Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد لديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) وتطبيقه على تصريف البروتين

Published: August 24, 2018 doi: 10.3791/58383
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry, Sogang University

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد ل ديهيدروكسيفينيلالانيني من المواد البداية بسيطة وتطبيقه على تصريف البروتين.

Abstract

لام-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) هو من الأحماض الأمينية الموجودة في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. بسبب خصائصه البيوكيميائية خاصة، قد الحمض الأميني متعددة الاستخدامات في التطبيقات البيوكيميائية. ويصف هذا التقرير وضع بروتوكول لإدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد دوبا وتطبيقه على تصريف البروتين. دوبا بيوسينثيسيزيد تيروزين فينول-لياز (لافوري) من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا، ومباشرة أدمجت الأحماض الأمينية في البروتينات بواسطة الأسلوب إدراج الوراثية استخدام الحمض الريبي النووي النقال-أمينواسيل تطورت وزوج أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز. ويتضمن النظام الإدماج المباشر هذا كفاءة دوبا مع إدخال القليل من الأحماض الأمينية الطبيعية الأخرى ومع المحصول البروتين أفضل من النظام السابق لإدراج الوراثية دوبا. تصريف البروتين مع البروتينات المحتوية على دوبا هو الكفاءة والمعينة للموقع وتظهر فائدته لمختلف التطبيقات. يوفر هذا البروتوكول العلماء البروتين مع إجراءات مفصلة للتركيب الحيوي كفاءة متحولة البروتينات التي تحتوي على دوبا في المواقع المطلوبة وعلى التصريف للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.

Introduction

دوبا هو من الأحماض الأمينية المتورطين في التركيب الحيوي الكاتيشولامين في الحيوانات والنباتات. هذه الأحماض الأمينية يتم تصنيعه من صور hydroxylase التيروزين والأوكسجين الجزيئي (س2)1. لأن دوبا سليفة الدوبامين، ويمكن أن تتخلل حاجز الدم في الدماغ، فقد استخدمت في علاج مرض باركنسون2. كما تم العثور على دوبا في بلح البحر التصاق البروتينات (خرائط)، التي المسؤولة عن خصائص لاصقة من بلح البحر في ظروف رطبة3،،من45،،من67. في البداية يتم ترميز طير في المواقف حيث وجدت في الخرائط دوبا ويتم تحويلها بعد ذلك إلى دوبا تيروسيناسيس8،9. بسبب خصائصه البيوكيميائية مثيرة للاهتمام، وقد استخدمت دوبا في مجموعة متنوعة من التطبيقات. مجموعة ديهيدروكسيل دوبا كيميائيا عرضه للأكسدة، والأحماض الأمينية يتم تحويلها بسهولة إلى L-دوباكوينوني، مقدمة ميلانينس. نظراً لأن اليكتروفيليسيتي عالية، قد استخدمت لدوباكوينوني ومشتقاته crosslinking والاقتران مع ثيولس والامينات10،11،،من1213. 1، 2-كوينونس يمكن أن تعمل أيضا ديين لردود فعل سيكلواديشن واستخدمت بيوكونجوجيشن التي تروج لها سلالة تسيطر على أكسدة سيكلوكتيني-1، 2-كينون (سبوكق) سيكلواديشن14. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة ديهيدروكسيل يمكن يخلب الأيونات المعدنية مثل الحديد3 + و Cu2 +، والبروتينات التي تحتوي على دوبا وقد استخدمت لإيصال الأدوية، وأيون معدني الاستشعار عن15،16.

تم دمج البروتينات باستخدام متعامد أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال (أإ-الحمض الريبي النووي النقال) وأمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال سينثاتيز (aaRS) زوج17 دوبا وراثيا واستخدامه للبروتين التصريف و crosslinking10،11، 12،13. ويرد في هذا التقرير، النتائج التجريبية والبروتوكولات لإدراج بيوسينثيسيزيد دوبا من مواد انطلاق رخيصة وتطبيقاتها في بيوكونجوجيشن الوراثية. دوبا بيوسينثيسيزيد استخدام لافوري، وبدءا من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا في الإشريكيّة القولونية. بيوسينثيسيزيد دوبا تدمج مباشرة البروتينات بالإعراب عن زوج aa-الحمض الريبي النووي النقال و aaRS تطورت على دوبا. وبالإضافة إلى ذلك، بيوسينثيسيزيد البروتين الذي يحتوي على دوبا هو سيتيسبيسيفيكالي مترافق مع المسبار الفلورسنت وكروسلينكيد لإنتاج البروتين ليغومرات. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة للعلماء البروتين، لبروتينات متحولة biosynthesize المحتوية على دوبا ومترافق البروتينات مع تحقيقات البيوكيميائية أو المخدرات للتطبيقات الصناعية والمستحضرات الصيدلانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-بلازميد البناء

