Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a incorporação genética de L-dihidroxifenilalanina biossintetizados a partir de matérias-primas simples e sua aplicação à conjugação de proteínas.
Abstract
L-dihidroxifenilalanina (DOPA) é um aminoácido encontrado na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Devido às suas propriedades bioquímicas particulares, o aminoácido tem múltiplos usos em aplicações bioquímicas. Este relatório descreve um protocolo para a constituição genética de biossintetizados DOPA e sua aplicação à conjugação de proteínas. DOPA é biossintetizados por uma tirosina fenol-liase (TPL) de catecol, piruvato e amônia, e o aminoácido é diretamente incorporado em proteínas pelo método de incorporação genética usando um aminoacil-tRNA evoluída e par de aminoacil-tRNA sintetase. Este sistema de incorporação directa eficientemente incorpora DOPA com pouca incorporação de outros aminoácidos naturais e com melhor rendimento de proteína do que o anterior sistema de incorporação genética para DOPA. Conjugação de proteínas com proteínas contendo DOPA é eficiente e site-specific e mostra sua utilidade para diversas aplicações. Este protocolo fornece os cientistas de proteína com procedimentos detalhados para o eficiente biossíntese de proteínas mutantes contendo DOPA em sites desejados e sua conjugação para aplicações industriais e farmacêuticas.
Introduction
DOPA é um aminoácido envolvido na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Este aminoácido é sintetizado a partir de Tyr tirosina hidroxilase e oxigênio molecular (O2)1. Porque DOPA é um precursor da dopamina e pode permear a barreira sangue – cérebro, ela tem sido usada no tratamento da doença de Parkinson2. DOPA também é encontrada em proteínas de adesão de mexilhão (mapas), que são responsáveis para as propriedades adesivas de mexilhões em circunstâncias molhadas3,4,5,6,7. Tyr é inicialmente codificado nas posições onde DOPA é encontrada em mapas e em seguida é convertida em DOPA pela tyrosinases8,9. Devido às suas propriedades bioquímicas interessantes, DOPA tem utilizou uma variedade de aplicações. O grupo de dihydroxyl de DOPA é quimicamente propenso à oxidação, e o aminoácido é facilmente convertido em L-dopaquinone, um precursor de melaninas. Devido à sua alta eletrofilicidade, L-dopaquinone e seus derivados utilizámos para reticulação e conjugação com tióis e aminas10,11,12,13. 1,2-quinonas também podem funcionar como um dieno para reações de cicloadição e têm sido usados para bioconjugation por estirpe-promovido oxidação controlada cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadição14. Além disso, o grupo de dihydroxyl pode quelato íons metálicos como Fe3 + e Cu2 +e proteínas contendo DOPA têm sido utilizadas para a entrega da droga e do íon do metal sensoriamento15,16.
DOPA foi geneticamente incorporado em proteínas usando um aminoacil-tRNA ortogonal (aa-tRNA) e aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) par17 e usado para proteína conjugação e reticulação10,11, 12,13. Neste relatório, são descritos os resultados experimentais e protocolos para a constituição genética de DOPA biossintetizados de matérias-primas baratas e suas aplicações para bioconjugation. DOPA é biossintetizados usando um TPL e a partir de catecol, piruvato e amônia em Escherichia coli. O biossintetizados DOPA é diretamente incorporado proteínas expressando um par aa-tRNA e aaRS evoluiu para DOPA. Além disso, a proteína biossintetizados contendo DOPA site-specifically está conjugada com uma sonda fluorescente e quitosana para produzir oligómeros de proteína. O presente protocolo será útil para os cientistas de proteína, a biossintetize proteínas mutantes contendo DOPA e conjugar as proteínas com testes bioquímicos ou drogas para aplicações industriais e farmacêuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, a biossíntese e incorporação directa do DOPA são descritos. A célula bacteriana usada neste método pode sintetizar um aminoácido adicional e usá-lo como um bloco de construção natural para a síntese de proteína. A incorporação genética de aminoácidos não naturais tem sido uma tecnologia-chave para o desenvolvimento do organismo natural com um código genético expandido. No entanto, este método tem sido tecnicamente incompleto e está sendo modificado para melhorar a eficiência da inco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa Global de pesquisa de fronteira (NRF-2015M3A6A8065833), e a ciência pesquisa programa básico (2018R1A6A1A03024940) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia.
Materials
| 1. Plasmid Construction | |||
| Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| Plasmid pEvol-DHPRS2 | 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018). | ||
| DH10β | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| 3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system | |||
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Pyrocatechol, 99% | SAMCHUN | P1387 | 25 g |
| Ammonium sulfate, 99% | SAMCHUN | A0943 | 500 g |
| pyruvic acid, 98% | Alfa Aesar | A13875 | 100 g |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% | SAMCHUN | S0891 | 1 kg |
| Potassium phophate, monobasic, 99% | SAMCHUN | P1127 | 1 kg |
| Magnesium sulfate, anhydrous, 99% | SAMCHUN | M0146 | 1 kg |
| D(+)-Glucose, anhydrous, 99% | SAMCHUN | D0092 | 500 g |
| Glycerol, 99% | SAMCHUN | G0269 | 1 kg |
| Trace metal mix a5 with co | Sigma | 92949 | 25 mL |
| L-Proline, 99% | SAMCHUN | P1257 | 25 g |
| L-Phenylalanine, 98.5% | SAMCHUN | P1982 | 25 g |
| L-Tryptophane | JUNSEI | 49550-0310 | 25 g |
| L-Arginine, 98% | SAMCHUN | A1149 | 25 g |
| L-Glutamine, 98% | JUNSEI | 27340-0310 | 25 g |
| L-Asparagine monohydrate, 99% | SAMCHUN | A1198 | 25 g |
| L-Methionine | JUNSEI | 73190-0410 | 25 g |
| L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% | SAMCHUN | H0604 | 25 g |
| L-Threonine, 99% | SAMCHUN | T2938 | 25 g |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | 25 g |
| Glycine, 99% | SAMCHUN | G0286 | 25 g |
| L-Glutamic acid, 99% | SAMCHUN | G0233 | 25 g |
| L-Alanine, 99% | SAMCHUN | A1543 | 25 g |
| L-Isoleucine, 99% | SAMCHUN | I1049 | 25 g |
| L-Valine, 99% | SAMCHUN | V0088 | 25 g |
| L-Serine | SAMCHUN | S2447 | 25 g |
| L-Aspartic acid | SAMCHUN | A1205 | 25 g |
| L-Lysine monohydrochloride, 99% | SAMCHUN | L0592 | 25 g |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters | SONIC & MATERIALS | VCX130 | |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| 4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA | |||
| Sodium periodate, 99.8& | Acros | 419610050 | 5 g |
| 5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 6. Purification of Labeled GFP | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12 well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System | Syngene | G BOX Chemi XT4 | |
| 8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion | |||
| 8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| Dodecyl sulfate sodium salt, 85% | SAMCHUN | D1070 | 250 g |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | 5 g |
| Trypsin Protease, MS Grade | Thermofisher | 90057 | 5 x 20 µg/pack |
| C-18 spin columns | Thermofisher | 89870 | 25/pack, 200 µL capacity |
| 8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF | |||
| Acetonitirile, 99.5% | SAMCHUN | A0125 | 500 mL |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma | C2020 | 10 g |
| Trifluoroacetic acid, 99% | SAMCHUN | T1666 | 100 g |
| MTP 384 target plate ground steel BC targets | Bruker | 8280784 | |
| Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker |
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