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Neuroscience

बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

यहाँ, हम तेजी से बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम डिटर्जेंट-यांत्रिक और hypotonic यांत्रिक ऊतक व्यवधान और कोशिका lysis विकल्प, दोनों जिनमें से नाभिक के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं ।

Abstract

एक व्यक्ति कोशिका की जीन अभिव्यक्ति की जांच सेल प्रकार और सेल राज्य की पहचान को सक्षम बनाता है । एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जैसे विषम ऊतकों में, विशेष रूप से कोशिकाओं के transcriptional प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । हालांकि, पृथक्करण एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यक तरीकों जीन अभिव्यक्ति और कोशिका मृत्यु में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर ताजा ऊतक के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, इस प्रकार अभिलेखीय और जैव बैंक सामग्री पर अध्ययन सीमित । एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-Seq) transcriptional अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, यह देखते हुए कि यह सही सेल प्रकार की पहचान करता है, ऊतक के अध्ययन की अनुमति देता है कि जमे हुए या अलग कर देना करने के लिए मुश्किल है, और पृथक्करण प्रेरित कम कर देता है प्रतिलेखन. यहां, हम बहाव snRNA-Seq के लिए नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि ताजा या जमे हुए रीढ़ की हड्डी के नमूनों से नाभिक के अलगाव को सक्षम बनाता है और दो बड़े पैमाने पर समानांतर छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है ।

Introduction

तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं के heterogenous समूहों है कि रूपात्मक की एक विविध सरणी, जैव रासायनिक, और electrophysiological गुण प्रदर्शित शामिल है । जबकि बल्क आरएनए अनुक्रमण विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में ऊतक चौड़ा परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो गया है, यह एकल कोशिका स्तर पर transcriptional परिवर्तन का पता लगाने precludes. एकल सेल transcriptional विश्लेषण में हाल के अग्रिमों कार्यात्मक समूहों में अपने आणविक प्रदर्शनों की जांच के आधार पर heterogenous कोशिकाओं के वर्गीकरण को सक्षम किया है और भी ंयूरॉंस कि हाल ही में सक्रिय किया गया था के सेट का पता लगाने के लिए leveraged किया जा सकता है । 1 , 2 , 3 , 4 पिछले दस वर्षों में, एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq) के विकास ने कोशिका-प्रकार की विविधता में एक दृश्य प्रदान करते हुए, व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को सक्षम किया है । 5

ऐसे बड़े पैमाने पर समानांतर scRNA-Seq के रूप में स्केलेबल दृष्टिकोण के उद्भव, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों सहित विषम ऊतकों अनुक्रम के लिए प्लेटफार्मों प्रदान की गई है । 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 हालांकि, एकल सेल पृथक्करण तरीकों कोशिका मृत्यु के साथ ही जीन अभिव्यक्ति में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 16 हाल ही में काम अंतर्जात transcriptional प्रोफाइल के संरक्षण को सक्षम करने के लिए एकल सेल अनुक्रमण तरीकों को अनुकूलित किया है । 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 इन रणनीतियों संवेदी उत्तेजना या व्यवहार के बाद तत्काल जल्दी जीन (IEG) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । 3 , 4 भविष्य में, इस रणनीति भी रोग राज्यों में या तनाव के जवाब में ऊतकों में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन किया जा सकता है । इन विधियों में से एक नाभिक आरएनए sequencing (snRNA-Seq) तनाव उत्प्रेरण सेल पृथक्करण शामिल नहीं है और अलग कर देना ऊतक (जैसे रीढ़ की हड्डी के रूप में) के लिए मुश्किल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही जमे हुए ऊतक एक आशाजनक दृष्टिकोण है । 4 , 17 , 18 , 19 पिछले नाभिक अलगाव तरीकों से अनुकूलित,20,21,22,23,25 snRNA-Seq आम तौर पर तेजी से ऊतक व्यवधान और सेल का इस्तेमाल lysis ठंड की स्थिति, केंद्रापसारक के तहत, और सेलुलर मलबे से नाभिक की जुदाई । 4 नाभिक कई microfluidic छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों पर बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए अलग किया जा सकता है । 4 , 7 , 24 , 25 इस विधि समय में एक पल में कोशिकाओं के हजारों की transcriptional गतिविधि का एक स्नैपशॉट के लिए अनुमति देता है ।

अलगाव और अनुक्रमण से पहले कोशिकाओं से नाभिक जारी करने के लिए कई रणनीतियों, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं । यहां, हम वर्णन और दो प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA-Seq: डिटर्जेंट यांत्रिक lysis और hypotonic-यांत्रिक lysis के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी से नाभिक के अलगाव सक्षम करें । डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis पूर्ण ऊतक विघटन और नाभिक के एक उच्च अंतिम उपज प्रदान करता है । Hypotonic यांत्रिक-lysis ऊतक विघटन के एक नियंत्रणीय डिग्री शामिल है, मात्रा और अंतिम परमाणु उपज की शुद्धता के बीच एक संतुलन का चयन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं । इन दृष्टिकोणों तुलनीय आरएनए उपज प्रदान करते हैं, नाभिक प्रति जीन की संख्या का पता चला, और सेल-प्रकार रूपरेखा और भी दोनों सफलतापूर्वक snRNA-Seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी पशु काम एक राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक पशु देखभाल और उपयोग समिति के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया । पुरुष और महिला ICR/CD-1 वाइल्ड-टाइप चूहों के संतुलित नमूनों, 8 और 12 सप्ताह पुराने के बीच, सभी प्रयोगों के लिए उपयोग किया गया । चूहों को स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

