ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.
Abstract
חיטוט ביטוי גנים של תא בודד מאפשר זיהוי סוג התא, התא המדינה. רצפי RNA בתא יחיד התפתחה כלי רב עוצמה עבור הלומדים פרופילים תעתיק של תאים, בעיקר ברקמות הטרוגנית כגון מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, שיטות דיסוציאציה הדרושים עבור רצף תא בודד יכול להוביל שינויים ניסיוני במוות תא וביטוי גנים. יתר על כן, שיטות אלה מוגבלים בדרך כלל רקמת טריים, ובכך יגביל מחקרים על ארכיון וחומר ביו-bank. רצף יחיד הגרעין RNA (snRNA-Seq) הוא חלופה ללימודים תעתיק, נתון מדויק זה מזהה סוגי תאים, מאפשר המחקר של רקמות קפוא או קשה לנתק, ומפחית דיסוציאציה-induced תמלול. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור בידוד מהיר של גרעינים על הזרם snRNA-תת סעיף. שיטה זו מאפשרת בידוד של גרעינים מדגימות חוט השדרה טרי או קפוא, יכול להיות משולב עם שתי פלטפורמות כימוס droplet בנפט מקבילים.
Introduction
מערכת העצבים מורכבת heterogenous קבוצות של תאים המציגים מערך מגוון של מאפיינים מורפולוגיים, ביוכימי, אלקטרופיזיולוגיות. בעוד רצף ה-RNA בצובר כבר שימושי לקביעת רקמות שינויים בביטוי הגנים בתנאים שונים, זה מונע זיהוי שינויים תעתיק ברמת תא בודד. התפתחויות אחרונות בניתוח גנים ברמת השעתוק בתא יחיד אפשרו את הסיווג של תאים heterogenous לקבוצות פונקציונליות בהתאם שלהם רפרטואר מולקולרית, אפילו ניתן למנף כדי לזהות קבוצות של נוירונים שהיו פעילים לאחרונה. 1 , 2 , 3 , 4 בעשר השנים האחרונות, הפיתוח של RNA לתא בודד רצף (scRNA-Seq) אפשרה המחקר של ביטוי גנים בתאים בודדים, ומספק תצוגה לתוך התא-סוג גיוון. 5
הופעתה של גישות מדרגי כגון scRNA-Seq בנפט מקבילים, סיפקה פלטפורמות לרקמות הטרוגנית רצף, כולל אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . עם זאת, תא בודד דיסוציאציה שיטות יכול להוביל מות תאים, כמו גם ניסיוני שינויים בביטוי הגנים. 16 עבודה יש להתאים לתא בודד שיטות עריכה ברצף כדי לאפשר שימור פרופילים תעתיק אנדוגני. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 אסטרטגיות אלו היו מתאים במיוחד עבור זיהוי מיידי ביטוי גנים (הרגל) מוקדם בעקבות גירוי חושי או התנהגות. 3 , 4 בעתיד, אסטרטגיה זו יכולה לשמש גם ללמוד שינויים דינמיים ברקמות מצבי מחלה או בתגובה ללחץ. השיטות האלה, רצף יחיד הגרעין RNA (snRNA-Seq) היא גישה מבטיח שלא מצריכה בתדר מתח התא דיסוציאציה, ניתן להשתמש קשה לנתק רקמה (כגון חוט השדרה), כמו גם קפוא רקמות. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted של שיטות קודמות של בידוד גרעינים,20,21,22,23,25 snRNA-Seq... בדרך כלל מנצל רקמות מהיר הפרעה ותא פירוק תחת בתנאי קור, צנטריפוגה, הפרדת הגרעינים מפני פסולת הסלולר. 4 הגרעינים ניתן לבודד עבור רצף הדור הבא במורד הזרם על פלטפורמות מרובות של כימוס droplet microfluidic. 4 , 7 , 24 , 25 בשיטה זו מאפשר תמונה של הפעילות תעתיק של אלפי תאים בכל רגע בזמן.
