Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.
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Artigo de método
Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo
Neste artigo
Aviso de errata
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Resumo
Resumo
Sondando a expressão de gene de uma célula individual permite que a identificação do tipo de célula e estado da célula. A sequenciação do ARN monocelulares tem emergido como uma poderosa ferramenta para estudar perfis transcriptional de células, particularmente nos tecidos heterogêneos, tais como o sistema nervoso central. No entanto, métodos de dissociação necessários para sequenciamento única célula podem levar a mudanças experimentais na morte gene expressão e celular. Além disso, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, limitando assim os estudos sobre arquivamento e material de bio-banco. Sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma alternativa atraente para estudos transcricionais, dado que com precisão identifica os tipos de células, permite o estudo de tecido que é difícil dissociar, ou congelados e reduz induzida por dissociação transcrição. Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para isolamento rápido de núcleos para jusante snRNA-Seq Esse método permite o isolamento dos núcleos de amostras frescas ou congeladas da medula espinhal e pode ser combinado com duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota.
Introdução
O sistema nervoso é composto por grupos heterogêneos de células que exibem uma disposição diversa de propriedades morfológicas, bioquímicas e eletrofisiológicas. Enquanto o sequenciamento de RNA em massa tem sido útil para determinar todo o tecido alterações na expressão do gene em condições diferentes, isso impede a detecção de alterações transcricionais no nível de célula única. Avanços recentes na célula única análise transcricional permitiram a classificação de células heterogêneas em grupos funcionais com base em seu repertório molecular e ainda podem ser aproveitados para detectar conjuntos de neurônios que tinham sido recentemente ativos. 1
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Protocolo
Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com um protocolo aprovado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso cuidado do Animal e Comitê de uso. Balanceamento de amostras de masculinos e femininos, ratos do selvagem-tipo da ICR/CD-1, entre 8 e 12 semanas velho, foram usados para todos os experimentos. Os ratos devem ser tratados em conformidade com as orientações institucionais Cuidado Animal e Comitê de uso locais.
1. preparação de materiais e Buffers
- Preparar todos os buffers no dia do uso e pre-chill no gelo (ver tabela 1).
- Se utilizar detergente-mecânica Lise, prepare o deter....
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Resultados
Aqui, realizamos o isolamento dos núcleos da medula espinhal lombar rato adulto para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. O protocolo envolveu três componentes principais: tecido celular e ruptura da lise, homogeneização e sacarose densidade centrifugação (Figura 1). Em poucos segundos, a lise de detergente-mecânica rendeu uma preparação de núcleos bruto com um grande número de núcleos, bem como os restos celulares e tecido (
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Discussão
O objetivo final do presente protocolo é isolar núcleos contendo RNA de alta qualidade para análise transcricional a jusante. Adaptamos snRNA-Seq métodos para o perfil de todos os tipos de células na medula espinhal. Inicialmente, achamos que métodos de dissociação típica célula eram ineficazes para sequenciamento do RNA de única célula, como os neurônios da medula espinhal são particularmente vulneráveis à morte celular. Além disso, métodos de dissociação celular induzem a expressão de vários genes de atividade - e -res.......
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Divulgações
Temos sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo programa intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li e C.I. Dobrott pelo apoio técnico e discussões úteis e C. Kathe para revisar o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sacarose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8,0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0,5 M EDTA (pH = 8,0) | Corning | MT-46034CI | |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Adicione TDT antes de usar |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Água livre de nuclease | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7,4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/ μ L Inibidor de RNAse | Lucigen | 30281-1 | |
| Tubo de Centrífuga Oak Ridge | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Pipetas de Pasteur de Vidro Borosilicato-Plugado Descartável de Algodão | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Garrafa de Tecido de Vidro (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Pilão de vidro de grande folga | Kimble | 885301-0002 | |
| Pilão de vidro pequeno para folga | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogeneizador | IKA | 3737001 | |
| Ferramenta de dispersão (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Mancha Azul de Tripano (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μ Filtro de célula m | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Tubos cônicos | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Rotor de ângulo fixo | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Pipetas Esterológicas: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocitômetro | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| Solução de Descontaminação RNase RNaseZap Tubo de | Falcon Invitrogen | AM9780 | |
| com Tampa de Filtro de Células (35 μ m) | Classificador | de | |
| Beckman Coulter | B25982 | ||
| Chromium i7, 96 rxns | 10X Genômica | 120262 | |
| Célula Única de Cromo 3' Kit de Biblioteca e Gel Bead v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Placa de Cultura de Tecidos Genomics | ||
| (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
Referências
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