  1. بناء بلازميد تعبير (بباد-ثنائي-لافوري-التجارة والنقل-WT) الذي يعبر عن الجينات لافوري من المضادات فريوندي الخاضعة لسيطرة أحد المروجين التأسيسي والجينات البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) مع له6-العلامة تحت السيطرة مروج أراباد. بباد--المزدوج-لافوري-التجارة والنقل-E90TAG، تحل محل كودون للموقع (E90) من دوبا مع كودون العنبر (العلامة)، استخدام بروتوكول الطفرات الموجهة من الموقع. ووصف تفاصيل لتشييد هذا بلازميد في لدينا التقرير السابق18.
  2. بناء الحمض الريبي النووي النقال/aaRS-وإذ يعرب عن بلازميد (بيفول-DHPRS2)18،19 لإدراج الوراثية دوبا. بيفول ناقل بلازميد خاص الإعراب عن نسختين من الجينات aaRS مع المروجين المستقل، والمعلومات المفصلة بلازميد يرد في تقرير سابق19.
  3. استخدام مجموعات إعداد بلازميد المتاحة تجارياً للحصول على درجة نقاء عالية بلازميد السلطات الوطنية المعينة. فحص نقاء المعينة بريبيد باستخدام [اغروس] هلام التفريد، إذا لزم الأمر.

2-الثقافة إعداد

  1. انهانسر
    1. سلالة DH10β كولاي استخدام الكهربائية المختصة لهذه التجربة. إضافة 1 ميليلتر من كل بلازميد الحمض النووي (بيفول-DHPRS2 وبباد-ثنائي-لافوري-التجارة والنقل-E90TAG) إلى 20 ميليلتر من الخلايا المختصة. مزجها برفق لجعل خليط متجانس، باستخدام ماصة.
    2. نقل الخليط إلى الترعة انهانسر. مكان ومبومو في قاعة انهانسر. دفع في ومبومو إلى الدائرة لجعل شركة ومبومو-دائرة الاتصال.
    3. صدمة ومبومو، استخدام 25 µF و 2.5 كيلو فولت للترعة 0.1 سم.
    4. أضف 1 مل مرق الأمثل سوبر بريوارميد (شركة نفط الجنوب)، التي تحتوي على تريبتوني 2% (w/v)، 0.5% (w/v) الخميرة استخراج 10 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 10 مم مجكل2والجلوكوز 20 مم، إلى ومبومو، ونقل الخلايا إلى أنبوب ثقافة. إنقاذ الخلايا التي تفرخ منهم ح 1 في 37 درجة مئوية مع الهز.
    5. انتشار 10-100 ميليلتر من خلايا تم إنقاذهم على طبق أجار مرق (رطل) ليسوجيني التي تحتوي على 35 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول و 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 16.
  2. إعداد ثقافة كاتب
    1. تطعيم مستعمرة تحول واحد في 5 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية. احتضان هذه المستعمرة ح 12 في 37 درجة مئوية مع الهز.

