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Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.
Abstract
Sondando a expressão de gene de uma célula individual permite que a identificação do tipo de célula e estado da célula. A sequenciação do ARN monocelulares tem emergido como uma poderosa ferramenta para estudar perfis transcriptional de células, particularmente nos tecidos heterogêneos, tais como o sistema nervoso central. No entanto, métodos de dissociação necessários para sequenciamento única célula podem levar a mudanças experimentais na morte gene expressão e celular. Além disso, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, limitando assim os estudos sobre arquivamento e material de bio-banco. Sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma alternativa atraente para estudos transcricionais, dado que com precisão identifica os tipos de células, permite o estudo de tecido que é difícil dissociar, ou congelados e reduz induzida por dissociação transcrição. Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para isolamento rápido de núcleos para jusante snRNA-Seq Esse método permite o isolamento dos núcleos de amostras frescas ou congeladas da medula espinhal e pode ser combinado com duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota.
Introduction
O sistema nervoso é composto por grupos heterogêneos de células que exibem uma disposição diversa de propriedades morfológicas, bioquímicas e eletrofisiológicas. Enquanto o sequenciamento de RNA em massa tem sido útil para determinar todo o tecido alterações na expressão do gene em condições diferentes, isso impede a detecção de alterações transcricionais no nível de célula única. Avanços recentes na célula única análise transcricional permitiram a classificação de células heterogêneas em grupos funcionais com base em seu repertório molecular e ainda podem ser aproveitados para detectar conjuntos de neurônios que tinham sido recentemente ativos. 1 , 2 , 3 , 4 nos últimos dez anos, o desenvolvimento de uma única célula RNA sequenciamento (scRNA-Seq) permitiu o estudo da expressão do gene em células individuais, proporcionando uma visão sobre a diversidade do tipo de célula. 5
O surgimento das abordagens escaláveis como maciçamente paralelo scRNA-Seq, forneceu plataformas para tecidos heterogêneos de sequência, incluindo muitas regiões do sistema nervoso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 entretanto, métodos de dissociação única célula podem originar a morte celular, bem como alterações experimentais na expressão gênica. 16 trabalho recente adaptou-se métodos de sequenciamento única célula para permitir a preservação dos perfis transcriptional endógenas. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estratégias têm sido particularmente adequadas para a detecção imediata expressão de gene (IEG) inicial após estímulo sensorial ou comportamento. 3 , 4 no futuro, esta estratégia poderia também ser usada para estudar as mudanças dinâmicas nos tecidos nos Estados de doença ou na resposta ao estresse. Esses métodos, sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma abordagem promissora que não envolve a dissociação de células indutoras de stress e pode ser usada na difícil dissociar o tecido (por exemplo, a medula espinhal), bem como congelados tecido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de métodos de isolamento de núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq normalmente utiliza celular e ruptura rápida de tecido Lise sob condições de frio, centrifugação e separação dos núcleos de restos celulares. 4 núcleos podem ser isolados para o sequenciamento de próxima geração a jusante em múltiplas plataformas de encapsulamento de gotículas microfluidic. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite um instantâneo da atividade transcricional de milhares de células em um momento no tempo.
Existem várias estratégias para liberação de núcleos de células antes de isolamento e sequenciamento, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Aqui, descrevemos e comparar dois protocolos para permitir o isolamento dos núcleos da medula espinhal adulto para a jusante maciçamente paralelo snRNA-Seq: lise detergente-mecânica e lise hipotónica-mecânica. Lise de detergente-mecânica fornece tecido completo rompimento e um maior rendimento final de núcleos. Mecânica-lise hipotónica inclui um grau controlável de ruptura do tecido, proporcionando uma oportunidade para a seleção de um equilíbrio entre a quantidade e a pureza do rendimento final nuclear. Estas abordagens fornecem rendimento comparável do RNA, detectado um número de genes por núcleo e o tipo de célula de criação de perfil e também podem ser usados com sucesso para snRNA-Seq
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Protocol
Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com um protocolo aprovado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso cuidado do Animal e Comitê de uso. Balanceamento de amostras de masculinos e femininos, ratos do selvagem-tipo da ICR/CD-1, entre 8 e 12 semanas velho, foram usados para todos os experimentos. Os ratos devem ser tratados em conformidade com as orientações institucionais Cuidado Animal e Comitê de uso locais.
