Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 및 단백질 활용의 응용의 유전 결합
Summary
여기, 우리가 현재 간단한 시작 소재로 L dihydroxyphenylalanine biosynthesized의 유전 결합 그리고 단백질 활용에의 응용에 대 한 프로토콜.
Abstract
L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에는 아미노산 이다. 그것의 특정 생 화 확 적인 특성 때문에 아미노산 생화학 응용 프로그램에서 여러 사용 하고있다. 이 보고서 biosynthesized DOPA의 유전자 결합에 대 한 프로토콜 및 단백질 활용의 응용에 설명합니다. DOPA는 티로신 페 놀-lyase (TPL) catechol, pyruvate, 암모니아에서 의해 biosynthesized 이며 아미노산 진화 aminoacyl-tRNA와 aminoacyl-tRNA 합성 쌍을 사용 하 여 유전 결합 방법으로 단백질에 직접 통합 됩니다. 이 직접 설립 시스템 DOPA에 대 한 이전 유전 법인 시스템 보다 더 나은 단백질 수확량과 다른 천연 아미노산의 작은 합동 DOPA을 효율적으로 통합. DOPA 포함 된 단백질 단백질 활용 효율적이 고 사이트 이며 다양 한 응용 프로그램에 대 한 그것의 유용성을 보여줍니다. 이 프로토콜 단백질 과학자를 DOPA 원하는 사이트와 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 그들의 활용을 포함 하는 돌연변이 단백질의 효율적 생 합성에 대 한 자세한 절차를 제공 합니다.
Introduction
DOPA는 catecholamines 동물 및 식물의 생 합성에 관련 된 아미노산 이다. 이 아미노산 티로신 hydroxylase 및 분자 산소 (O2)1에 의해 티 르에서 합성 됩니다. DOPA 도파민의 선구자 이며, 혈액-뇌 장벽 침투 수, 때문에 그것은2파 킨 슨 병 치료에 사용 되었습니다. DOPA 홍합 접착 단백질 (지도), 젖은 조건3,,45,,67에 홍합의 접착 속성에 대 한 책임은에 발견 된다. Tyr는 처음 DOPA 지도에서 발견 되는 tyrosinases8,9DOPA로 변환 됩니다 위치에 인코딩됩니다. 그것의 재미 있는 생 화 확 적인 특성 때문에 DOPA 다양 한 응용 프로그램에에서 사용 되었습니다. DOPA의 dihydroxyl 그룹은 화학적으로 산화, 경향이 그리고 아미노산 L-dopaquinone, melanins의 선구자로 쉽게 변환 됩니다. 그것의 높은 electrophilicity 때문에 L-dopaquinone와 그 파생 상품 가교 및 thiols 및 아민10,11,,1213와 활용에 대 한 사용 되었습니다. 1, 2-퀴 논 디 엔 cycloaddition 반응에 대 한 기능을 할 수 하 고 스트레인 승진 산화 제어 cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14bioconjugation에 대 한 사용 되었습니다. 또한, dihydroxyl 그룹 Fe3 + 와 Cu2 +같은 금속 이온을 킬레이트 수 고 DOPA를 포함 하는 단백질 약물 전달 및15,16을 감지 하는 금속 이온에 대 한 이용 되었습니다.
DOPA 유전자 단백질에는 직교 aminoacyl-tRNA (금주 모임-tRNA)와 aminoacyl-tRNA 합성 (aaRS) 쌍17 을 사용 하 여 통합 되었으며 사용 단백질 활용 및 가교10,11, 12,13. 이 보고서에서 실험 결과 프로토콜 DOPA biosynthesized 저렴 한 원자재와 bioconjugation 응용 프로그램에서의 유전 결합을 설명 합니다. DOPA biosynthesized TPL을 사용 하 고 catechol, pyruvate, 및 대장균에서 암모니아에서 출발 이다. DOPA biosynthesized DOPA에 대 한 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍으로 표현 하 여 단백질에 직접 통합 됩니다. 또한, 포함 된 DOPA biosynthesized 단백질 site-specifically 형광 프로브와 단백질 올리고 생산 가교 된 활용 된. 이 프로토콜와 단백질 생화학 프로브 또는 산업 및 제약 응용 프로그램에 대 한 약물을 켤레 biosynthesize 돌연변이 단백질 DOPA 포함 된 단백질 과학자에 대 한 유용할 것입니다.
Protocol
1. 플라스 미드 건설 제정 발기인의 통제 Citrobacter freundii 에서 TPL 유전자와는 그의 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 표현 하는 식 플라스 미드 (pBAD-듀얼-TPL-GFP-WT) 생성6-태그의 통제는 araBAD 발기인입니다. PBAD-듀얼-TPL-GFP-E90TAG, (E90) 사이트에 대 한 codon의 사이트 지시 된 mutagenesis 프로토콜을 사용 하 여 호박 codon (태그)와 DOPA 교체 합니다. 이 플라스 미드의 건설에 대 한 자세한 ?…
Representative Results
TPL에서 DOPA biosynthesized의 직접 통합 식 시스템은 그림 1에 표시 됩니다. 진화 aa-tRNA와 aaRS 쌍에 대 한 유전자를 플라스 미드에 배치 됩니다 위치 90에서 호박 codon를 포함 하는 GFP 유전자 (GFP-E90TAG) GFP 형광에 의해 DOPA의 평가에 다른 플라스 미드에 위치 하 고. TPL 유전자는 GFP 유전자를 포함 하는 동일한 식 플라스 미드에 배치 하 고 constitutively DOPA 생 합?…
Discussion
이 프로토콜에서 생 합성 및 직접 설립 DOPA의 설명 되어 있습니다. 이 방법에 사용 되는 세균성 셀 추가 아미노산을 합성 하 고 단백질 합성에 대 한 부자연 스러운 빌딩 블록으로 사용할 수 있습니다. 부자연 스러운 아미노산의 유전자 결합 확장된 유전자 코드와 부자연 스러운 생물의 개발을 위한 핵심 기술 되었습니다. 그러나,이 메서드는 기술적으로 완료 되었습니다 하 고 관 효율을 향상 시키…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 글로벌 프 런 티어 연구 프로그램 (NRF-2015M3A6A8065833)에 의해 지원 되었다 그리고 기본 과학 연구 프로그램 (2018R1A6A1A03024940)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부에 의해 자금.
Materials
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
References
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Cite This Article
Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).