3-التعبير وتنقية للتجارة والنقل-E90DOPA بنظام السكروز

  1. التعبير للتجارة والنقل-E90DOPA بنظام السكروز
    1. نقل ثقافة كاتب (2 مل) إلى 100 مل من السلطة الفلسطينية-5052 متوسطة20 (50 مم نا2هبو4، 50 مم خ2ص4، 25 مم [NH4]2حتى4، 2 مم MgSO4، 0.1% [w/v] تتبع المعادن، والغليسيرول 0.5% [w/v]، 0.05% [w/v] الجلوكوز، والأحماض الأمينية 5% [w/v] [الأس الهيدروجيني 7.25]) التي تحتوي على 35 الكلورامفينيكول ميكروغرام/مل، 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، بيروفات 100 مم، الكاتيتشول 10 ملم، والأمونيا 25 مم، وديثيوثريتول 300 ميكرون (DTT) متبوعاً حضانة عند 30 درجة مئوية مع الهز.
    2. إضافة 2 مل من 0.2% (w/v) لارابينوز عندما الكثافة البصرية (OD) عند 550 نانومتر تصل إلى 0.8. احتضان العينة ح 12 في 30 درجة مئوية مع الهز.
    3. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 11,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية، وتجميد بيليه الخلية في-80 درجة مئوية.
  2. تحلل الخلية
    1. ذوبان الجليد بيليه الخلية على الجليد وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من تحلل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 10 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    2. Sonicate الخلايا ريسوسبينديد على الجليد لأدنى 10 استخدام 80% sonication السعة مع نبض من 25 s s على و 35 قبالة.
    3. تدور أسفل الخلية في 18,000 س ز في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة نقل المادة طافية على أنبوب جديد لتنقية وتجاهل بيليه.
  3. ني-جاتا التقارب اللوني
    1. إضافة الراتنج (حمض نيتروتراياكتيك) ني-جاتا (300 ميليلتر من تعليق الراتنج لثقافة 100 مل) إلى المادة طافية وربط البروتينات الراتنج ني-الإدارة الوطنية للسياحة في 4 درجات مئوية بالهز برفق تعليق ح 1.
    2. نقل التعليق إلى عمود البوليبروبيلين وتغسل الراتنج 3 x مع 5 مل من يغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 20 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    3. الوت البروتينات 3 x مع 300 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 ملم نة2بو4 (pH 8.0)، ايميدازول 250 مم و 300 مم كلوريد الصوديوم.
    4. تحديد تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر. معامل الانقراض (م 24,630-1سم-1) للتجارة والنقل-E90DOPA في 280 nm حسبت بروتين حاسبة معامل انقراض (مثلاً، https://web.expasy.org/protparam/) وانقراض يقاس بشكل مستقل كوفيسينت (م 2630-1سم-1) على دوبا. كأسلوب بديل، استخدام مقايسة البروتين برادفورد21 لتحديد تركيز البروتين.

4-أوليجوميريزاتيون لتنقية بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA

  1. إضافة فوق يودات 1 ميليلتر من الصوديوم في ح2س (6 ملم) (1.0 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) للتوصل إلى حل من 20 ميليلتر للتجارة والنقل-E90DOPA (300 ميكرون) في المخزن مؤقت فوسفات التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم.
  2. السماح بأن رد فعل أوليجوميريزاتيون على المضي قدما في 25 درجة مئوية ح 48.
  3. تحليل الخليط رد فعل بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد) (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) كما هو موضح في الخطوة 6.

5-تصريف E90DOPA التجارة والنقل مع مسبار ألكاين واسطة سبوكق

  1. إضافة 1 ميليلتر Cy5.5 مرتبط أزاديبينزوسيكلوكتيني (Cy5.5-أديبو)22 في ح2س (4.0 ملم) (10 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) للتوصل إلى حل من 20 ميليلتر للتجارة والنقل-E90DOPA (20 ميكرومتر) في المخزن مؤقت فوسفات التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم.
  2. إضافة فوق يودات 1 ميليلتر من الصوديوم في ح2س (400 ميكرون) (1.0 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) إلى خليط التفاعل.
  3. السماح بأن رد فعل سبوكق على المضي قدما في 25 درجة مئوية ح 1. إذا كان يتم استخدام مجس حساسة للضوء، تغطية وعاء التفاعل مع رقائق الألومنيوم.

6-تنقية التجارة والنقل المسماة

  1. تمييع الخليط رد فعل سبوكق بإضافة المخزن مؤقت فوسفات، التي تحتوي على 50 مم نا2هبو4 (pH 8.0) و 300 ملم كلوريد الصوديوم، تصل إلى 500 ميليلتر.
  2. نقل الحل المخفف لعمود دوران تصفية الطرد مركزي. الطرد المركزي عمود الدوران في 14,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة 3 x من أجل إزالة أي فائض Cy5.5-أديبو.
  3. نقل العينة المنقي من عمود الدوران إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
  4. وبدلاً من ذلك، القيام بتنقية بالغسيل الكلوي ضد المخزن المؤقت نفسه.
  5. مخزن التجارة والنقل المنقاة في 4 درجات مئوية.