1. preparação de materiais e Buffers
- Preparar todos os buffers no dia do uso e pre-chill no gelo (ver tabela 1).
- Se utilizar detergente-mecânica Lise, prepare o detergente do lysis (> 500 μL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 6 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).
- Se usando lise hipotónica-mecânico, preparar o tampão de Lise hipotónica (> 5 mL por amostra), médio HEB (> 5 mL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 3 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).
- Adicione 25 μL de ditiotreitol (DTT) para 25 mL de tampão de baixa sacarose e outra 25 μL de TDT para 25 mL de buffer de gradiente de densidade de sacarose, pouco antes de iniciar o protocolo.
- Cubra a superfície dissecação com folha de alumínio para minimizar a contaminação da amostra com fibras de papel toalha ou protetores de banco, que podem obstruir canais microfluídicos usados para capturar o único núcleos.
- Pulverizador ferramentas de dissecção e espaço de bancada com uma solução de descontaminação de RNase. Além disso, pulverize o interior do tubo homogenizador de homogenizacao (se estiver usando o lysis da pilha de detergente-mecânica) e tubo de Oak Ridge com uma solução de descontaminação de RNase. Enxague com água ultrapura, RNase-livre o tubo homogenizacao e Oak Ridge.
- Pre-relaxa todos os tubos de coleta (50ml cónico, Oak Ridge) e tubos de homogeneizador homogenizacao no gelo.
- Fogo polir uma série de pipetas Pasteur (se estiver usando o lysis da pilha hipotônica-mecânico).
2. preparação da medula espinhal
- Se usar tecido fresco, eutanásia o mouse por inalação de CO2 . Após eutanásia, pulverize o casaco do mouse com etanol a 70% para minimizar a contaminação de cabelo na amostra.
- Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica afiada, RNase-livre. Em seguida, levantando suavemente o abdominal da pele com pinças e fazer uma incisão ao longo do comprimento do corpo para expor os órgãos internos.
- Acabo com o mouse, puxando os órgãos internos da cavidade de corpo usando fórceps. Não utilize toalhas de papel para limpar a área ou para retirar os órgãos como isto pode introduzir contaminantes. Usando a tesoura, corte a coluna vertebral, entre as vértebras da coluna vertebral L2 e L3.
Nota: Com a prática, esta etapa pode ser alcançada em menos de 30 segundos.- Para ejetar a medula espinhal, cabe uma seringa de 3 mL contendo PBS gelado com uma agulha de ¼ de polegada de 25 G. Coloca a ponta da agulha no final sacral da coluna vertebral. Use dois dedos de beliscar as vértebras para criar um selo apertado em torno da ponta da agulha e pressione o êmbolo para ejetar a medula espinhal rostralmente. Lugar da medula espinhal em uma placa de Petri com PBS gelado.
- Neste momento, congelar o tecido e armazenar a-80 ° C ou usá-lo imediatamente para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).
- Se usar tecido congelado, manter o tecido em gelo seco, prosseguir para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).
3. lise celular detergente-mecânica
- Coloque a medula espinhal lombar em um homogeneizador homogenizacao pre-refrigerado e adicione 500 mL previamente refrigeradas lise detergente.
Nota: Uma rato da medula espinhal lombar é 325,5 mg mg 63,9 ± erro-padrão da média (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso. - Homogenizacao com 5 golpes de pilão um (pilão 'solto'), então a 5-10 golpes de pilão B (pilão 'apertado'). Evitar levantar o homogenizador fora a solução de Lise entre traços e evitar a introdução de bolhas.
- Coloque um filtro de 40mm sobre um tubo cónico de 50ml pre-refrigerados e prewet com 1 mL de tampão de baixa sacarose.
- Adicionar 1 mL de tampão de baixa sacarose para o homogeneizador homogenizacao contendo os núcleos brutos na Lise e misture suavemente pipetando 2 – 3 vezes.
- Passe a preparação de núcleos bruto o filtro de 40mm no tubo cónico de 50ml previamente refrigerados.
- Passe um adicional 1 mL de tampão de baixa sacarose sobre o filtro de 40mm, trazendo o volume final de 3 mL do buffer baixa sacarose e 500 mL de tampão de Lise.
- Repita as etapas 3.1 – 3.6 se combinando vários cabos, reunindo no mesmo tubo cónico.
- Centrifugar a amostra a 3.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decante o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.