1. सामग्री और बफ़र्स की तैयारी

  1. सभी बफ़र्स उपयोग के दिन और बर्फ पर पूर्व चिल तैयार ( 1 तालिकादेखें) ।
    1. यदि डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis का उपयोग कर, डिटर्जेंट lysis बफर तैयार (> ५०० नमूना प्रति μL), कम सुक्रोज बफर (> नमूना प्रति 6 मिलीलीटर), सुक्रोज घनत्व बफर (> १२.५ एमएल प्रति नमूना), और resuspension समाधान (> 1 एमएल) ।
    2. यदि hypotonic-यांत्रिक lysis का उपयोग कर, hypotonic lysis बफर तैयार (> 5 नमूना प्रति मिलीलीटर), HEB मध्यम (> नमूना प्रति 5 मिलीलीटर), कम सुक्रोज बफर (> नमूना प्रति 3 मिलीलीटर), सुक्रोज घनत्व बफर (> 12.5 मिलीलीटर प्रति नमूना), और resuspension समाधान (> 1 एमएल) ।
    3. dithiothreitol के 25 μL जोड़ें (डीटीटी) कम सुक्रोज बफर के 25 मिलीलीटर और μL घनत्व ढाल बफर के 25 मिलीलीटर के लिए एक और 25 डीटीटी बस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले ।
  2. कवर एल्यूमीनियम के साथ विदारक सतह पंनी कागज तौलिए या बेंच संरक्षक, जो microfluidic एकल नाभिक पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया चैनल रोकना कर सकते है से फाइबर के साथ नमूने के संदूषण को कम करने के लिए ।
  3. स्प्रे विदारक उपकरण और एक RNase संक्रमण समाधान के साथ बेंच अंतरिक्ष । इसके अतिरिक्त, Dounce homogenizer ट्यूब के अंदर स्प्रे (यदि डिटर्जेंट-यांत्रिक कोशिका lysis का उपयोग) और ओक रिज ट्यूब एक RNase दूषण समाधान के साथ । बाहर Dounce और ultrapure, RNase मुक्त पानी के साथ ओक रिज ट्यूब कुल्ला ।
  4. पूर्व चिल सभी संग्रह ट्यूबों (५० एमएल शंकु, ओक रिज) और बर्फ पर Dounce homogenizer ट्यूबों ।
  5. आग पाश्चर पिपेट की एक श्रृंखला पोलिश (यदि hypotonic का उपयोग कर-यांत्रिक कोशिका lysis) ।

2. रीढ़ की हड्डी की तैयारी

  1. यदि ताजा ऊतक का उपयोग कर, सह2 साँस लेना द्वारा माउस euthanize । इच्छामृत्यु के बाद, नमूना में बाल संदूषण को कम करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ माउस का कोट स्प्रे ।
  2. माउस को तेज, RNase-फ्री सर्जिकल कैंची से Decapitate । अगले, धीरे संदंश के साथ उदर त्वचा उठाने और शरीर की लंबाई के साथ एक चीरा बनाने के लिए भीतरी अंगों का पर्दाफाश ।
  3. अंतड़ी के भीतरी अंगों को खींचकर शरीर गुहा से संदंश का प्रयोग करते हुए माउस को. इस क्षेत्र को साफ करने के लिए या अंगों को हटाने के रूप में इस दूषित पदार्थों का परिचय हो सकता है कागज तौलिए का उपयोग न करें । कैंची का प्रयोग, L2 और L3 रीढ़ की हड्डी कशेरुकाओं के बीच कशेरुका कॉलम में कटौती ।
    नोट: अभ्यास के साथ, इस कदम से कम 30 सेकंड में प्राप्त किया जा सकता है ।
    1. रीढ़ की हड्डी को बाहर निकालने के लिए, एक 25 ग्राम ¼ इंच सुई के साथ बर्फ ठंड पंजाब युक्त एक 3 मिलीलीटर सिरिंज फिट । कशेरुका कॉलम के त्रिक अंत में सुई की नोक प्लेस । सुई की नोक के चारों ओर एक तंग सील बनाने के लिए कशेरुकाओं चुटकी और रीढ़ की हड्डी rostrally बेदखल करने के लिए गोताख़ोर पर नीचे प्रेस करने के लिए दो उंगलियों का प्रयोग करें । एक पेट्री डिश में स्पाइनल कॉर्ड को आइस-कोल्ड पंजाबियों के साथ लगाएं ।
    2. इस बिंदु पर, ऊतक और दुकान फ्रीज-८० ° c या या तो डिटर्जेंट-यांत्रिक (चरण 3) या hypotonic-यांत्रिक (चरण 4) lysis के लिए तुरंत उपयोग करें ।
  4. यदि जमे हुए ऊतकों का उपयोग, सूखी बर्फ पर ऊतक बनाए रखने, डिटर्जेंट-यांत्रिक (चरण 3) या hypotonic-यांत्रिक (चरण 4) lysis के लिए आगे बढ़ना ।

