteína. O presente protocolo será útil para os cientistas de proteína, a biossintetize proteínas mutantes contendo DOPA e conjugar as proteínas com testes bioquímicos ou drogas para aplicações industriais e farmacêuticas.

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Protocol

1. plasmídeo construção

  1. Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-duplo TPL-GFP-WT) que expressa o gene da TPL de Citrobacter freundii sob o controle de um promotor constitutivo e o gene da proteína verde fluorescente (GFP) com seus6-etiqueta sob o controle da promotor de araBAD. Para pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, substitua o códon para o site (E90) da DOPA com um códon âmbar (TAG), usando um protocolo de mutagenesis local-dirigido. Os detalhes para a construção deste plasmídeo foi descrito em nosso anterior relatório18.
  2. Construa um tRNA/aaRS-expressando plasmídeo (pEVOL-DHPRS2)18,19 para a constituição genética de DOPA. pEVOL é um vetor de especial do plasmídeo expressando duas cópias dos genes aaRS com promotores independentes, e as informações detalhadas do plasmídeo são descritas em um anterior relatório19.
  3. Use kits de preparação de plasmídeo comercialmente disponível para obter alta pureza DNAs plasmideo. Verificar a pureza dos DNAs preparados usando electroforese do gel do agarose, se necessário.

2. cultura preparação

  1. Electroporation
    1. Uso o electro-competente Escherichia coli DH10β tensão para esta experiência. Adicione 1 µ l de cada plasmídeo (pEVOL-DHPRS2 e pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) a 20 µ l de células competentes. Misture-os delicadamente para fazer uma mistura homogênea, com uma pipeta.
    2. Transfira a mistura para as cubetas de eletroporação. Coloca a cubeta na câmara de eletroporação. Empurrar a cubeta para a câmara para fazer firme cubeta-câmara entre em contato.
    3. Choque da cubeta, usando 25 µF e 2,5 kV para cubetas de 0,1 cm.
    4. Adicionar 1 mL de caldo super ideal escaldado (SOC), contendo 2% (p/v) triptona, 0,5% (p/v) de levedura extrato, NaCl de 10 mM, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2e glicose de 20 mM, para a cubeta e transfira as células para um tubo de cultura. Resgate as células incubando-os durante 1 h a 37 ° C, com agitação.
    5. Espalhe 10-100 µ l de células de resgatados em uma placa de ágar de caldo (LB) lisogenia contendo 35 cloranfenicol µ g/mL e 100 µ g/mL ampicilina. Incube as células a 37 ° C durante 16 h.
  2. Preparação de cultura starter
    1. Inocule uma única colônia transformada em 5 mL de meio LB contendo antibióticos. Incube a colônia por 12 h a 37 ° C, com agitação.

3. expressão e purificação de GFP-E90DOPA por um sistema biossintético

  1. Expressão de GFP-E90DOPA por um sistema biossintético
    1. Transferir a cultura starter (2 mL) para 100 mL de PA-5052 médio20 (50mm Na2HPO4, 50mm KH2PO4, 25mm [NH4]2para4, 2mm MgSO4, 0,1% [w/v] traçar metais, glicerol 0,5% [w/v], 0,05% [w/v] de glicose e aminoácidos 5% [w/v] [pH 7,25]) contendo 35 cloranfenicol µ g/mL, 100 ampicilina µ g/mL, piruvato de 100mm, catecol 10mm, 25mm da amônia e 300 µM ditiotreitol (DTT) seguido por uma incubação a 30 ° C, com agitação.
    2. Adicionar 2 mL de 0,2% (p/v), L-arabinose quando a densidade óptica (OD) em 550 nm atinge 0,8. Incube a amostra para 12 horas a 30 ° C, com agitação.
    3. Gire para baixo as células a 11.000 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e congelar o centrifugado a-80 ° C.
  2. Lise celular
    1. Descongelar o centrifugado no gelo e ressuspender as células em 10 mL de tampão de Lise contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 10 mM e 300 mM de NaCl.
    2. Proceda à sonicação as ressuspensa células no gelo durante 10 min. amplitude de sonication de 80% de utilização com um pulso de 25 s no e 35 s fora.
    3. Spin para baixo a célula lisada a 18.000 x g a 4 ° C, durante 15 min. transferir o sobrenadante para um tubo fresco para a purificação e descartar a pelota.
  3. Cromatografia de afinidade NI-NTA
    1. Adicionar resina de Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) (300 µ l de suspensão de resina para uma cultura de 100 mL) de líquido sobrenadante e vincular as proteínas à resina Ni-NTA a 4 ° C, agitando suavemente a suspensão por 1h.
    2. A suspensão de transferência para uma coluna de polipropileno e lave a resina 3 x com 5 mL de tampão de lavagem, contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 20 mM e 300 mM de NaCl.
    3. Eluir as proteínas 3 x com 300 µ l de tampão de eluição contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 250 mM e 300 mM de NaCl.
    4. Determinar a concentração de proteína medindo a absorbância em 280 nm. O coeficiente de extinção (24.630 M-1cm-1) para E90DOPA-GFP em 280 nm foi calculado por uma calculadora de coeficiente de extinção de proteína (por exemplo, https://web.expasy.org/protparam/) e a extinção de forma independente medida coefficiennt (2630 M-1cm-1) para DOPA. Como um método alternativo, use o Bradford proteína ensaio21 para a determinação da concentração de proteína.

4. oligomerização de GFP purificado-E90DOPA

  1. Adicionar 1 µ l de sódio periodato de H2O (6mm) (1.0 equiv a GFP-E90DOPA) para uma solução de 20 µ l de GFP-E90DOPA (300 µM) em um tampão fosfato contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl.
  2. Permitir que a reação de oligomerização proceder a 25 ° C, durante 48 h.
  3. Analise a mistura de reação por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio) (SDS-PAGE), conforme descrito na etapa 6.

5. conjugação de GFP-E90DOPA com uma sonda Alkyne por SPOCQ

  1. Adicionar 1 µ l do azadibenzocyclooctyne Cy5.5-lig (Cy5.5-Andrade)22 em H2O (4,0 mM) (10 equiv a GFP-E90DOPA) para uma solução de 20 µ l de GFP-E90DOPA (20 µM) em um tampão fosfato contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl.
  2. Adicionar 1 µ l de sódio periodato de H2O (400 µM) (1.0 equiv a GFP-E90DOPA) a mistura de reacção.
  3. Permitir que a reação de SPOCQ, proceder-se a 25 ° C, durante 1 h. Se for usada uma sonda sensível à luz, cobri o recipiente de reação com folha de alumínio.

6. purificação da GFP rotulada

  1. Dilua a mistura reacional SPOCQ pela adição de um tampão de fosfato, contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl, até 500 µ l.
  2. Transferi a solução diluída para uma coluna de rotação do filtro centrífugo. Centrifugue a coluna de centrifugação a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min e descartar o escoamento. Repita este passo 3 x para remover qualquer excesso Cy5.5-Andrade.
  3. Transferi a amostra purificada da coluna de rotação para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge.
  4. Em alternativa, efectuar uma purificação pela diálise contra a mesma reserva.
  5. Armazenar o GFP purificado a 4 ° C.

7. SDS-PAGE análise e digitalização de Gel de fluorescência

  1. Preparar amostras de proteínas para análise de SDS-PAGE, adicionando 5 µ l de tampão de amostra de proteína (ver Tabela de materiais) e 2 µ l de TDT (1,00 M), para µ l 13 de purificado, ou bruto, rotulado de GFP (13,6 µM ou 0,38 mg/mL). Para uma análise de GFP oligoméricas, use uma concentração mais elevada de GFP (67,8 µM ou 1,9 mg/mL). Desnature as proteínas incubando-os a 95 ° C por 10 min.
  2. Coloque uma fita de gel de SDS-PAGE de Bis-Tris 4% - 12% (gel comprado, do premade cassettes) para a célula de eletroforese e adicionar um buffer de execução (veja a Tabela de materiais). Carrega as amostras da proteína e um marcador de peso molecular. Execute a eletroforese por 35-40 min a 200 V.
    Nota: Evite qualquer exposição das amostras de proteínas à luz através da realização de todos os processos no escuro, para minimizar a foto-branqueamento da sonda fluorescente.
  3. Utilize um scanner de fluorescência para a imagem latente de fluorescência. Enrole um gel de eletroforese de proteína e colocá-lo em um scanner de fluorescência. Digitalizar o gel usando uma configuração de comprimento de onda apropriado. Para Cy5.5, selecione o modo de Cy5 fornecido no software do scanner.
  4. Manche o gel com uma proteína comercial reagente de coloração.

8. MALDI-TOF MS análise por digestão de tripsina

  1. Incube a 100 µ l de GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL ou 80 µM) em um buffer contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (p/v) SDS purificado e 25 mM DTT a 60 ° C, durante 1 h.
  2. Adicione 1 µ l de Iodoacetamide em H2O (IAA, 4.0 M) (500 equiv a GFP-E90DOPA) para a solução de GFP-E90DOPA purificada (80 µM) a mesma reserva. Incube a mistura a 25 ° C por 30 min com proteção da luz.
  3. Digerir a amostra de GFP-E90DOPA adicionando tripsina (proporção 1: 100 de protease-para-substrato-proteína [w/w]) e incubar a mistura a 37 ° C por 4 h.
  4. Purifica a amostra digerida peptídeo usando um método padrão do desalting com colunas de rotação C18 .
  5. Analise os peptídeos digeridos pelo protocolo relatado por laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) usando ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) como uma matriz de23.

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Representative Results

O sistema de expressão para a incorporação directa do DOPA biossintetizados de um TPL é mostrado na Figura 1. Os genes para o par aa-tRNA e aaRS evoluído são colocados em um plasmídeo e o gene da GFP (GFP-E90TAG) que contém um códon âmbar na posição 90 situa-se em mais um plasmídeo para avaliar a incorporação de DOPA por fluorescência de GFP. O gene TPL é colocado no mesmo plasmídeo de expressão contendo o gene da GFP e constitutivamente expressa para maximizar o rendimento da biossíntese DOPA. Usando este sistema de expressão, condições ideais para a biossíntese DOPA foram projectadas. A mídia de crescimento utilizada para este experimento contida 25 mM amônia e piruvato de 100 mM, com concentrações variando de catecol (0 - 10 mM). A concentração de catecol foi essencial para a biossíntese DOPA, enquanto as concentrações de amônia e piruvato mais de 25 mM e 100 mM, respectivamente, não afetou a biossíntese e a incorporação de DOPA. A concentração óptima de catecol foi de 10 mM, e uma concentração de mais de 10 mM, diminuiu significativamente o crescimento de células bacterianas devido sua citotoxicidade. Nesta condição ideal, DOPA foi biossintetizados pelo TPL de suas matérias-primas e o biossintetizados que dopa foi diretamente incorporada GFP. O mutante expressado GFP (GFP-E90DOPA) foi purificado e analisado por SDS-PAGE(Figura 2). O longa-metragem GFP foi purificado, e a incorporação de DOPA foi confirmada pela análise de MALDI-TOF MS (Figura 2B). A proteína foi digerida com tripsina, o fragmento de peptídeo contendo DOPA foi analisado e o resultado mostrou a incorporação exclusiva de DOPA com Tyr não detectável ou outra aminoácido natural de incorporação. A eficiência da incorporação da DOPA biossintetizados pelo TPL foi semelhante para a eficiência da incorporação com DOPA, que é a concentração máxima de DOPA por causa de sua citotoxicidade19de 3 mM. Apesar de catecol 10mm mostrou moderada toxicidade, a densidade celular após 16 h de tempo de cultura foi-três a quatro vezes maior do que na presença de 3mm DOPA. O rendimento de proteína purificada pela biossíntese foi três vezes superior do experimento usando 3mm DOPA (Figura 3).