4. lysis da pilha hipotônica-mecânica
- Lugar da medula espinhal lombar em 5 mL de tampão de Lise hipotónica em um prato de cultura de tecidos. Use o fim brusco da tesoura de mola para dividem a medula espinhal e, em seguida, use tesoura de mola para cortar o cordão em pedaços de 3 – 4 mm, mas não picar.
Nota: 50mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso. - Incube no gelo por 15 min, agitando 2 – 3 vezes.
- Adicione 5 mL de meio HEB para diluir a Lise hipotónica.
- Triture o tecido 10 vezes com pipeta sorológica 5ml, ou até que todas as peças do tecido mover suavemente através da abertura da pipeta.
- Triture com uma série de três pipetas Pasteur fogo-lustrado com diâmetros progressivamente mais estreitos (~ 900 – 600 mm).
- Para cada pipeta, Triture 5 - 15 vezes, permitir que o tecido resolver, retire 1 a 2 mL do sobrenadante contendo núcleos dissociados e passar por um filtro de 40mm em um tubo cônico de 50ml previamente refrigerados.
- Após a trituração com pipeta Pasteur de menor porte, certifique-se de que o homogenate flui suavemente a ponta da pipeta. Passe o restante da solução sobre o filtro de 40mm no tubo cónico de 50 mL.
Nota: O número total de triturations pode ser ajustado como desejado. As meninges da medula espinhal do mouse permanecerá, mas é importante triture qualquer pedaços visíveis da medula espinhal. Passe o restante homogenate a peneira de 40 m. Evite a introdução de bolhas durante a trituração.
- Centrifugar a amostra filtrada a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decantar e descartar o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.
5. homogeneização e gradiente de densidade de sacarose
- Após a etapa 3 ou 4, resuspenda o pellet usando 3 mL de tampão de baixa sacarose. Agite suavemente para remover o sedimento da parede para facilitar a ressuspensão. Deixe a amostra sentar no gelo por 2 min e transferir a suspensão para um tubo de Oak Ridge.
- Usando o homogenizador na configuração 1, homogeneizar os núcleos no buffer de sacarose baixa para 15 a 30 s, mantendo a amostra em gelo.
Nota: Use 15 s se usando uma lombar da medula espinhal ou 30 s se usando em pool de amostras ou um inteiro da medula espinhal. - Usando uma pipeta sorológica, camada 12,5 mL de tampão de sacarose densidade sob a baixa sacarose homogenate de tampão, tomando cuidado para não criar uma bolha que interrompe as camadas de densidade.
- Centrifugar os tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.
- Uma vez concluída a centrifugação, imediatamente decante o sobrenadante em um movimento flicking.
Nota: Um volume residual (inferior a 400 mL) de tampão de sacarose pode ser Descartado se desejado para produzir um volume menor e limpador amostra final, mas este volume residual contém núcleos e pode ser preservado para maximizar o rendimento de núcleos. - Usando 100 mL - 1 mL de solução de ressuspensão, resuspenda os núcleos restantes na parede. Evite a mielina 'cara feia' que permanece com a preparação do detergente baseada.
- Os núcleos do filtro através de um filtro de tamanho de poro de 30 – 35 mm e recolher em um tubo previamente refrigerado.
- Determine os núcleos rendem usando um hemocytometer a contagem de núcleos sob um objetivo X 10.
Nota: Trypan azul pode ser adicionado para visualizar núcleos que devem aparecer azuis. Observe a quantidade de restos celulares. - Prossiga para o passo 6 ou 7.
6. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma académica7
- Realizar o sequenciamento de snRNA maciçamente paralelo (por exemplo, Drop-Seq) método conforme descrito anteriormente7 com as seguintes modificações:4
- Ajuste os núcleos para uma concentração final de 225 núcleos por mL.
- Prepare-se grânulos de código de barras em uma concentração de 250 contas por mL.
- Prepare a Lise com sarkosyl de 0,7%.
- Ajuste as taxas de fluxo a 35 mL / min para grânulos, 35 mL / min para núcleos e 200 mL / min para o óleo.
7. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma comercial26
- Executar maciçamente paralelo snRNA-em sequência usando a plataforma comercial (por exemplo, cromo solução de expressão de Gene único de célula) produtos de acordo com instruções26 com a seguinte modificação as indicações do fabricante:
- Seguindo transcrição reversa, adicione um ciclo PCR adicional ao número calculado de ciclos de amplificação do cDNA baseada a recuperação da célula alvo para compensar a diminuição do cDNA de núcleos em comparação com as células.