7-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة التحليل وجل Fluorescence المسح الضوئي

  1. إعداد عينات البروتين لتحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عن طريق إضافة 5 ميليلتر من البروتين عينة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد)، والمسمى 2 ميليلتر من DTT (1.00 م) إلى 13 ميليلتر المنقي أو الخام، التجارة والنقل (13.6 ميكرومتر أو 0.38 مغ/مل). لتحليل التجارة والنقل أوليجوميريك، استخدم أعلى تركيز للتجارة والنقل (67.8 ميكرومتر أو 1.9 ملغ/مل). تؤذي البروتينات التي تفرخ لهم عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. ضع جل كاسيت (جل premade التي تم شراؤها، وأشرطة الكاسيت) مكررا-تريس الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 4 إلى 12% إلى الخلية التفريد وإضافة المخزن مؤقت قيد تشغيل (انظر الجدول للمواد). تحميل عينات البروتين وعلامة وزن الجزيئي. تشغيل التفريد لمدة 35-40 دقيقة في 200 V.
    ملاحظة: تجنب أي تعرض عينات البروتين الضوء بالقيام بجميع العمليات في الظلام، للتقليل إلى أدنى حد تبيض صور المسبار الفلورسنت.
  3. استخدام ماسح ضوئي الأسفار للتصوير بالأسفار. التفاف بروتين هلام من التفريد ووضعه على ماسح ضوئي الأسفار. مسح الجل باستخدام إعداد الطول موجي مناسب. ل Cy5.5، حدد وضع Cy5 المنصوص عليها في برنامج الماسح الضوئي.
  4. وصمة عار للهلام مع بروتين تجاري تلطيخ كاشف.

8-استخدام-TOF الكتلي بالهضم التربسين

  1. احتضان 100 ميليلتر من المنقي بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA (2.2 ملغ/مل أو 80 ميكرومتر) في المخزن مؤقت الذي يحتوي على 50 مم تريس-HCl (pH 8.0)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، و 25 مم DTT عند 60 درجة مئوية ح 1.
  2. أضف 1 ميليلتر من إيودواسيتاميدي في ح2س (الأكاديمية، 4.0 M) (500 equiv. للتجارة والنقل-E90DOPA) إلى الحل بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA المنقي (80 ميكرومتر) في المخزن المؤقت لنفسه. احتضان هذا الخليط عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الحماية من الضوء.
  3. هضم العينة E90DOPA التجارة والنقل عن طريق إضافة التربسين (مبطلات للركيزة البروتين نسبة [w/w] 1: 100)، واحتضان الخليط رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 4.
  4. تنقية العينة الببتيد هضمها باستخدام أسلوب ديسالتينج مع أعمدة الدوران18 ج.
  5. تحليل الببتيدات هضمها بالمبلغ عنها البروتوكول المتعلق بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (TOF استخدام MS) باستخدام حامض ألفا-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك (تشكا) ك مصفوفة23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نظام التعبير مباشرة إدراج بيوسينثيسيزيد دوبا من لافوري يرد في الشكل 1. وتوضع في بلازميد الجينات لزوج aa-الحمض الريبي النووي النقال و aaRS تطورت، وبروتينات فلورية خضراء الجينات (التجارة والنقل-E90TAG) التي تحتوي على كودون العنبر في موقف 90 يقع في بلازميد آخر لتقييم إدماج دوبا بالأسفار التجارة والنقل. هو الجين لافوري في بلازميد التعبير نفسه الذي يحتوي على الجين بروتينات فلورية خضراء وأعرب فيه عن مؤثرا لتعظيم العائد من التركيب الحيوي دوبا. باستخدام هذا النظام التعبير، تم فحص الظروف المثلى تخليق الحيوي دوبا. نمو الوسائط المستخدمة لهذه التجربة الواردة 25 مم الأمونيا وبيروفات 100 مم، بتركيزات مختلفة من الكاتيتشول (0-10 مم). وكان تركيز الكاتيتشول حاسمة بالنسبة للتركيب الحيوي دوبا، بينما تركيزات الأمونيا وبيروفات ما يزيد على 25 و 100 ملم، على التوالي، لم يؤثر على التركيب الحيوي، وإدماج دوبا. وكان تركيز الأمثل الكاتيتشول 10 ملم، وتجمعا لأكثر من 10 مم تناقص نمو الخلايا البكتيرية بسبب ما سيتوتوكسيسيتي. في هذه الحالة المثلى، كان دوبا بيوسينثيسيزيد قبل لافوري من موادها ابتداء، وبيوسينثيسيزيد دوبا أدرجت مباشرة في التجارة والنقل. تنقية متحولة عن التجارة والنقل (التجارة والنقل-E90DOPA) وتحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2أ). تمت تنقيته التجارة والنقل كامل طول، وأكدت على إدماج دوبا MS TOF استخدام تحليل (الشكل 2ب). كان يهضم البروتين مع التربسين وقد حلل الجزء الببتيد تحتوي على دوبا وأظهرت النتيجة الخالصة إدماج دوبا مع صور لا يمكن كشفها أو دمج الأحماض الأمينية الطبيعية الأخرى. فعالية إدماج بيوسينثيسيزيد دوبا لافوري كانت مشابهة لفعالية إدماج مع 3 مم دوبا، وهو أقصى تركيز دوبا بسبب ما سيتوتوكسيسيتي19. على الرغم من 10 ملم الكاتيتشول أظهرت سمية معتدلة، كثافة الخلية بعد 16 ساعة وقت الثقافة ما كان بين ثلاثة إلى أربعة إضعاف أعلى من حضور 3 مم دوبا. وكان العائد البروتين المنقي تخليق الحيوي أعلى ثلاث مرات من التجربة باستخدام 3 مم دوبا (الشكل 3).