3. डिटर्जेंट-मैकेनिकल सेल Lysis

  1. एक पूर्व ठंडा Dounce homogenizer में काठ का रीढ़ की हड्डी प्लेस और जोड़ें ५०० एमएल पूर्व ठंडा डिटर्जेंट lysis बफर ।
    नोट: एक माउस काठ का रीढ़ की हड्डी है ३२५.५ मिलीग्राम ± ६३.९ एमजी मानक त्रुटि (SEM, N = 4) का मतलब है । ५० मिलीग्राम – ऊतक के 1.5 ग्राम सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. मूसल ए (' ढीले ' मूसल) के ५ स्ट्रोक्स के साथ Dounce, तो मूसल बी के 5-10 स्ट्रोक (' टाइट ' खल). स्ट्रोक के बीच में lysis समाधान के बाहर homogenizer उठाने से बचें और बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  3. एक ४० मिमी छलनी पर एक पूर्व ठंडा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब और कम सुक्रोज बफर के 1 मिलीलीटर के साथ prewet रखें ।
  4. lysis बफर में क्रूड नाभिक युक्त Dounce homogenizer करने के लिए कम सुक्रोज बफर की 1 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण 2 – 3 बार.
  5. पूर्व ठंडा ५० एमएल शंकु ट्यूब में ४० mm छलनी पर कच्चे नाभिक प्रस्तुत करने के पास ।
  6. ४० mm छलनी पर एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर कम सुक्रोज बफर पास, कम सुक्रोज बफर के 3 मिलीलीटर और lysis बफर के ५०० मिलीलीटर के अंतिम मात्रा लाने ।
  7. दोहराएँ कदम 3.1 – 3.6 यदि एकाधिक डोरियों संयोजन, एक ही शंकु ट्यूब में पूलिंग.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३,२०० x g पर नमूना केंद्रापसारक । एक बार केंद्रापसारक पूरा हो गया है, supernatant । चरण 5 पर आगे बढ़ें ।

4. Hypotonic-मैकेनिकल सेल Lysis

  1. एक टिशू कल्चर डिश में hypotonic lysis बफर के 5 मिलीलीटर में काठ की रीढ़ की हड्डी रखें । रीढ़ की हड्डी bisect करने के लिए वसंत कैंची के कुंद अंत का प्रयोग करें, तो वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए 3 में गर्भनाल काट-4 मिमी टुकड़े, लेकिन भरती नहीं है ।
    नोट: ५० मिलीग्राम – ऊतक के 1.5 g सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. 15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन, 2-3 बार घूमता ।
  3. hypotonic lysis बफर को पतला करने के लिए HEB मीडियम के 5 मिलीलीटर डालें ।
  4. Triturate ऊतक के साथ 10 बार एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट, या जब तक ऊतक के टुकड़ों के सभी पिपेट के उद्घाटन के माध्यम से आसानी से ले जाने के लिए ।
  5. Triturate तीन आग पॉलिश पाश्चर पिपेट की एक श्रृंखला के साथ उत्तरोत्तर संकीर्ण व्यास (~ 900-600 मिमी) के साथ ।
    1. प्रत्येक पिपेट के लिए, triturate 5-15 बार, ऊतक बसने के लिए अनुमति देते हैं, असंबद्ध नाभिक युक्त supernatant के 1-2 मिलीलीटर को हटाने और एक पूर्व ठंडा ५० एमएल शंकु ट्यूब में एक ४० मिमी छलनी से गुजारें ।
    2. सबसे छोटे आकार के पाश्चर पिपेट के साथ trituration के बाद, सुनिश्चित करें कि homogenate पिपेट टिप के माध्यम से आसानी से बहती है । शेष समाधान ४० मिमी छलनी पर ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पास ।
      नोट: triturations की कुल संख्या के रूप में समायोजित किया जा सकता है वांछित । माउस स्पाइनल कॉर्ड का मेनिन्जेस रहेगा, लेकिन रीढ़ की हड्डी के किसी भी दृश्य हिस्से को triturate करना जरूरी है । ४० मीटर छलनी पर शेष homogenate पास । trituration के दौरान बुलबुले शुरू करने से बचें ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १,००० x g पर फ़िल्टर्ड नमूना केंद्रापसारक । एक बार जब पूरा हो गया है, खिचड़ी भाषा और supernatant त्याग । चरण 5 पर आगे बढ़ें ।

5. Homogenization और सुक्रोज घनत्व ढाल

  1. या तो चरण 3 या 4 के बाद, कम सुक्रोज बफर के 3 मिलीलीटर का उपयोग कर गोली resuspend । धीरे दीवार से गोली हटाने के लिए भंवर की सुविधा के लिए घूमता है । नमूना 2 मिनट के लिए बर्फ पर बैठते हैं और एक ओक रिज ट्यूब को निलंबन हस्तांतरण करते हैं ।
  2. 1 की स्थापना पर homogenizer का उपयोग करना, homogenize कम सुक्रोज बफर में नाभिक के लिए 15 – 30 एस, बर्फ पर नमूना रखते हुए.
    नोट: का प्रयोग करें 15 अगर एक काठ का रीढ़ की हड्डी या 30 एस का उपयोग कर अगर परित नमूने या एक पूरी रीढ़ की हड्डी का उपयोग कर एस ।
  3. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट, परत कम सुक्रोज बफर homogenate के नीचे घनत्व सुक्रोज बफर के १२.५ मिलीलीटर का उपयोग करना, ध्यान में एक बुलबुला है कि घनत्व परतों को बाधित नहीं बना रही ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ३,२०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  5. एक बार केंद्रापसारक पूरा हो गया है, तुरंत एक झटका गति में supernatant की खिचड़ी भाषा ।
    नोट: यदि एक कम मात्रा और क्लीनर अंतिम नमूना उत्पादन करने के लिए वांछित एक अवशिष्ट मात्रा (सुक्रोज बफर के कम से ४०० एमएल) छोड़ दिया जा सकता है, लेकिन इस अवशिष्ट मात्रा नाभिक शामिल करता है और नाभिक उपज को अधिकतम करने के लिए संरक्षित किया जा सकता है ।
  6. resuspension समाधान के १०० एमएल-1 एमएल का उपयोग कर, दीवार पर शेष नाभिक resuspension । डिटर्जेंट आधारित तैयारी के साथ रहता है कि myelin ' सिकोड़ें ' से बचें ।
  7. एक 30-35 मिमी ताकना-आकार छलनी के माध्यम से नाभिक फ़िल्टर और एक पूर्व ठंडा ट्यूब में इकट्ठा ।
  8. एक 10x उद्देश्य के तहत नाभिक गिनती करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कर नाभिक उपज निर्धारित करें ।
    नोट: Trypan ब्लू नाभिक, जो नीला दिखाई देना चाहिए visualize करने के लिए जोड़ा जा सकता है । सेलुलर मलबे की मात्रा पर ध्यान दें ।
  9. या तो चरण 6 या 7 के लिए आगे बढ़ें ।

6. व्यापक समानांतर snRNA-अनुक्रमण: शैक्षणिक मंच7

  1. पहले निम्नलिखित संशोधनों के साथ7 वर्णित के रूप में बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA अनुक्रमण (उदा, ड्रॉप-Seq) विधि प्रदर्शन:4
    1. २२५ नाभिक प्रति एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए नाभिक समायोजित करें ।
    2. प्रति मिलीलीटर २५० मोतियों की एकाग्रता पर बारकोड मोती तैयार करें ।
    3. ०.७% sarkosyl के साथ lysis बफ़र तैयार करें ।
    4. मोती के लिए ३५ मिलीलीटर प्रति मिनट के लिए प्रवाह दरों को समायोजित करें, नाभिक के लिए प्रति मिनट ३५ मिलीलीटर, और प्रति मिनट २०० मिलीलीटर तेल के लिए ।

7. व्यापक समानांतर snRNA-अनुक्रमण: वाणिज्यिक मंच26

  1. निंनलिखित संशोधन के साथ निर्माता के निर्देश26 के अनुसार वाणिज्यिक मंच (उदाहरणके लिए, क्रोमियम एकल सेल जीन अभिव्यक्ति समाधान) उत्पादों का उपयोग कर बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA अनुक्रमण प्रदर्शन:
    1. रिवर्स-प्रतिलेखन के बाद, सीडीएनए प्रवर्धन के लिए चक्रों की गणना की संख्या के लिए एक अतिरिक्त पीसीआर चक्र जोड़ने के लिए लक्षित सेल वसूली के आधार पर नाभिक से कोशिकाओं की तुलना में कमी हुई सीडीएनए के लिए क्षतिपूर्ति ।

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Representative Results

यहाँ, हम बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क माउस काठ रीढ़ की हड्डी से नाभिक का अलगाव प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल तीन मुख्य घटक शामिल: ऊतक व्यवधान और सेलुलर lysis, homogenization, और सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक (चित्रा 1) । सेकंड के भीतर, डिटर्जेंट यांत्रिक lysis नाभिक की एक बड़ी संख्या के साथ ही सेलुलर और ऊतक मलबे (चित्रा 2a, तालिका 2) के साथ एक कच्चे नाभिक तैयारी उपज । पंद्रह मिनट के बाद, hypotonic-यांत्रिक lysis एक कच्चे नाभिक तैयारी है कि कम मलबे था उपज है, लेकिन यह भी कम नाभिक (चित्रा 2 बी, 1 टेबल) । दोनों तैयारियां homogenization (चित्रा 2c और डी) और ०.०४% BSA (चित्रा 2E और एफ) के साथ पंजाब में निलंबन से पहले सुक्रोज घनत्व ढाल केंद्रापसारक गुजरा । एक औसत पर, एक माउस काठ का रीढ़ की हड्डी (३२५.५ मिलीग्राम ± ६३.९ का मतलब के मानक त्रुटि मिलीग्राम, SEM, n = 4) ५.१ x 105 नाभिक (± ६.३ x 104 SEM, n = 3) के बाद डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis और २.० x 105 नाभिक (± ५.९ x 104 SEM, N = 3) hypotonic-यांत्रिक lysis के बाद । काठ की रीढ़ की हड्डी में नाभिक की संख्या डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल में Dounce homogenization के बाद प्रारंभिक कच्चे तेल की तैयारी से अनुमान लगाया गया था (२.६ x 106 नाभिक ± ४.० x 105 SEM, N = 3, तालिका 2) । डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल से अंतिम नमूना प्रारंभिक नाभिक के 20% के होते है (± 2% SEM, N = 3, 2 तालिका) । hypotonic-यांत्रिक lysis निंनलिखित trituration से क्रूड नाभिक तैयारी (± 2% SEM, N = 3, तालिका 2) प्रारंभिक नाभिक के ६२% शामिल हैं । अंतिम hypotonic-यांत्रिक lysis नमूना प्रारंभिक नाभिक (± 1% SEM, N = 3, तालिका 2) के केवल 8% शामिल हैं । हम कुल आरएनए उपज या दो तैयारी तरीकों के बीच एक गृह व्यवस्था जीन (Gapdh) के लिए सीडीएनए उपज में कोई अंतर का पता नहीं था । qPCR का प्रयोग, डिटर्जेंट विधि ४६३.७ एनजी (± ९८.९ SEM झुकेंगे, N = 6) कुल आरएनए के और एक औसत पता लगाने दहलीज चक्र के २५.२ (± १.३ sem) Gapdh सीडीएनए के लिए qPCR द्वारा और hypotonic विधि ४१९.२ एनजी (± ८५.३ sem, N = 6) कुल आरएनए के और एक औसत पता लगाने दहलीज झुकेंगे Gapdh सीडीएनए (± ०.८ SEM) के लिए २६.१ का चक्र । दो lysis विकल्प दोनों मुश्किल से नाभिक-अलग कर देना ऊतकों को अलग और बहाव एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता वाली सामग्री प्रदान करते हैं ।

बहाव के लिए microfluidic चैनलों के आकार को देखते हुए बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक अनुक्रमण प्लेटफार्मों, यह इनपुट करने के लिए महत्वपूर्ण है एक नाभिक निलंबन मुक्त बड़े कणों या सेलुलर मलबे कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद, वहां Macosko एट अल से अनुकूलित मंच पर कॉलेस्ट्रॉल के कोई उदाहरण थे । २०१५ (n = 17) और वाणिज्यिक मंच (n = 16) पर एक आंशिक रोकना ।

डिटर्जेंट-यांत्रिक और hypotonic-यांत्रिक प्रक्रियाओं दो बड़े पैमाने पर समानांतर छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों के लिए सफलतापूर्वक नाभिक को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया और प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3में दिखाए जाते हैं । इन तरीकों के दोनों नाभिक के हजारों की transcriptional रूपरेखा सक्षम है, और वयस्क माउस काठ का रीढ़ की हड्डी में सेल प्रकार के वर्गीकरण (चित्रा 3) । 4 इन दृष्टिकोणों प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए नाभिक प्रति तुलनीय जीन में परिणाम (3 सी और डी) । दो प्लेटफार्मों के बीच इनपुट नाभिक की वसूली की दरें अलग । मंच Sathyamurthy एट अल से संशोधनों के साथ Macosko एट अल. २०१५ से अनुकूलित । २०१८ नाभिक का अनुमानित ०.५९% (± ०.०५% SEM, N = 17) बरामद किया है, जबकि वाणिज्यिक मंच एक अनुमानित ५३.७% नाभिक (n = 2) बरामद किया ।

इस प्रोटोकॉल को थोड़ा अंतिम तैयारी में ंयूरॉन नाभिक के लिए समृद्ध । काठ का रीढ़ की हड्डी ऊतक वर्गों में, हमने पाया है कि नाभिक के 27% ंयूरॉंस मार्कर NeuN (N = ७,३६८ नाभिक 2 पशुओं से) के लिए सकारात्मक थे, जबकि काठ का रीढ़ की हड्डी के डिटर्जेंट यांत्रिक नाभिक की तैयारी के परिणामस्वरूप कुल नाभिक व्यक्त NeuN के ३१.९%, के रूप में प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई द्वारा निर्धारित (FACS, ± २.०% SEM, N = 13 स्वतंत्र नाभिक प्रत्येक तैयारी में कई जानवरों से परित नमूने का उपयोग तैयारी, 4 चित्रा) । यह क्या NeuN के प्रतिशत के लिए पहले देखा गया है के समान है-सकारात्मक नाभिक पूरे रीढ़ की हड्डी में (20% से 24% की उंर के आधार पर),27 ग्रीवा और वक्ष क्षेत्रों है कि अधिक सफेद बात है और oligodendrocytes शामिल हैं । नोट की, NeuN/Rbfox3 सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त नहीं किया जाता है और, तदनुसार, इन नंबरों की संभावना मामूली आंक रहे हैं. यह संभव है कि छोटे गैर-न्यूरॉनी कोशिकाओं को थोड़ा सुक्रोज ढाल शुद्धि के दौरान समाप्त हो जाता है । इसके अलावा, अनुप्रवाह छानने और विश्लेषण मानकों के बाद अनुक्रमण अंतिम सेल प्रकार के वितरण में परिवर्तन हो सकता है क्योंकि न्यूरॉन्स नाभिक प्रति अधिक जीन है (आंकड़ा 3 सी और डी) और, इसलिए, कम से हटा दिया जा करने की संभावना है फ़िल्टरिंग प्रक्रिया के दौरान ।

इस प्रोटोकॉल है कि देखभाल की आवश्यकता में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । पहले, अत्यधिक douncing या trituration (चरण 3 या 4 में क्रमशः) सेलुलर मलबे और कण गठन में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि निस्पंदन और सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक बड़े कणों को अलग कर सकते हैं, एक बार छोटे कणों सेलुलर lysis के दौरान उत्पन्न कर रहे हैं, वे दूर करने के लिए मुश्किल हैं । दूसरे, homogenization के दौरान, homogenizer सीधे ओक रिज ट्यूब के तल पर जगह नहीं है । इसके बजाय, homogenizer के अंत को कम सुक्रोज युक्त समाधान में जलमग्न नाभिक, ट्यूब के नीचे छूने के बिना । Homogenization सेलुलर मलबे को हटाने और झुरमुट और multiplets (चित्रा 5) को कम करने से परमाणु अलगाव में सुधार । सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक के बाद, यह तुरंत केंद्रापसारक से ओक रिज ट्यूब हटाने के लिए महत्वपूर्ण है, और जल्दी से एक तेजी से ' झाड़ू ' गति में supernatant नहीं कर सकते । जब ओक रिज ट्यूब की दीवार से resuspend नाभिक, myelin बैंड और ट्यूब के नीचे के बीच आधे रास्ते से ' नमकीन ' गोली resuspend । ध्यान दें कि गोली दिखाई नहीं हो सकता है । ट्यूब के साथ नाभिक उच्च resuspend नाभिक तैयारी में myelin संदूषण में परिणाम हो सकता है । सेलुलर lysis और सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक कदम कण है कि बहाव आवेदन के लिए microfluidic चैनलों को रोकना हो सकता है को कम करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण हैं ।

सामग्री का नाम/ शेयर एकाग्रता अंतिम एकाग्रता मात्रा/
डिटर्जेंट Lysis बफर
कम सुक्रोज बफ़र - - ६०० μL
ट्राइटन-X 20 ०.१०% 3 μL
Hypotonic Lysis बफर
Tris-HCl (pH = ७.४) 1 मीटर 10 एमएम १०० μL
Nacl 5 मीटर 10 एमएम 20 μL
MgCl२ 1 मीटर 3 मिमी 30 μL
Nonidet P40 - ०.०१% 1 μL
Nuclease-मुफ्त पानी 10 मिलीलीटर तक
HEB माध्यम
हाइबरनेट-A - - 10 मिलीलीटर
Glutamax - - १०० μL
B27 - - २०० μL
कम सुक्रोज बफ़र
Sucrose - ०.३२ मीटर २.७५ छ
HEPES (pH = ८.०) 1 मीटर 10 एमएम २५० μL
CaCl२ 1 मीटर 5 मिमी १२५ μL
MgAc 1 मीटर 3 मिमी ७५ μL
EDTA ०.५ मीटर ०.१ एमएम 5 μL
डीटीटी 1 मीटर 1 मिमी 25 μL
Nuclease-मुफ्त पानी 25 मिलीलीटर तक
सुक्रोज घनत्व बफर
Sucrose - 1 मीटर ८.६ छ
HEPES (pH = ८.०) 1 मीटर 10 एमएम २५० μL
MgAc 1 मीटर 3 मिमी ७५ μL
डीटीटी 1 मीटर 1 मिमी 25 μL
Nuclease-मुफ्त पानी 25 मिलीलीटर तक
resuspension समाधान
1x पंजाब - - 1 मिलीलीटर
Bsa 20 मिलीग्राम/एमएल ०.४ मिलीग्राम/एमएल 20 μL
RNAse अवरोधक ४० यू μL/ ०.२ यू μL/ 5 μL

तालिका 1: समाधानों की तालिका ।

कच्चे तेल Homogenized अंतिम
डिटर्जेंट-यांत्रिक १०० ± 15% ८७ ± 9% 20 ± 2%
Hypotonic-यांत्रिक ६२ ± 12% ३५ ± 4% 8 ± 1%

तालिका 2: प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण पर नाभिक की उपज । डिटर्जेंट-मैकेनिकल lysis प्रोटोकॉल में dounce homogenization के बाद शुरुआती क्रूड की तैयारी में नाभिक की संख्या काठ की रीढ़ की हड्डी में नाभिक की संख्या का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल की गई थी । प्रारंभिक नाभिक यील्ड (२.६ x 106 नाभिक ± ४.० x 105 SEM, N = 3) दोनों डिटर्जेंट-और hypotonic-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल के लिए प्रत्येक बहाव कदम पर नाभिक उपज की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । hypotonic-यांत्रिक तैयारी द्वारा पृथक नाभिक की संख्या अनुमानित आरंभिक नाभिक को सामान्यीकृत कर दी गई. तालिका में मान ± SEM मतलब है, N = 3 ।