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Representative Results
Aqui, realizamos o isolamento dos núcleos da medula espinhal lombar rato adulto para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. O protocolo envolveu três componentes principais: tecido celular e ruptura da lise, homogeneização e sacarose densidade centrifugação (Figura 1). Em poucos segundos, a lise de detergente-mecânica rendeu uma preparação de núcleos bruto com um grande número de núcleos, bem como os restos celulares e tecido (Figura 2Atabela 2). Depois de quinze minutos, a Lise hipotónica-mecânica rendeu uma preparação de núcleos bruto que tinha menos detritos, mas também menos núcleos (Figura 2Btabela 2). Ambas as preparações foram submetidos a homogeneização (Figura 2 e D) e sacarose centrifugação gradiente de densidade antes ressuspensão em PBS com 0,04% BSA (Figura 2E e F). Em média, uma rato da medula espinhal lombar (325,5 mg mg 63,9 ± erro-padrão da média, SEM, N = 4) rendeu 5,1 x 105 núcleos (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) seguindo a lise de detergente-mecânica e 2,0 x 105 núcleos (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) seguindo a Lise hipotónica-mecânica. O número de núcleos na medula espinhal lombar foi estimado a partir da preparação inicial bruta após homogeneização homogenizacao no protocolo lise detergente-mecânica (2,6 x 106 núcleos ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, tabela 2). A amostra final de protocolo de Lise detergente-mecânica consiste em 20% dos núcleos iniciais (SEM de ± 2%, N = 3, tabela 2). A preparação de núcleos bruto da lise hipotónica-mecânico após trituração contém 62% dos núcleos iniciais (SEM de ± 2%, N = 3, tabela 2). A amostra final hipotônica-mecânica lise contém apenas 8% dos núcleos iniciais (SEM de ± 1%, N = 3, tabela 2). Nós não detectou qualquer diferença no rendimento total do RNA ou o rendimento do cDNA de um gene de limpeza (Gapdh) entre os métodos de preparação de dois. Usando qPCR, o método detergente rendeu 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) de RNA total e um média limite ciclo de detecção de 25,2 (± 1.3 SEM) para Gapdh cDNA por qPCR e o método hipotônica rendeu 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) de RNA total e um limite de deteção de média ciclo de 26,1 para Gapdh cDNA (SEM ± 0,8). As duas opções de Lise tanto isolar núcleos de tecidos difícil-para-se dissociam e fornecem o material de alta qualidade para o sequenciamento de RNA único-núcleo a jusante.
Dado o tamanho dos canais microfluídicos para plataformas de sequenciamento de núcleo único maciçamente paralelo a jusante, é fundamental para uma suspensão de núcleos livre de partículas grandes ou restos celulares para evitar o entupimento de entrada. Seguindo o protocolo aqui apresentado, não houve nenhum casos de entupimento na plataforma adaptada de Macosko et al 2015 (N = 17) e uma obstrução parcial na plataforma comercial (N = 16).
Os procedimentos de detergente-mecânica e hipotônica-mecânico foram usados para isolar núcleos com êxito para duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota e resultados representativos são mostrados na Figura 3. Ambas estas abordagens habilitado perfil transcricional de milhares de núcleos e a classificação dos tipos de células na medula espinhal lombar rato adulto (Figura 3). 4 essas abordagens resultaram em genes comparáveis por núcleo para cada tipo de célula (Figura 3 e D). As taxas de recuperação dos núcleos de entrada entre as duas plataformas diferem. A plataforma adaptada de Macosko et al . 2015 com modificações de Bianca et al 2018 recuperou cerca de 0,59% dos núcleos (± 0.05% SEM, N = 17), enquanto a plataforma comercial recuperou um estimado núcleos de 53,7% (N = 2).