المسخ بروتينات فلورية خضراء تحتوي على دوبا كان يستخدم لتصريف البروتين. يمكن أن تتأكسد دوبا في دوباكوينوني ل التأكسد معتدل، وكينون electrophilic يتفاعل مع الكينس المتوترة ونوكليوفيليس، مثل ثيولس والامينات، ويمكن استخدامها في بيوكونجوجيشن (الشكل 4). وكان اختبار بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA سيكلواديتيون سبوكق نتيجة للتفاعل مع الصوديوم فوق يودات، متبوعاً بعلاج مع Cy5.5-أديبو22. وقد تم تحليل هذا الرد سبوكق من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والأسفار التصوير (الشكل 5ألف). لوحظ الفرقة fluorescence المكثف مع أج صوديوم فوق يودات وفوق يودات Cy5.5-أديبو، في حين أبدى لا الفرقة fluorescence في مراقبة التفاعلات مع بروتينات فلورية خضراء-WT أو دون صوديوم العلاج، مما يؤكد كفاءة وخصوصية رد فعل الاقتران مع دوبا أدرجت وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت في التجارة والنقل التي تحتوي على دوبا للبروتين أوليجوميريزيشن. لام-دوباكوينوني يتفاعل مع ليز أو Cys في البروتين نفسه، أسفر عن البروتينات أوليجوميريك. بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA كان تعامل مع فوق يودات الصوديوم وأجريت في أوليجوميريزيشن ح 48، ورد فعل كان تحليلها من قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مقارنة بعينه السيطرة دون فوق يودات صوديوم العلاج (الشكل 5ب). وأظهر التحليل نمط أوليجوميريزاتيون واضحة مع نطاقات البروتين متباعدة بالتساوي للعينة تعامل بيريوداتي، بينما أظهرت العينة التحكم البروتين سليمة دون أي العصابات الأخرى.