Figure 1
चित्रा 1: परमाणु अलगाव की योजनाबद्ध । वयस्क रीढ़ की हड्डी से नाभिक डिटर्जेंट-यांत्रिक या hypotonic-यांत्रिक कोशिका lysis का उपयोग कर अलग किया जा सकता है, homogenization द्वारा पीछा, और सुक्रोज घनत्व ढाल केंद्रापसारक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि brightfield और प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम पर DAPI-सना हुआ नाभिक.  (A, B) क्रूड नाभिक निम् न डिटर्जेंट-यांत्रिक या hypotonic-यांत्रिक lysis. (सी, डी) नाभिक म् homogenization । (ङ, च) नाभिक ०.०४% BSA निंनलिखित सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक के साथ पंजाब में resuspend । नाभिक 2% paraformaldehyde और बाद में Trypan नीले या DAPI का उपयोग दाग के साथ तय किया गया । छवियां 10x में लिया (स्केल बार = १०० µm) brightfield और महामारी-प्रतिदीप्ति का उपयोग कर रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अनुक्रम नाभिक के प्रतिनिधि tSNE भूखंड: डिटर्जेंट यांत्रिक और hypotonic यांत्रिक lysis का उपयोग कर. (क) १७,००० से अधिक नाभिक पर अनुक्रमण से प्राप्त परिणाम विच्छेदित वयस्क माउस काठ रीढ़ की हड्डी निंनलिखित डिटर्जेंट यांत्रिक lysis और Sathyamurthy एट अल से संशोधनों के साथ Macosko एट अल. २०१५ के अनुसार । २०१८. यह आंकड़ा Sathyamurthy एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । २०१८.४ (ख) sequencing से प्राप्त परिणाम ५,००० नाभिक बाहर निकाले वयस्क काठ का रीढ़ की हड्डी के बाद से hypotonic-यांत्रिक lysis और एक वाणिज्यिक microfluidic एकल सेल encapsulation मंच. 26  (सी, घ) नाभिक के प्रति औसत जीन वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ± SEM में प्रमुख कोशिका प्रकार के clustering निंनलिखित परिणाम । नोट की, डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis प्रक्रिया Macosko एट अलद्वारा पीछा किया । २०१५ मंच विच्छेदित काठ का रीढ़ की हड्डी का उपयोग किया गया था, जबकि वाणिज्यिक मंच द्वारा पीछा hypotonic यांत्रिक lysis बाहर निकाले काठ का रीढ़ की हड्डी का उपयोग किया गया (जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित) । यह देखते हुए कि नाल निकालने से बाडी और पृष्ठीय रूट गैंग्लिया को हटा दिया जाता है, मस्तिष्कावरणीय/Schwann सेल क्लस्टर चित्रा बी और डीसे अनुपस्थित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: NeuN के FACS भूखंड+ नाभिक निंनलिखित डिटर्जेंट यांत्रिक lysis । FACS तय नाभिक NeuN के लिए दाग दिखा भूखंड (कुल नाभिक ± २.०% SEM, N = 13 का औसत ३१.९%), पृथक डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल का उपयोग कर । तत्काल निर्धारण के लिए, FACS सत्यापन के लिए नाभिक, एक क्रूड नाभिक तैयारी रीढ़ की हड्डी में डिटर्जेंट-यांत्रिक तैयारी का उपयोग कर के dounce homogenization द्वारा प्राप्त किया गया था, तत्काल निर्धारण के साथ 1% पीएफए के साथ एक 5 मिनट की मशीन अवधि के साथ. निर्धारण २५० मिमी glycine के साथ बुझती थी, और नाभिक एकत्र किए गए थे । विरोधी NeuN एंटीबॉडी के साथ धुंधला समाधान में प्रदर्शन किया गया । FACS पर प्रदर्शन किया गया था फिक्स्ड, NeuN सना नाभिक एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: homogenization बिना नाभिक तैयारी । नाभिक एक डिटर्जेंट यांत्रिक या बी hypotonic-यांत्रिक lysis, homogenization के बिना निंनलिखित सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक से पहले resuspend थे । * सेलुलर मलबे से जुड़ी नाभिक (क) और सेलुलर मलबे से जुड़ी नाभिक की एक multiplet (ख)का अर्थ है. नाभिक ०.०४% BSA निंनलिखित सुक्रोज घनत्व केंद्रापसारक के साथ पंजाब में resuspend । नाभिक 2% paraformaldehyde और बाद में Trypan नीले या DAPI का उपयोग दाग के साथ तय किया गया । छवियां 10x (स्केल बार १०० µm) brightfield और महामारी-प्रतिदीप्ति का उपयोग कर लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य बहाव transcriptional विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए युक्त नाभिक को अलग करने के लिए है । हम snRNA-Seq तरीके अनुकूलित करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी में कोशिका प्रकार के सभी प्रोफ़ाइल के लिए । शुरू में, हमने पाया है कि ठेठ कोशिका पृथक्करण तरीकों एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए अप्रभावी थे, रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के रूप में विशेष रूप से कोशिका मृत्यु के लिए असुरक्षित हैं. इसके अलावा, सेल पृथक्करण तरीके विभिंन गतिविधि की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित-और कई सौ गुना तक तनाव प्रतिक्रिया जीन । 3 , 4 , 16 सिंगल सेल की तैयारियों से जुड़ी कमियां देखते हुए हमने और दूसरों ने नाभिक को एक विकल्प के तौर पर इस्तेमाल किया है । 16 , 17 , 18 , 24 इस विधि भी मानव ऊतक पर इस्तेमाल किया जा सकता है, जमे हुए रीढ़ की हड्डी के ऊतकों सहित । 4 , 19 , 24 यहां, हम शक्तियों और इस दृष्टिकोण की सीमाओं का वर्णन करेंगे ।

इस विधि की ताकत के साथ ही दोनों ताजा और जमे हुए ऊतक का उपयोग करने की क्षमता के साथ-साथ प्रयोगात्मक प्रेरित IEGs के परिहार शामिल हैं । 4 इस प्रकार, इस दृष्टिकोण एक व्यवहार या उत्तेजना के बाद IEGs अंतर्जात जांच के लिए उपयोगी हो सकता है । 1 , 3 , 4 इस विधि के लाभों में से एक यह है कि यह बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक अनुक्रमण के लिए नाभिक के उपयोग के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, लेकिन Macosko एट अल. २०१५ द्वारा विकसित मंच का उपयोग कर सकते हैं, के मामूली समायोजन के साथ lysis बफर और प्रवाह दर, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों का उपयोग करें । इसके अलावा, एकल नाभिक अनुक्रमण कोशिका प्रकार की पहचान के लिए एक सेल अनुक्रमण के लिए है कि एक तुलनीय विधि साबित हो रहा है, इस दृष्टिकोण की ताकत के लिए ऋण । 28 , 29 हालांकि, इस दृष्टिकोण की कई महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । नाभिक सेलुलर mRNA,29 के लगभग 20-50% होते है और यह एक सेल अनुक्रमण की तुलना में नाभिक प्रति टेप की एक कम संख्या में परिलक्षित होता है । 18 , intronic सहित 29 snRNA से पढ़ता-Seq पता चला जीन की संख्या बढ़ाने के लिए एक दृष्टिकोण है.

वहां कई उपलब्ध प्रोटोकॉल है कि ऊतक से नाभिक के अलगाव को सक्षम कर रहे हैं । 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 सबसे अंय तरीकों के साथ तुलना में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल myelin हटाने, ultracentrifugation, या कई केंद्रापसारक कदम या धुल जाता है कि नाभिक के अंतिम संख्या कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते है की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल ४५ मिनट लेता है (डिटर्जेंट-यांत्रिक) या 1 घंटे (hypotonic-यांत्रिक) को पूरा करने के लिए । वाणिज्यिक microfluidic प्लेटफार्मों पर समर्थित प्रोटोकॉल से अधिक समय दोगुना कर रहे हैं, और कई और अधिक केंद्रापसारक कदम की आवश्यकता है, नाभिक खोने का खतरा बढ़ रहा है । नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल है कि केवल lysis और फ़िल्टरिंग शामिल करने के साथ इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत तरीकों को अंतिम नाभिक की पवित्रता बढ़ाने के लिए एक सुक्रोज ढाल शामिल हैं । यह कदम सफेद पदार्थ और जिसके परिणामस्वरूप myelin मलबे के बड़े प्रतिशत के कारण वयस्क रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए आवश्यक है ।

डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल पूरा ऊतक पृथक्करण और lysis के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और hypotonic-यांत्रिक lysis प्रोटोकॉल बहाव आवेदन में अनुमति ऊतक पृथक्करण और सेलुलर मलबे की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन प्रोटोकॉल जैव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बैंक सामग्री, अलग कर देना ऊतकों के लिए मुश्किल और बहाव व्यापक समानांतर snRNA-Seq के लिए नाभिक के अलगाव के माध्यम से गतिविधि पर निर्भर transcriptional परिवर्तन की जांच के लिए । बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के अलावा, इस प्रोटोकॉल इम्यूनोफ्लोरेसेंस और FACS और epigenetic विश्लेषण सहित डीएनए मिथाइल अध्ययन और चिप-Seq के रूप में वैकल्पिक अनुप्रयोगों के लिए नाभिक को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 4 ). 23

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Disclosures

हम हित का खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम NINDS के अंदर प्रोग्राम (1 जिया NS003153 02) और NIDCD (1 जिया DC000059 18) के सहयोग से किया गया । हम अपनी तकनीकी सहायता और सहायक चर्चा के लिए एल ली और C.I. Dobrott धंयवाद, और सी. कठे पांडुलिपि की समीक्षा के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

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References

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  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Tags

तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४० नाभिक आरएनए अनुक्रमण snRNA-Seq बड़े पैमाने पर समानांतर रीढ़ की हड्डी सुक्रोज ढाल

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव
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Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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