Este protocolo enriquece-se ligeiramente para núcleos neuronais na preparação final. Nas seções do tecido da medula espinhal lombar, achamos que 27% dos núcleos foram positivas para o marcador neuronal NeuN (N = 7.368 núcleos de 2 animais), enquanto preparação de núcleos de detergente-mecânica da medula espinhal lombar resultou em 31,9% do totais núcleos expressando NeuN, conforme determinado pela classificação de fluorescência-ativado da pilha (FACS, SEM de ± 2.0%, N = 13 preparações de núcleos independentes usando em pool de amostras de vários animais em cada preparação, Figura 4). Isso é semelhante ao que tem sido observado anteriormente para a porcentagem de núcleos NeuN-positivo na medula espinhal inteiro (20 a 24% dependendo da idade),27 , incluindo as regiões cervicais e torácicas que têm mais substância branca e oligodendrócitos. Digno de nota, NeuN/Rbfox3 não é expressa em todos os neurônios e, por conseguinte, esses números são provavelmente subestima modesta. É possível que células não-neuronais menores são ligeiramente empobrecidas durante a purificação de gradiente de sacarose. Além disso, parâmetros de filtragem e análise a jusante seguindo o sequenciamento podem alterar a distribuição do tipo de célula final porque neurônios têm mais genes por núcleo (Figura 3 e D) e, portanto, são menos propensos a ser removido durante o processo de filtragem.
Existem várias etapas-chave neste protocolo que necessitam de cuidados. Douncing primeiro, excessivo ou trituração (nas etapas 3 e 4, respectivamente) pode levar a um aumento na formação de restos e partículas celular. Apesar de filtração e centrifugação de densidade de sacarose podem separar partículas grandes, uma vez que pequenas partículas são geradas durante a lise celular, eles são difíceis de remover. Em segundo lugar, durante a homogeneização, não coloque o homogenizador diretamente na parte inferior do tubo de Oak Ridge. Em vez disso, o fim do homogenizador mergulhe a solução de sacarose baixo contendo núcleos ressuspensão, sem tocar no fundo do tubo. Homogeneização melhora o isolamento nuclear, remoção de restos celulares e reduzindo touceiras e multiplets (Figura 5). Após centrifugação de densidade de sacarose, é fundamental para imediatamente, retire o tubo de Oak Ridge do centrifugador e rapidamente decante o sobrenadante em um rápido movimento 'flicking'. Quando resuspending núcleos da parede do tubo de Oak Ridge, resuspenda o pellet 'salgado' a meio do caminho entre a faixa de mielina e o fundo do tubo. Observe que a pelota pode não ser visível. Resuspending núcleos mais elevados ao longo do tubo pode resultar em contaminação de mielina na preparação núcleos. A lise celular e etapas de centrifugação de densidade de sacarose são as mais críticas para a redução de partículas que podem entupir canais microfluídicos para aplicação a jusante.
| Nome do Material / equipamento | Concentração das ações | Concentração final | Volume / quantidade |
| Detergente do lysis | |||
| Tampão de baixa sacarose | - | - | 600 ΜL |
| Triton-X | 20% | 0,10% | 3 ΜL |
| Tampão de Lise hipotónica | |||
| Tris-HCl (pH = 7,4) | 1 M | 10 mM | 100 ΜL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 20 ΜL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 30 ΜL |
| Nonidet P40 | - | 0,01% | 1 ΜL |
| Água livre de nuclease | até 10 mL | ||
| HEB médio | |||
| Hibernate-A | - | - | 10 mL |
| Glutamax | - | - | 100 ΜL |
| B27 | - | - | 200 ΜL |
| Tampão de baixa sacarose | |||
| Sacarose | - | 0,32 M | 2,75 g |
| HEPES (pH = 8,0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| CaCl2 | 1 M | 5 mM | ΜL DE 125 |
| MgAc | 1 M | 3 mM | ΜL DE 75 |
| EDTA | 0,5 M | 0,1 mM | 5 ΜL |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Água livre de nuclease | até 25 mL | ||
| Buffer de densidade de sacarose | |||
| Sacarose | - | 1 M | 8,6 g |
| HEPES (pH = 8,0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| MgAc | 1 M | 3 mM | ΜL DE 75 |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Água livre de nuclease | até 25 mL | ||
| Solução Resuspension | |||
| 1X PBS | - | - | 1 mL |
| BSA | 20 mg/mL | 0,4 mg/mL | 20 ΜL |
| Inibidor de RNAse | 40 U/ΜL | 0.2 U/ΜL | 5 ΜL |
Tabela 1: Tabela de soluções.