Figure 1
الشكل 1 : توجيه إدماج بيوسينثيسيزيد دوبا من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا- دوبا بيوسينثيسيزيد قبل لافوري هيتيرولوجوسلي أعرب من الكاتيتشول، بيروفات، والأمونيا في المتوسطة النمو. زوج الحمض الريبي النووي النقال/aaRS تطورت على دوبا أعرب عن المشاركة لإدماج بيوسينثيسيزيد دوبا في البروتين المستهدف، التجارة والنقل. الجين لافوري وضعت تحت مروج تأسيسي من أجل بدء التركيب الحيوي دوبا قبل حمل تعبير بروتينات فلورية خضراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحليلات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة واستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد للتجارة والنقل-E90DOPA التي يعبر عنها نظام السكروز مصممة. (أ) التجارة والنقل-E90DOPA التي يعبر عنها نظام السكروز مصممة بحضور الكاتيتشول 10 ملم و 100 ملم بيروفات الأمونيا 25 مم، وثم تنقيتها بالفصل اللوني لتقارب ني-الإدارة الوطنية للسياحة. وقد تم تحليل بروتينات فلورية خضراء-WT أيضا للمقارنة. العينات كانت مفصولة تريس مكررا 4 – 12% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، والهلام كانت ملطخة R-250 "أخذ الزرقاء الرائعة". (ب) تحليل MS TOF استخدام الجزء الببتيد تحتوي على دوبا من هضم تريبتيك للتجارة والنقل-E90DOPA. الجزء الببتيد من وزن بروتينات فلورية خضراء تحتوي على بقايا 86-96 (سامبيجيفقير). يتم استبدال غلو في الجزء من التجارة والنقل-WT مع دوبا في الجزء الببتيد من E90DOPA التجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : مقارنة بين الإدماج المباشر من بيوسينثيسيزيد دوبا مع إدراج وراثية عامة دوبا- وتظهر هذه اللوحات بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA التي أعربت عنها النظام السكروز مصممة وإدراج الوراثية حضور 3 مم دوبا دون بيروفات إضافية، والأمونيا، والكاتيتشول. (أ) البروتين تم الحصول على غلة من المنقي بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA و (ب) تم قياس كثافة الخلية في 16 ح بعد تنصيب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : رد فعل مخطط من بيوكونجوجيشن للتجارة والنقل-E90DOPA- بروتينات فلورية خضراء-E90DOPA هو تتأكسد لتحويل دوبا في دوباكوينوني. رد فعل البروتين الذي يحتوي على دوباكوينوني مع ألكاين متوترة يحقق وسم البروتينات الخاصة بالموقع. الحضانة للبروتين دوباكوينوني المحتوية على تركيزات عالية لفترة طويلة (48 ساعة) يتسبب تصريف البروتين الذاتية لإنتاج البروتين ليغومرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : بيوكونجوجيشن متحولة البروتينات التي تحتوي على دوبا- (أ) سبوكق ردود فعل بروتين المحتوية على دوبا مع ألكاين متوترة، أديبو-Cy5.5. وزن التجارة والنقل والتجارة والنقل-E90DOPA تعامل مع الصوديوم فوق يودات وتجاوب مع Cy5.5 أديبو لمدة 60 دقيقة. وجرى تحليل ردود فعل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، وأخذ الملون (أعلى) وتظهر الصور الفلورية (أسفل). (ب) أوليجوميريزاتيون للتجارة والنقل-E90DOPA. بروتينات فلورية خضراء المحتوية على دوبا كان تعامل مع الصوديوم فوق يودات والمحتضنة ح 48. وقد تم تحليل الخليط رد فعل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرد في هذا البروتوكول، الحيوي والإدماج المباشر من دوبا. الخلية البكتيرية المستخدمة في هذا الأسلوب يمكن توليف حمض أميني إضافية واستخدامها بوصفها لبنة غير طبيعي تخليق البروتين. تم إدراج الوراثية للأحماض الأمينية غير طبيعي تكنولوجيا رئيسية لتطوير الكائنات الحية غير طبيعي مع رمز الوراثية موسع. ومع ذلك، هذا الأسلوب قد غير مكتملة من الناحية الفنية ويجري تعديل لتحسين إدماج الكفاءة والتقليل من اضطراب لنظم الترجمة الذاتية. مؤخرا، قد تحققت إنجازات هامة في الطريقة طريق إعادة codons24،25 للأحماض الأمينية غير طبيعية وهندسة مكونات متعدية متعامد26،27،28 ،29. وبالإضافة إلى هذه التحسينات، يوفر النظام المذكور هنا قدرة آخر إلى كائن غير طبيعي مع رمز الوراثية موسع: التركيب الحيوي الأحماض الأمينية غير طبيعي. يعطي هذه الإمكانية النظام غير طبيعي المزيد من الاستقلالية ككائن مع مرجع ممارسات مجلس الأمن وراثية موسع. وعلاوة على ذلك، يبين دوبا سمية معتدلة على سلالة البكتيريا المستخدمة في هذا الأسلوب، وفي 3 مم دوبا، نمو الخلايا انخفاضا كبيرا، مما أسفر عن البروتين منخفضة الغلة. باستخدام نظام الإدماج المباشر، تم تخفيض سمية وتضاعف إنتاج البروتين.