ישנן מספר אסטרטגיות עבור שחרור גרעינים מתאי לפני בידוד ורצף, כל אחת עם יתרונות וחסרונות משלהם. כאן, אנו מתארים ולהשוות בין שני פרוטוקולים כדי לאפשר בידוד של גרעינים של חוט השדרה למבוגרים עבור הזרם בנפט מקבילים snRNA-Seq: פירוק מכני דטרגנט והמסה היפוטוניק-מכניים. פירוק מכני דטרגנט מספק רקמות מלאה הפרעה תשואה הסופי גבוה יותר של גרעין האטום. היפוטוניק מכני-פירוק כולל תואר לשליטה של שיבוש רקמות, מתן הזדמנות עבור בחירת איזון בין כמות טוהר התשואה הגרעינית הסופית. גישות אלה לספק תשואה RNA דומות, שזוהו מספר גנים לכל גרעין, תא-סוג פרופיל, יכול גם לשמש גם בהצלחה snRNA-תת סעיף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל בעלי החיים העבודה בוצעה לפי פרוטוקול שאושרו על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה. מאוזן דגימות של זכר ונקבה ICR/CD-1 פראי-סוג עכברים, בין 8 ו- 12 שבועות הישן, שימשו עבור כל הניסויים. עכברים צריך להיות מטופל על פי הנחיות אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימוש מקומי.
1. הכנת חומרים, מאגרי
- להכין מאגרי כל היום השימוש ולהירגע מראש על קרח (ראה טבלה 1).
- אם באמצעות פירוק מכני דטרגנט, להכין מאגר פירוק דטרגנט (μL > 500 לכל דגימה), מאגר סוכרוז נמוך (> 6 מ"ל לכל דגימה), מאגר צפיפות סוכרוז (> מ"ל לכל דגימה), הפתרון resuspension (> 1 מ"ל).
- אם באמצעות פירוק מכני היפוטוניק, להכין את פירוק היפוטוניק מאגר (> 5 מ"ל לכל דגימה), מצגת בינוני (> 5 מ"ל לכל דגימה), מאגר סוכרוז נמוך (> 3 מ"ל לכל דגימה), מאגר צפיפות סוכרוז (> מ"ל לכל דגימה), ואת הפתרון resuspension (> 1 מ"ל).
- להוסיף 25 μL של dithiothreitol (DTT) 25 mL המאגר סוכרוז נמוך וμl 25 נוספת של DTT 25 מ של המאגר הדרגתי של צפיפות סוכרוז רק לפני שמתחילים את הפרוטוקול.
- לכסות את המשטח ויבתר ברדיד אלומיניום כדי למזער את הזיהום של המדגם בסיבי מגבות נייר או ספסל, מגנים יכולים להיסתם ערוצי microfluidic המשמש עבור לכידת יחיד גרעינים.
- תרסיס ויבתר כלים ומרחב ספסל עם פתרון טיהור RNase. בנוסף, תרסיס הפנימי של צינור מהמגן דאונס (אם משתמש דטרגנט-מכניים תא פירוק), אלון רכס צינור עם פתרון טיהור RNase. לשטוף את הצינור דאונס ו- Oak Ridge עם הנדסה גנטית, RNase ללא מים.
- מקררים מראש כל אוסף צינורות (50 מ ל חרוט, אלון רכס), צינורות מהמגן דאונס על קרח.
- אש פולנית סדרה של פיפטות פסטר (אם משתמשים היפוטוניק-מכניים תא פירוק).
2. הכנה של חוט השדרה
- אם השימוש ברקמה טרייה, המתת חסד העכבר באמצעות אינהלציה2 CO. לאחר המתת חסד, לרסס את המעיל של העכבר עם 70% אתנול כדי למזער את הזיהום שיער במדגם.
- לערוף את העכבר עם חדה ונטולת RNase מספריים כירורגיים. בשלב הבא, להרים בעדינות את הבטן עור עם מלקחיים, בחתך לאורכו של הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.
- המעיים העכבר על ידי משיכת האברים הפנימיים מחלל הגוף באמצעות מלקחיים. אל תשתמש/י מגבות נייר כדי לנקות את האזור או להוציא איברים כמו זה עשוי להציג מזהמים. בעזרת מספריים, חותכים את עמוד השדרה בין החוליות בעמוד השדרה L2 ו- L3.
הערה: עם בפועל, שלב זה יכולה להיות מושגת תוך פחות מ- 30 שניות.- כדי להוציא חוט השדרה, להתאים 3 מ"ל המזרק המכיל PBS קר כקרח עם מחט ¼ אינץ 25 גרם. מניחים את קצה המחט לתוך הסוף בעמודה השדרה סאקרל. השתמש בשתי אצבעות כדי לצבוט החוליות כדי ליצור חותם צר סביב קצה המחט, לחץ למטה על הבוכנה כדי להוציא חוט השדרה rostrally. מקום חוט השדרה בצלוחית עם PBS קר כקרח.
- בשלב זה, הקפאת הרקמה לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס או לשימוש מיד חומר ניקוי מכני (שלב 3) או היפוטוניק-מכניים (שלב 4) פירוק.
- אם השימוש ברקמה קפוא, לשמור על הרקמה על קרח יבש, להמשיך דטרגנט-מכניים (שלב 3) או היפוטוניק-מכניים (שלב 4) פירוק.
3. חומרי ניקוי מכני תא פירוק
- למקם את חוט השדרה המותני מהמגן דאונס טרום מקורר ולהוסיף 500 מ"ל טרום מקורר מאגר פירוק דטרגנט.
הערה: חוט השדרה המותני העכבר הוא 325.5 mg ± 63.9 mg שגיאת התקן של הממוצע (SEM, N = 4). 50 מ"ג – 1.5 גרם רקמה ניתן להשתמש בהצלחה. - דאונס עם 5 קווים של שהעקב (כבעלי "חופשי"), ואז 5-10 קווים של שהעקב B ('חזק' במכתש ועלי). להימנע הרמת את מהמגן הפתרון פירוק בין קווים ולהימנע היכרות עם בועות.
- מניחים מסננת 40 מ מ צינור חרוטי טרום מקורר 50 מ ל, prewet עם 1 מ"ל סוכרוז נמוכה המאגר.
- להוסיף 1 מ"ל סוכרוז נמוכה המאגר מהמגן דאונס המכיל גרעינים גולמי במאגר של פירוק ומערבבים בעדינות על ידי pipetting 2 – 3 פעמים.
- לעבור את ההכנות גרעינים גסה מעל מסננת 40 מ מ לתוך הצינור חרוט טרום מקורר 50 מ.
- מאגר סוכרוז נמוך נוספים 1 מ"ל להעביר את מסננת 40 מ מ, להביא את עוצמת הקול הסופי 3 מ"ל של המאגר סוכרוז נמוך ו- 500 מ"ל של המאגר פירוק.
- חזור על שלבים 3.1-3.6 אם שילוב של מיתרי מרובים, איגוד בצינור חרוט אותו.
- Centrifuge הדגימה ב 3200 g x 10 דקות ב 4 º C. לאחר צנטריפוגה תושלם, decant את תגובת שיקוע. המשך לשלב 5.
4. היפוטוניק-מכניים תא פירוק
- מקום חוט השדרה המותני 5 מ של המאגר פירוק היפוטוניק בקערה תרביות רקמה. השתמש הצד הקהה של מעיין מספריים קטיעות חוט השדרה, ולאחר מכן להשתמש במספריים האביב ולחתוך את החוט לחתיכות 3 – 4 מ מ, אך לא ברר.
הערה: 50 מ ג g – 1.5 של רקמות ניתן להשתמש בהצלחה. - דגירה על הקרח למשך 15 דקות, מתערבל 2 – 3 פעמים.
- הוסף 5 מ של מצגת בינוני כדי לדלל את המאגר פירוק היפוטוניק.
- Triturate הרקמה 10 פעמים עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל, או עד כל החלקים של הרקמה לזוז בצורה חלקה דרך הפתח של פיפטה.
- Triturate עם סדרה של שלושה מלוטשים אש פסטר פיפטות עם קטרים בהדרגה צר יותר (~ 900-600 מ מ).
- עבור כל פיפטה, triturate 5 - 15 פעמים, לאפשר רקמות כדי ליישב, להסיר 1 – 2 מ"ל של תגובת שיקוע המכיל גרעינים הפומבית, לעבור מעל מסננת 40 מ מ לתוך צינור חרוטי טרום מקורר 50 מ ל.
- לאחר trituration עם פיפטה פסטר בגודל הקטן ביותר, ודא כי homogenate זורם בצורה חלקה דרך הקצה פיפטה. לעבור את הפתרון הנותרים מעל מסננת 40 מ מ לתוך הצינור חרוט 50 מ.
הערה: המספר הכולל של triturations ניתן לכוונן לפי הצורך. קרומי המוח של חוט השדרה העכבר יישאר, אבל חשוב triturate כל החתיכות גלוי של חוט השדרה. לעבור את homogenate הנותרים מעל מסננת 40 מ'. להימנע מהחדרה בועות במהלך trituration.
- Centrifuge המדגם המסוננות ב 1000 g x 10 דקות ב 4 º C. לאחר צנטריפוגה תושלם, decant ולמחוק את תגובת שיקוע. המשך לשלב 5.
5. המגון ומילוי הדרגתי צפיפות סוכרוז
- לאחר שלב 3 או 4, resuspend בגדר שימוש 3 מ"ל של סוכרוז נמוכה המאגר. מערבולת בעדינות כדי להסיר את צניפה מהקיר כדי להקל את resuspension. תן את הדגימה לשבת על קרח למשך 2 דקות, להעביר את המתלים שפופרת אוק רידג.
- באמצעות את מהמגן-setting 1, homogenize הגרעינים במאגר סוכרוז נמוך עבור s 15-30, שמירה על המדגם על קרח.
הערה: שימוש 15 s אם משתמש אחד השדרה המותני או 30 s אם משתמש איחדו דוגמאות או של חוט השדרה כולו. - באמצעות פיפטה סרולוגית, שכבה מ"ל של צפיפות מאגר סוכרוז מתחת homogenate מאגר סוכרוז נמוך, מטפל לא ליצירת בועה זה משבש את השכבות צפיפות.
- Centrifuge הצינורות-3,200 g x עבור 20 דקות ב 4 º C.
- לאחר צנטריפוגה תושלם, מיד decant את תגובת שיקוע בתנועה יתנגש.
הערה: נפח שיורית (פחות מ- 400 מ"ל) של סוכרוז מאגר יכול להיות מושלך במידת הצורך לייצר על עוצמה נמוכה יותר, לניקוי סופי מדגם, אך נפח שיורית זה מכילים גרעינים, יכול להישמר כדי למקסם את התשואה גרעינים. - באמצעות 100 מ ל- 1 מ של פתרון resuspension, resuspend גרעינים שנותרו על הקיר. הימנע מיאלין 'זועף' הנשאר הכנה המבוסס על חומרי ניקוי.
- לסנן את הגרעינים דרך מסננת גודל הנקבוביות 30 – 35 מ מ ולאסוף בשפופרת מראש צוננת.
- לקבוע הגרעינים תשואות באמצעות hemocytometer לספור גרעינים תחת מטרה X 10.
הערה: ניתן להוסיף Trypan blue להמחיש גרעינים, אשר אמור להופיע כחול. הערה את כמות פסולת הסלולר. - המשך לשלב 6 או 7.
6. בנפט מקבילי snRNA-רצף: פלטפורמה אקדמי7
- לבצע רצף מקביל בנפט snRNA (למשל, ירידה-Seq) השיטה כאמור תיאר7 עם השינויים הבאים:4
- להתאים את הגרעינים כדי ריכוז סופי של גרעינים 225 לכל mL.
- להכין חרוזים לבר-קוד-ריכוז של 250 חרוזים לכל mL.
- הכנת המאגר פירוק עם sarkosyl כ- 0.7%.
- להתאים את שיעור זרימת 35 מ לכל מין חרוזים, 35 מ לכל מין עבור גרעינים של 200 מ לכל מין שמן.
7. בנפט מקבילי snRNA-רצף: פלטפורמת מסחר26
- לבצע במקביל בנפט snRNA-רצף באמצעות פלטפורמת מסחר (למשל, פתרון ביטוי של גנים תא של כרום יחידה) מוצרים על פי הוראות היצרן26 עם השינוי הבא:
- בעקבות הפוכה-שעתוק, להוסיף מחזור נוסף של ה-PCR מספר מחזורי עבור הגברה cDNA בהתבסס על התאוששות תא יישוב כדי לפצות על cDNA ירד מן הגרעינים לעומת תאים מחושבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, נוכל לבצע בידוד של גרעינים חוט השדרה המותני מבוגר העכבר עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. הפרוטוקול מעורבים שלושה מרכיבים מרכזיים: רקמת הפרעה וסלולר פירוק המגון, סוכרוז צפיפות צנטריפוגה (איור 1). תוך שניות, הניב פירוק מכני דטרגנט הכנה גרעינים גולמי עם מספר גדול של גרעינים, כמו גם פסולת הסלולר ואת הרקמה (איור 2 אטבלה 2). לאחר כרבע שעה, פירוק מכני היפוטוניק הניבו הכנה גרעינים גס שהיה פחות פסולת, אבל גם פחות גרעינים (2B איורטבלה 2). שני תכשירים עברה המגון (איור 2C ו- D), סוכרוז צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות לפני resuspension ב- PBS עם 0.04% BSA (2E דמות ו- F). באופן ממוצע, חוט השדרה המותני העכבר (מ"ג 325.5 ± 63.9 mg שגיאת התקן של הממוצע, SEM, N = 4) הניב 5.1 x 105 גרעינים (± 6.3 x 104 SEM, N = 3) בעקבות פירוק מכני דטרגנט ו- 2.0 x5 10 גרעינים (± 5.9 x 104 SEM, N = 3) בעקבות את פירוק היפוטוניק-מכניים. המספר של גרעין ב חוט השדרה המותני הוערך משלב הכנת גולמי הראשונית לאחר דאונס המגון בפרוטוקול פירוק מכני דטרגנט (2.6 x 106 גרעינים ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, טבלה 2). הדוגמה האחרונה פרוטוקול פירוק מכני דטרגנט מכילה 20% של גרעינים הראשונית (± 2% SEM, N = 3, טבלה 2). הכנת גרעינים גולמי מן פירוק מכני היפוטוניק בעקבות trituration מכיל 62% של גרעינים הראשונית (± 2% SEM, N = 3, טבלה 2). המדגם פירוק מכני היפוטוניק הסופית מכילה רק 8% של גרעינים הראשונית (± 1% SEM, N = 3, טבלה 2). אנחנו לא זיהה כל הבדל את התשואה הכוללת של RNA או את התשואה cDNA של משק בית גן (Gapdh) בין שיטות הכנה שני. שימוש qPCR, שיטת דטרגנט הניב 463.7 ng (± 98.9 SEM, N = 6) של RNA הכולל ומחזור של זיהוי הממוצע הסף של 25.2 (± 1.3 SEM) עבור Gapdh cDNA מאת qPCR, שיטת היפוטוניק הניב 419.2 ng (± 85.3 SEM, N = 6) של RNA הכולל, על סף גילוי ממוצע מעגל 26.1 עבור Gapdh cDNA (± 0.8 SEM). שתי האפשרויות פירוק גם לבודד את הגרעינים של רקמות קשות מביצועם וגם לספק את החומר באיכות גבוהה עבור רצף RNA חד-גרעין במורד הזרם.
בהתחשב בגודל של ערוצי microfluidic לפלטפורמות רצף מקביל בנפט גרעין אחד במורד הזרם, חיוני קלט השעיה גרעינים חינם של חלקיקים גדולים או פסולת הסלולר כדי למנוע סתימת. בעקבות פרוטוקול המובאת כאן, היו מופעים של סתימת על פלטפורמת מ. Macosko et al. 2015 (N = 17), אחת חלקי להדביק על פלטפורמת מסחר (N = 16).
ההליכים דטרגנט-מכניים, היפוטוניק-מכניים שימשו כדי לבודד את הגרעינים בהצלחה עבור שתי פלטפורמות כימוס droplet בנפט מקבילים, נציג התוצאות מוצגות באיור3. שתי גישות אלה אפשרה פרופיל תעתיק של אלפי גרעינים, סיווג של סוגי תאים בתוך העכבר למבוגרים חוט השדרה המותני (איור 3). 4 גישות אלה גרמו גנים דומים לכל גרעין לכל סוג התא (איור 3C ו- D). המחירים של התאוששות של גרעינים קלט בין פלטפורמת שונים. פלטפורמת מקורי Macosko et al. . 2015 עם שינויים מ. Sathyamurthy et al. 2018 התאושש של % 0.59 המשוערת של גרעינים (± 0.05% SEM, N = 17), בזמן פלטפורמת מסחר התאושש של גרעינים 53.7% משוער (N = 2).
פרוטוקול זה מעשיר מעט עבור גרעינים עצביים בהכנת הסופי. בסעיפים רקמות חוט השדרה המותני, מצאנו כי 27% של גרעינים היו חיוביים עבור דה מרקר עצביים NeuN (N = גרעינים 7,368 מחיות 2), בזמן הכנת גרעינים דטרגנט-מכניות של עמוד השדרה המותני, גרמו 31.9% של גרעינים הכולל הבעת NeuN, כפי שנקבע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS, SEM 2.0% ±, N = 13 ההכנות גרעינים עצמאית באמצעות במאגר דגימות מבעלי חיים מרובים כל הכנה, איור 4). זה דומה מה נצפתה בעבר על האחוזים של גרעינים NeuN-חיוביות בחוט השדרה כולו (20-24% בהתאם לגיל),27 כולל את צוואר הרחם החזי ואזורים שיש יותר חומר לבן ו אוליגודנדרוציטים. ראוי לציין, NeuN/Rbfox3 אינו מתבטא בנוירונים כל בנוסף, בהתאם, המספרים האלה הם מעריך צנוע סביר. זה אפשרי כי תאים שאינם עצבית קטן מעט התרוקנו במהלך הטיהור הדרגתיות סוכרוז. בנוסף, במורד הזרם סינון וניתוח פרמטרים בעקבות רצף עשוי לשנות את התפלגות סוג התא האחרון כי נוירונים יש יותר גנים לכל גרעין (איור 3C ו- D), לכן, הן הסבירות יוסרו במהלך תהליך הסינון.
ישנן מספר פעולות המפתח של פרוטוקול זה הדורשים טיפול. Douncing הראשון, מוגזם או trituration (בשלבים 3 או 4, בהתאמה) יכול להוביל לעלייה פסולת הסלולר היווצרות חלקיקים. למרות סוכרוז צפיפות צנטריפוגה וסינון יכול להפריד חלקיקים גדולים, ברגע חלקיקים קטנים נוצרות במהלך פירוק התאית, הם קשה להסיר. שנית, במהלך המגון, אל תמקם את מהמגן ישירות על גבי התחתון של הצינור אוק רידג. במקום זאת, להטביע בסוף מהמגן בתוך תמיסת סוכרוז נמוך המכיל גרעינים resuspended, מבלי לגעת התחתון של הצינור. המגון משפר בידוד גרעיני על-ידי הסרת פסולת הסלולר והפחתת גושים ו- multiplets (איור 5). בעקבות סוכרוז צפיפות צנטריפוגה, חיוני כדי להסיר לאלתר את הצינור אוק רידג מ לצנטריפוגה ולאחר במהירות decant את תגובת שיקוע בתנועה מהירה 'יתנגש'. כאשר resuspending הגרעינים מן הקיר של הצינור רכס אוק, resuspend בגדר "מלוחים" מ באמצע הדרך בין הלהקה המיאלין והחלק התחתון של הצינור. שימו לב כי בגדר עשוי לא להיות גלוי. Resuspending גרעינים גבוהה יותר לאורך הצינור עלולה לגרום לזיהום המיאלין בהכנת גרעין האטום. פירוק התאית והשלבים צנטריפוגה סוכרוז צפיפות הם הקריטיים ביותר להפחתת חלקיקים כי ייתכן לסתום microfluidic ערוצים עבור יישום במורד הזרם.
| שם של חומר / ציוד | ריכוז מניות | ריכוז סופי | נפח / כמות |
| מאגר פירוק דטרגנט | |||
| מאגר סוכרוז נמוך | - | - | 600 ΜL |
| טריטון-X | 20% | 0.10% | 3 ΜL |
| מאגר פירוק היפוטוניק | |||
| טריס-HCl (ה-pH = 7.4) | 1 מ' | 10 מ מ | 100 ΜL |
| NaCl | 5 מ' | 10 מ מ | 20 ΜL |
| MgCl2 | 1 מ' | 3 מ מ | 30 ΜL |
| Nonidet P40 | - | 0.01% | 1 ΜL |
| נוקלאז ללא מים | עד 10 מ ל | ||
| מצגת בינוני | |||
| שינה-A | - | - | 10 מ |
| Glutamax | - | - | 100 ΜL |
| B27 | - | - | 200 ΜL |
| מאגר סוכרוז נמוך | |||
| סוכרוז | - | ז 0.32 | 2.75 g |
| HEPES (ה-pH = 8.0) | 1 מ' | 10 מ מ | 250 ΜL |
| CaCl2 | 1 מ' | 5 מ מ | 125 ΜL |
| MgAc | 1 מ' | 3 מ מ | 75 ΜL |
| EDTA | 0.5 מ' | 0.1 מ מ | 5 ΜL |
| DTT | 1 מ' | 1 מ מ | 25 ΜL |
| נוקלאז ללא מים | עד 25 מ ל | ||
| מאגר צפיפות סוכרוז | |||
| סוכרוז | - | 1 מ' | 8.6 גר' |
| HEPES (ה-pH = 8.0) | 1 מ' | 10 מ מ | 250 ΜL |
| MgAc | 1 מ' | 3 מ מ | 75 ΜL |
| DTT | 1 מ' | 1 מ מ | 25 ΜL |
| נוקלאז ללא מים | עד 25 מ ל | ||
| פתרון Resuspension | |||
| 1 X PBS | - | - | 1 מ"ל |
| BSA | 20 מ"ג/מ"ל | 0.4 מ"ג/מ"ל | 20 ΜL |
| RNAse מעכב | U 40/ΜL | 0.2 U/ΜL | 5 ΜL |
טבלה 1: טבלה של פתרונות.
| גולמי | הומוגני | סופי | |
| חומרי ניקוי-מכניים | 100 ± 15% | 87 ± 9% | 20 ± 2% |
| היפוטוניק-מכניים | 62 ± 12% | 35 ± 4% | 8 ± 1% |
בטבלה 2: תשואה של גרעינים בכל שלב בפרוטוקול. מספר גרעינים בהכנת גולמי הראשונית לאחר דאונס המגון בפרוטוקול פירוק מכני דטרגנט שימש כדי להעריך את מספר גרעינים בחוט השדרה המותני. גרעינים הראשונית תשואה (2.6 x 106 גרעינים ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) שימש לחישוב הגרעינים תשואה בכל צעד במורד הזרם עבור פרוטוקולים פירוק חומרי ניקוי - ו היפוטוניק-מכניים. מספר גרעינים מבודדים על ידי הכנה היפוטוניק-מכניים היה מנורמל ל האטומים מוערך הראשונית. ערכים בטבלה הם זאת אומרת ± SEM, N = 3.
איור 1: סכימטי של בידוד גרעינית. גרעינים של חוט השדרה למבוגרים ניתן לבודד באמצעות פירוק תאים דטרגנט-מכניים או היפוטוניק-מכניים, ואחריו המגון ולאחר סוכרוז צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג brightfield, גרעינים שהוכתמו דאפי-מפתח צעדים בפרוטוקול. גרעינים גולמי (A, B) בעקבות פירוק חומרי ניקוי מכני או היפוטוניק-מכניים. (C, D) הגרעינים בעקבות המגון. (E, F) הגרעינים resuspended ב- PBS עם BSA 0.04% בעקבות סוכרוז צפיפות צנטריפוגה. הגרעינים התיישרו עם 2% paraformaldehyde, לאחר מכן צבעונית באמצעות Trypan Blue או דאפי. התמונות צולמו ב-10 X (סולם בר = 100 מיקרומטר) באמצעות brightfield ואפינפרין-זריחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג tSNE עלילה של גרעינים ברצף: באמצעות פירוק חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכני- (א) תוצאות המתקבל רצף מעל 17,000 גרעינים של העכבר למבוגרים ביתור המותני חוט השדרה בעקבות פירוק מכני דטרגנט, ולפי Macosko. ואח 2015 עם שינויים מ. Sathyamurthy et al. 2018. איור זה שונתה באישור Sathyamurthy. et al. 2018.4 (B) התוצאות המתקבל רצף גרעינים 5,000 מ בשניה למבוגרים המותני חוט השדרה בעקבות פירוק מכני היפוטוניק, פלטפורמה כימוס של תא בודד microfluidic מסחרי. 26 (C, D) גנים הממוצע לכל גרעין תוצאות בעקבות קיבוץ באשכולות של סוגי תאים עיקריים ב ± חוט השדרה העכבר למבוגרים ב- SEM. ראוי לציין, הליך פירוק חומרי ניקוי מכני ואחריו Macosko ואח. 2015 פלטפורמה התבצע בעזרת ביתור עמוד השדרה המותני, ואילו פירוק היפוטוניק-מכני ואחריו פלטפורמת מסחר בוצעה באמצעות הוצאת חוט השדרה המותני (כפי שמתואר פרוטוקול זה). בהתחשב בעובדה. פולטת את החוט מסיר את דורה ואת הגרעינים העזוב שורש, האשכול תא של קרום המוח/שוואן נעדר מן דמות 3B ו- D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: FACS מגרש של גרעינים NeuN+ בעקבות פירוק מכני דטרגנט. מגרש FACS מציג גרעין קבוע מוכתם NeuN (ממוצע 31.9% של גרעינים הכולל ± 2.0% SEM, N = 13), מבודדים באמצעות פרוטוקול פירוק מכני דטרגנט. עבור הקיבעון מיידית, גרעינים עבור אימות FACS, הכנה גרעינים גולמי היה מתקבל על ידי המגון דאונס שידרה באמצעות הכנת סבון-מכניים, ואחריו קיבוע מיידית עם 1% מחברים עם תקופת דגירה 5 דקות. קיבוע היה מתרצה עם 250 מ מ גליצין, גרעינים שנאספו. צביעת עם נוגדן anti-NeuN בוצע בתמיסה. FACS בוצעה על קבוע, גרעינים NeuN צבעונית באמצעות סדרן של התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: גרעינים הכנה ללא המגון. הגרעינים היו resuspended לפני סוכרוז צפיפות צנטריפוגה בעקבות A דטרגנט-מכניים או פירוק מכני היפוטוניק B , בלי המגון. * מציין פסולת הסלולר קשורה גרעינים (א) ו- multiplet של הגרעינים המצורפת על ידי פסולת הסלולר (B). הגרעינים resuspended ב- PBS עם BSA 0.04% בעקבות סוכרוז צפיפות צנטריפוגה. הגרעינים התיישרו עם 2% paraformaldehyde, לאחר מכן צבעונית באמצעות Trypan Blue או דאפי. התמונות צולמו ב 10 X (סולם בר 100 מיקרומטר) באמצעות brightfield ואפינפרין-זריחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה הסופית של פרוטוקול זה נועד לבודד גרעין המכיל באיכות גבוהה RNA לניתוח תעתיק במורד הזרם. התאמנו snRNA-Seq שיטות על מנת פרופיל כל סוגי תאים בחוט השדרה. בתחילה, מצאנו כי תא אופייני דיסוציאציה שיטות היו יעילים עבור תא בודד RNA רצף, כמו חוט השדרה נוירונים פגיעים במיוחד מוות של תאים. יתר על כן, תא דיסוציאציה שיטות לגרום ביטוי של גנים שונים פעילות, מתח-תגובה מאת עד כמה hundred-fold. 3 , 4 , 16 לאור החסרונות הקשורים עם ההכנות תא בודד, אנחנו ואחרים השתמשו גרעינים כחלופה. 16 , 17 , 18 , 24 שיטה זו יכולה לשמש גם על רקמה אנושית, כולל רקמות חוט השדרה קפוא. 4 , 19 , 24 . כאן, נתאר את נקודות החוזק ואת המגבלות של גישה זו.
היתרונות של שיטה זו כוללים ההתרחקות המושרה בניסוי הרגליים וכן את היכולת להשתמש רקמות טריים וקפואים. 4 כך, גישה זו יכולה להיות שימושית עבור בודק את הרגליים אנדוגני בעקבות התנהגות או גירוי. 1 , 3 , 4 אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה אינה דורשת התקנים מיוחדים עבור ניצול של גרעינים על רצף גרעין אחד מקביל בנפט, אבל ניתן להשתמש הפלטפורמה שפיתחה Macosko. ואח 2015, עם התאמות קלות של מאגר פירוק וקצב הזרימה, או שימוש מערכות זמינים מסחרית. יתר על כן, רצף גרעין אחד הוכח להיות שיטה דומה לזו של תא בודד רצף לצורך זיהוי סוגי תאים, ההלוואות לחוזק של גישה זו. 28 , 29 . אולם, יש מספר מגבלות חשובות של גישה זו. גרעין מכיל כ- 20-50% של mRNA הסלולר,29 ו זה משתקפת מספר נמוך יותר של הפרוטוקולים לכל גרעין בהשוואה רצף תא בודד. 18 , 29 כולל קריאות intronic מ- snRNA-Seq היא גישה אחת כדי להגדיל את מספר גנים שזוהו.
ישנם מספר פרוטוקולים זמין המאפשרים בידוד של גרעינים מרקמות. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 לעומת רוב שיטות אחרות, הפרוטוקולים המובאים כאן אינם מחייבים הסרת המיאלין, ultracentrifugation, רבים צנטריפוגה או שוטף יכול להוביל להורדת המספרים הסופיים של גרעין האטום. יתר על כן, פרוטוקול זה לוקח 45 דקות (דטרגנט-מכני) או שעה (היפוטוניק-מכניים) כדי להשלים. פרוטוקולים מסחרי נתמך בפלטפורמות microfluidic הם יותר מכפול הזמן והן דורשות יותר צנטריפוגה שלבים רבים, המגבירות את הסיכון לאבד את הגרעינים. לעומת פרוטוקולים בידוד גרעינים המערבות רק פירוק וסינון, השיטות המובאות כאן כוללים הדרגתי סוכרוז להגדיל את הטוהר של גרעינים הסופי. צעד זה נדרש עבור חוט השדרה למבוגרים רקמות בשל האחוז גדול של חומר לבן ופסולת וכתוצאה מכך את המיאלין.
פרוטוקול פירוק חומרי ניקוי מכני יכול לשמש כדי להפוך את רקמות מלאה דיסוציאציה פירוק, פרוטוקול היפוטוניק-מכניים פירוק יכול לשמש כדי לשלוט בכמות רקמת דיסוציאציה וסלולר פסולת מורשה ביישום במורד הזרם. פרוטוקולים אלה יכול לשמש חומר ביו-bank, קשה לנתק את הרקמות ועל החקירה של שינויים תלויי-פעילות גנים ברמת השעתוק דרך בידודו של גרעינים במורד הזרם בנפט מקבילים snRNA-תת סעיף. בנוסף רצף מקביל בנפט יחיד הגרעין RNA, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי לבודד את הגרעינים ליישומים חלופיים, כולל immunofluorescence, FACS וניתוח epigenetic מחקרים מתילציה DNA ו שבב-Seq (איור 4 ). 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. יש לנו שאין ניגודי אינטרסים לחשוף...
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מגזר של NINDS (1 זיא NS003153 02), NIDCD (1 זיא DC000059 18). אנו מודים ל' Li Dobrott מודיע על תמיכתם הטכניים דיונים מועילים ו ס Kathe לסקירה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
Tags
מדעי המוח בעיה 140 גרעינים RNA רצף snRNA-Seq במקביל בנפט חוט השדרה סוכרוז הדרגתיErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