O mutante GFP contendo DOPA foi usado para conjugação de proteínas. DOPA pode ser oxidado em L-dopaquinone por oxidantes suaves, e a eletrofílica quinona reage com alcinos tensas e nucleófilos, como tióis e aminas e pode ser usada para bioconjugation (Figura 4). GFP-E90DOPA foi testado por cicloadição SPOCQ por reagir com o sódio periodato, seguido de um tratamento com Cy5.5-Andrade22. Esta reação de SPOCQ foi analisada por SDS-PAGE e fluorescência de imagem (Figura 5A). A banda de fluorescência intensa observou-se com um tratamento de sódio periodato e Cy5.5-Andrade, enquanto nenhuma faixa de fluorescência foi mostrada nas reações de controle com GFP-WT ou sem um sódio periodato tratamento, confirmando a eficiência e a especificidade do reação de conjugação com o DOPA geneticamente incorporado. Além disso, o GFP DOPA-contendo foi usado para oligomerização de proteína. L-dopaquinone reage com Lys ou Cys na mesma proteína, resultando em proteínas oligoméricas. GFP-E90DOPA foi tratada com periodato de sódio e a oligomerização foi realizada por 48 h, e a reação foi analisada por SDS-PAGE, em comparação com uma amostra de controle, sem periodato de sódio um tratamento (Figura 5B). A análise mostrou um padrão claro oligomerização com bandas de proteína igualmente espaçados, para a amostra tratada com periodate, enquanto a amostra de controle mostrou a proteína intacta sem qualquer outras bandas.

Figure 1
Figura 1 : Direto de incorporação da DOPA biossintetizados de catecol, piruvato e amônia. DOPA é biossintetizados pelo TPL heterologously expressa de catecol, piruvato e amônia em meio de crescimento. O par de tRNA/aaRS evoluiu para DOPA é co expressado para incorporar o biossintetizados DOPA a proteína alvo, GFP. O gene TPL foi colocado sob um promotor constitutivo a fim para começar a biossíntese DOPA antes de induzir a expressão de GFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análises SDS-PAGE e MALDI-TOF MS de GFP-E90DOPA expressado pelo sistema projetado biossintético. (A) GFP-E90DOPA foi expressa pelo sistema biossintético projetado na presença de catecol 10mm, piruvato de 100mm e amônia de 25 mM e então purificada por cromatografia de afinidade Ni-NTA. GFP-WT também foi analisado para comparação. As amostras foram separadas por Bis-Tris 4% - 12% SDS-PAGE, e o gel estava manchado com azul de Coomassie brilhante R-250. (B) análise de MALDI-TOF MS do fragmento peptídeo contendo DOPA de digestão tryptic de GFP-E90DOPA. O fragmento de peptídeo de GFP-WT contém resíduos de 86-96 (SAMPEGYVQER). A Glu no fragmento de GFP-WT é substituído com DOPA no fragmento de peptídeo de GFP-E90DOPA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Comparação de uma incorporação direta de biossintetizados DOPA com uma incorporação de genética geral da DOPA. Estes painéis mostram GFP-E90DOPA expressado pelo sistema biossintético projetado e a incorporação genética na presença de 3mm DOPA sem adicional piruvato, amônia e catecol. (A) a proteína rendimentos foram obtidos de purificado GFP-E90DOPA e (B) as densidades de célula foram medidas a 16 h após a indução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquema da reação da bioconjugation de GFP-E90DOPA. GFP-E90DOPA é oxidado para converter DOPA em dopaquinone. A reação da proteína com um alquino tensa contendo dopaquinone alcança a rotulagem específica do site da proteína. A incubação da proteína dopaquinone, contendo em uma concentração elevada por um longo tempo (48 h) faz com que o Self conjugação de proteína produzir oligómeros de proteína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Bioconjugation das proteínas mutantes contendo DOPA. (A) SPOCQ reações de uma proteína contendo DOPA com um alquino tensa, Andrade-Cy5.5. GFP-WT e GFP-E90DOPA foram tratados com sódio periodato e reagiu com Andrade-Cy5.5 por 60 min. As reações foram analisadas por SDS-PAGE e manchadas de Coomassie (topo) e são mostradas imagens de fluorescência (parte inferior). (B) oligomerização de GFP-E90DOPA. O GFP contendo DOPA foi tratada com sódio periodato e incubadas durante 48 h. A mistura de reação foi analisada por SDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste protocolo, a biossíntese e incorporação directa do DOPA são descritos. A célula bacteriana usada neste método pode sintetizar um aminoácido adicional e usá-lo como um bloco de construção natural para a síntese de proteína. A incorporação genética de aminoácidos não naturais tem sido uma tecnologia-chave para o desenvolvimento do organismo natural com um código genético expandido. No entanto, este método tem sido tecnicamente incompleto e está sendo modificado para melhorar a eficiência da incorporação e minimizar a perturbação para sistemas de tradução endógena. Recentemente, se tem conseguidos avanços significativos no método reatribuindo códons24,25 para aminoácidos não naturais e engenharia componentes de translação ortogonal26,27,28 ,29. Além dessas melhorias, o sistema descrito aqui oferece outro recurso para um organismo natural com um código genético expandido: biossíntese de um aminoácido natural. Esse recurso dá o sistema natural mais independência como um organismo com um repertório genético expandido. Além disso, DOPA mostra moderada toxicidade na estirpe bacteriana usado neste método e em 3 mM DOPA, crescimento celular significativamente reduzido, que resultou em rendimento de baixa proteína. Usando o sistema de incorporação directa, toxicidade foi reduzida e o rendimento de proteína aumentou triplo.