المسخ aaRS المستخدمة لإدراج الوراثية دوبا معتدلة الكفاءة والإخلاص ويتضمن صور بتركيز منخفض من دوبا. 18 ولذلك، من الحيوي دوبا في الخلايا البكتيرية ينبغي أن تتسم بالكفاءة ما يكفي لمنع إدراج صور. التركيب الحيوي دوبا لافوري من الكاتيتشول، والأمونيا، وبيروفات رد فعل عكسها، وتركيزات عالية من المواد البداية المطلوبة للحيوي كفاءة. ومع ذلك، لا تستخدم الكاتيتشول أكثر من 10 مم لأنها سامة للسلالة البكتيرية المستخدمة في هذا البروتوكول. أن تركيز DTT مهم أيضا في هذا البروتوكول. ويبين دوبا سميته عندما يتم تحويلها إلى L-دوباكوينوني، وهو إضافة DTT في المتوسطة النمو لخفض معدل الأكسدة. لاحظنا انخفاضا في نمو الخلايا عندما كان تركيز DTT ما يزيد على 300 ميكرون. ولذلك، تخليق الحيوي الأمثل وإدماج دوبا، مكونات الثقافة المتوسطة (لا سيما الكاتيتشول و DTT) ينبغي استخدام في التركيزات المناسبة كما هو موضح في هذا البروتوكول.

ويصف هذا البروتوكول أيضا تطبيقات بروتينات التي تحتوي على دوبا لتصريف البروتين الخاصة بالموقع. لام-دوباكوينوني التي تم إنشاؤها بواسطة أكسدة دوبا كفاءة يتفاعل مع ألكاين متوترة مرتبطة بتحقيق بيوكيميائية. هذا رد فعل سيكلواديتيون عادة أسرع من تفاعلات إضافة ردود فعل الأمينات أو ثيولس. ومع ذلك، ينبغي أن تنفذ أكسدة دوبا حضور بروتين المحتوية على دوبا والكاين متوترة، التقليل إلى أدنى حد الإضافة إلى تفاعلات التي نوكليوفيليس في البروتين. ولذلك، المهم ترتيب إضافة الكواشف لرد الفعل هذا.

وتتوفر العديد من الأحماض الأمينية غير طبيعي لتصريف البروتين، وبعض منها تحقيق معدل رد الفعل السريع وتصريف ممتاز الكفاءة30،31،،من3233. هذه الأحماض الأمينية تحتوي على المجموعات الوظيفية بيورثوجونال مثل أزيدات الكينس، الالكينات توتر أو الكينس وتيترازينيس. على الرغم من أنها مفيدة لتصريف البروتين الخاصة بالموقع، كثير منهم من باهظة الثمن أو غير قابل للوصول تجارياً، مما يحد من التطبيقات الخاصة بهم، لا سيما في تلك التي تتطلب البروتينات على نطاق واسع. ولذلك، التركيب الحيوي دوبا من مواد انطلاق رخيصة وتأسيسها مباشرة سيكون مفيداً للتطبيقات الصيدلانية والصناعية التي تتطلب بروتينات متحولة واسعة النطاق تتضمن تحقيقا بيوكيميائية أو دواء (جسم-المخدرات المتقارن، ADC).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا البحث كان يدعمها "برنامج بحوث الحدود العالمية" (جبهة الخلاص الوطني-2015M3A6A8065833)، و "علوم البحث البرنامج الأساسي" (2018R1A6A1A03024940) عن طريق الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها حكومة كوريا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية، 138 قضية، دوبا، إدراج الوراثية، التركيب الحيوي، تيروزين الفينول-لياز، تصريف البروتين، وتروج لها سلالة تسيطر على أكسدة سيكلوكتيني-1، 2-كينون (سبوكق) سيكلواديشن
إدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد لديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) وتطبيقه على تصريف البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, S., Lee, H. S. Genetic… More

Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter