ويرد هنا، بروتوكولا لتحليل الإنتاجية متوسطة إلى عالية البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي. والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.
مما يشير إلى الخلية الشاذة يلعب دوراً محوريا في تطوير السرطان والتقدم. العلاجات المستهدفة الأكثر رواية الواقع توجه البروتينات ووظائف البروتين، والانحرافات مما يشير إلى الخلية قد ذلك بمثابة المؤشرات الحيوية للإشارة إلى خيارات العلاج شخصية. بدلاً من إجراء تحليلات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، تقييم التغيرات في نشاط البروتين يمكن أكثر كفاءة الآليات الكامنة وراء حساسية العقاقير والمقاومة. والرمات التدفق الخلوي هو تقنية قوية أن التدابير البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي، من السمات هامة التي تميز هذا الأسلوب من النهج القائم على جسم الأخرى. يسمح الأسلوب التحليل المتزامن للبروتينات إشارات متعددة. في تركيبة مع الخلية الفلورسنت المتوازية، أكبر مجموعات البيانات متوسطة إلى عالية الإنتاجية يمكن اكتسابها من خلال الأجهزة سيتوميتير قياسية في وقت قصير. وقد والرمات التدفق الخلوي التطبيقات في دراسات البيولوجيا الأساسية والبحوث السريرية، بما في ذلك إشارات العلامات البيولوجية اكتشاف وتحليل وتقييم الدوائية. هنا، يتم توفيرها بروتوكول تجريبي مفصلة لتحليل تدفق والرمات الخلايا وحيدات النوى تنقية الدم المحيطي، واستخدام خلايا اللوكيميا اللمفاوية المزمنة كمثال.
والرمات التدفق الخلوي تستخدم لتحليل مستويات البروتين الفسفرة في القرار خلية واحدة. والهدف العام للأسلوب لتعيين أنماط الإشارات الخلوية تحت شروط محددة. باستغلال قدرة التدفق الخلوي مولتيباراميتير، يمكن تحليل مسارات إشارات عديدة في نفس الوقت في مجموعات فرعية مختلفة من السكان خلية غير المتجانسة مثل الدم المحيطي. هذه الصفات توفر مزايا أكثر من غيرها من التكنولوجيات المستندة إلى جسم مثل إيمونوهيستوتشيميستري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ومصفوفة البروتين والمرحلة عكس البروتين الصفيف (ربا)1. والرمات التدفق الخلوي يمكن دمجها مع خلية الفلورسنت المتوازية (FCB)، مما يعني أن عينات الخلايا الفردية المسماة توقيعاً فريداً من الأصباغ الفلورية حيث أنه يمكن مختلطة معا والملون وتحليلها ك عينة واحدة2. هذا يقلل من استهلاك جسم ويزيد من متانة البيانات من خلال المزيج من عينات المعالجة والمراقبة، ويعزز سرعة اكتساب. يمكن تقسيم عينات أصغر السكان FCB مجتمعة وملطخة بأجسام محددة والرمات متميزة تصل إلى 35، اعتماداً على مقدار ابتداء من المواد. يمكن، وبالتالي، تشغيل التجارب التنميط كبيرة مع الأجهزة سيتوميتير القياسية. وطبق والرمات التدفق الخلوي للشخصية مما يشير إلى مسارات في عينات المرضى من عدة سرطانات الدم، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)3،،من45، سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) 6 وغير هودجكين الأورام الليمفاوية7. وهكذا والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.
هنا، يتم توفيرها في بروتوكول الأمثل لتحليل عينات المرضى CLL حسب والرمات التدفق الخلوي (الشكل 1A). وترد أمثلة لتوصيف إشارات القاعدية، وتحفيز مستقبلات الخلية المضادة IgM/ب واضطراب المخدرات. ويرد وصف مفصل لمصفوفة FCB. البروتوكول يمكن بسهولة أن تتكيف مع سائر أنواع الخلايا تعليق.
والرمات التدفق الخلوي تقنية قوية لقياس مستويات البروتين الفسفرة في الخلايا المفردة. نظراً للأسلوب يعتمد على تلطيخ مع الأجسام المضادة، والرمات التدفق الخلوي يحد من توافر الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، بغية الحصول على نتائج موثوقة، جميع الأجسام المضادة معاير وينبغي التحقق منها قبل الاس…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل أجرى في المختبر للبروفيسور كيتيل Taskén، وأيدته الجمعية النرويجية لمكافحة السرطان، وكريستيان ستيفتيلسين جيرهارد Jebsen. يوهانس لاندسكرون وانجار ماريان معترف بها لقراءة نقدية من المخطوطة.
RPMI 1640 GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | Cell culture medium |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10270169 | Additive to cell culture medium |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | Additive to cell culture medium |
MEM non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | Additive to cell culture medium |
Lymphoprep | Alere Technologies AS | 1114547 | Density gradient medium |
Anti-IgM | Southern Biotech | 2022-01 | For stimulation of the B cell receptor |
BD Phosflow Fix Buffer I | BD | 557870 | Fixation buffer |
BD Phosflow Perm Buffer III | BD | 558050 | Permeabilization buffer |
Alexa Fluor 488 5-TFP | ThermoFisher Scientific | A30005 | Barcoding reagent |
Pacific Blue Succinimidyl Ester | ThermoFisher Scientific | P10163 | Barcoding reagent |
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | ThermoFisher Scientific | P30253 | Barcoding reagent |
Compensation beads | Defined by user | Correct species reactivity | |
Falcon tubes | Defined by user | ||
Eppendorf tubes | Defined by user | ||
96 well V-bottom plates | Defined by user | Compatible with the flow cytometer | |
Centrifuges | Defined by user | For Eppendorf tubes, Falcon tubes and plates | |
Water bath | Defined by user | Temperature regulated | |
Flow cytometer | Defined by user | With High Throughput Sampler (HTS) | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antigen | |||
AKT (pS473) | Cell Signaling Technologies | 4075 | Clone: D9E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
ATF-2 (pT71) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8398 | Clone: F-1 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
BLNK (pY84) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558443 | Clone: J117-1278 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY223)/Itk (pY180) | Beckton Dickinson Pharmingen | 564846 | Clone: N35-86 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Btk (pY551) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558129 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
Btk (pY551)/Itk (pY511) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558134 | Clone: 24a/BTK (Y551) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
CD3ζ (pY142) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558489 | Clone: K25-407.69 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Histone H3 (pS10) | Cell Signaling Technologies | 9716 | Clone: D2C8 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
IκBα | Cell Signaling Technologies | 5743 | Clone: L35A5 Reference: Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
LAT (pY171) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558518 | Clone: I58-1169 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
Lck (pY505) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558577 | Clone: 4/LCK-Y505 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
MEK1 (pS298) | Beckton Dickinson Pharmingen | 560043 | Clone: J114-64 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
NF-κB p65 (pS529) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558422 | Clone: K10-895.12.50 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
NF-κB p65 (pS536) | Cell Signaling Technologies | 4887 | Clone: 93H1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 |
p38 MAPK (pT180/Y182) | Cell Signaling Technologies | 4552 | Clone: 28B10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p44/42 MAPK (pT202/Y204) | Cell Signaling Technologies | 4375 | Clone: E10 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
p53 (pS15) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: 16G8 Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS20) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS37) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS46) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
p53 (pS392) | Cell Signaling Technologies | NN | Clone: Polyclonal Reference: Irish et al., 2007, Flt3 Y591 duplication and Bcl-2 overexpression…, Blood, 109(6):2589-96 |
PLCγ2 (pY759) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558498 | Clone: K86-689.37 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
Rb (pS807/pS811) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558590 | Clone: J112-906 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
S6-Ribos. Prot. (pS235/236) | Cell Signaling Technologies | 4851 | Clone: D57.2.2E Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SAPK/JNK (pT183/Y185) | Cell Signaling Technologies | 9257 | Clone: G9 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Pollheimer et al., 2013, Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55 |
SLP76 (pY128) | Beckton Dickinson Pharmingen | 558438 | Clone: J141-668.36.58 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 |
STAT1 (pY701) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612597 | Clone: 4a Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT3 (pY705) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557815 | Clone: 4/P-STAT3 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
STAT4 (pY693) | Zymed/ThermoFisher Scientific | 71-7900 | Clone: Polyclonal Reference: Uzel et al., 2001, Detection of intracellular phosphorylated STAT-4 by flow cytometry, Clin Immunol, 100(3): 270-6 |
STAT5 (pY694) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612599 | Clone: 47/Stat5(pY694) Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |
STAT6 (pY641) | Beckton Dickinson Pharmingen | 612601 | Clone: 18/P-Stat6 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 |
SYK (pY525/Y526) | Cell Signaling Technologies | 12081 | Clone: C87C1 Reference: Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10):9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce…, Haematologica, 101(2):e59-62 |
ZAP70/SYK (pY319/Y352) | Beckton Dickinson Pharmingen | 557817 | Clone: 17A/P-ZAP70 Reference: Skånland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 and CD28…, Biochem J, 460(3):399-410 Kalland et al., 2012, Modulation of proximal signaling in normal and transformed…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9 Myklebust et al., 2017, Distinct patterns of B-cell receptor signaling in…, Blood, 129(6): 759-770 |