O mutante aaRS, utilizado para a constituição genética de DOPA tem fidelidade e eficiência moderada e incorpora Tyr em uma baixa concentração de DOPA. 18 portanto, a biossíntese de DOPA em células bacterianas deve ser eficiente o suficiente para evitar a incorporação de Tyr. A biossíntese DOPA pela TPL de piruvato, amônia e catecol é uma reação reversível, e altas concentrações das matérias-primas são necessárias para uma eficiente biossíntese. No entanto, o catecol não pode ser usado mais de 10 mM porque é tóxico para a cepa bacteriana utilizada no presente protocolo. A concentração de TDT é também importante neste protocolo. DOPA mostra sua toxicidade quando é convertido em L-dopaquinone, e TDT é adicionado em um meio de reduzir a taxa de oxidação. Observamos uma diminuição no crescimento de células quando a concentração de TDT foi mais de 300 µM. Portanto, para uma óptima biossíntese e incorporação de DOPA, os componentes (especialmente catecol e TDT), por meio de cultura devem ser usados em concentrações adequadas conforme descrito neste protocolo.

Este protocolo descreve também aplicações de DOPA-contendo proteínas de conjugação de proteínas específicas do local. L-dopaquinone gerada pela oxidação de DOPA eficientemente reage com um alquino tenso, ligado a uma sonda de bioquímica. Esta reação de cicloadição é geralmente mais rápida do que as reações de adição nucleofílica de aminas ou tióis. Não obstante, a oxidação do DOPA deve ser efectuada na presença de uma proteína DOPA-contendo tanto um alquino tenso, para minimizar a adição nucleofílica por nucleófilos na proteína. Portanto, a ordem de adição dos reagentes para esta reação é fundamental.

Muitos aminoácidos não naturais estão disponíveis para a conjugação de proteína, e alguns deles alcançam uma taxa de reação rápida e conjugação de excelente eficiência30,31,32,33. Estes aminoácidos contêm biorthogonal grupos funcionais tais como azidas, alcinos, tensas alcenos ou alcinos e tetrazines. Embora eles são úteis para conjugação de proteínas específicas do local, muitos deles são caros ou comercialmente inacessíveis, que limita suas aplicações, especialmente naqueles que requerem proteínas em larga escala. Portanto, a biossíntese de DOPA de matérias-primas baratas e sua incorporação directa será útil para aplicações farmacêuticas e industriais, que requerem em grande escala proteínas mutantes contendo uma sonda bioquímica ou uma droga (anticorpo-fármaco conjugado, ADC).

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa Global de pesquisa de fronteira (NRF-2015M3A6A8065833), e a ciência pesquisa programa básico (2018R1A6A1A03024940) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

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References

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Bioquímica edição 138 DOPA constituição genética biossíntese tirosina fenol-liase conjugação de proteína cicloadição estirpe-promovido oxidação controlada cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ)
Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína
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Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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