| Bruto | Homogeneizado | Final | |
| Detergente-mecânica | 100 ± 15% | 87 ± 9% | 20 ± 2% |
| Hipotônica-mecânica | 62 ± 12% | 35 ± 4% | 8 ± 1% |
Tabela 2: rendimento de núcleos em cada passo no protocolo. O número de núcleos na preparação inicial bruto após homogeneização homogenizacao no protocolo lise detergente-mecânico foi usado para estimar o número de núcleos na medula espinhal lombar. Os núcleos iniciais de rendimento (2,6 x 106 núcleos ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) foi utilizado para calcular os núcleos de rendimento a cada passo a jusante para ambos os protocolos de lise de detergente e hipotônica-mecânica. O número de núcleos isolados pela preparação hipotônica-mecânico foi normalizado para os núcleos iniciais estimados. Os valores na tabela são média ± SEM, N = 3.
Figura 1: esquemático de isolamento nuclear. Núcleos da medula espinhal adulto podem ser isolados usando lysis da pilha de detergente-mecânico ou hipotônica-mecânico, seguido de homogeneização e centrifugação gradiente de sacarose densidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Brightfield representante e núcleos DAPI-manchado na chave passos no protocolo. (A, B) núcleos bruto após lise detergente-mecânico ou hipotônica-mecânico. (C, D) Após a homogeneização de núcleos. (E, F) Núcleos resuspended em PBS com 0,04% BSA após centrifugação de densidade de sacarose. Núcleos eram fixas com 2% paraformaldeído e posteriormente corados usando Trypan azul ou DAPI. Imagens foram tiradas em 10 X (barra de escala = 100 µm) usando brightfield e epi-fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: trama do representante tSNE dos núcleos sequenciados: usando detergente-mecânica e hipotônica-mecânica Lise. (A) resultados obtidos de sequenciamento de mais de 17.000 núcleos da dissecado rato adulto lombar da medula espinhal após lise detergente-mecânica e de acordo com Macosko et al 2015 com modificações de Bianca et al 2018. esta figura foi modificada com a permissão de Bianca et al 2018.4 (B) resultados obtidos de 5.000 núcleos de sequenciamento de ejetado adulto lombar medula espinhal após lise hipotónica-mecânica e uma plataforma de encapsulamento microfluidic comercial única célula. 26 (C, D) genes média por resultados núcleo na sequência de agrupamento de tipos de células principais na medula espinhal rato adulto ± SEM. Digno de nota, o procedimento de Lise detergente-mecânico seguido o Macosko et al. plataforma de 2015 foi realizada utilizando dissecada lombar da medula espinhal, enquanto que a Lise hipotónica-mecânico seguido pela plataforma comercial foi realizada usando ejetado lombar da medula espinhal (conforme descrito neste protocolo). Dado que ejetar o cabo remove a dura-máter e o gânglio da raiz dorsal, o cluster de célula de Schwann meníngea/está ausente da Figura 3B e D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: trama FACS de núcleos NeuN+ seguindo o detergente-mecânica Lise. Enredo de FACS mostrando núcleos fixos manchado por NeuN (média 31,9% do total de núcleos ± 2.0% SEM, N = 13), isolado usando o protocolo de Lise detergente-mecânica. Para a fixação imediata, núcleos para validação de FACS, uma preparação de núcleos bruto foi obtida por homogenizacao homogeneização de espinais usando a preparação do detergente-mecânica, seguida de fixação imediata com 1% PFA com um período de incubação de 5 min. Fixação foi saciada com glicina de 250 mM, e núcleos foram coletados. Coloração com anticorpos anti-NeuN realizou-se na solução. FACS foi a fixo, núcleos NeuN manchado usando um classificador de pilha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: preparação de núcleos sem homogeneização. Núcleos eram resuspended antes da centrifugação de densidade de sacarose seguindo A detergente-mecânico ou lise de hipotônica-mecânica B , sem homogeneização. * Denota restos celulares conectados a núcleos (A) e um multiplet dos núcleos ligados por restos celulares (B). Núcleos resuspended em PBS com 0,04% BSA após centrifugação de densidade de sacarose. Núcleos eram fixas com 2% paraformaldeído e posteriormente corados usando Trypan azul ou DAPI. Imagens foram tiradas 10 X (escala bar 100 µm) usando brightfield e epi-fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo final do presente protocolo é isolar núcleos contendo RNA de alta qualidade para análise transcricional a jusante. Adaptamos snRNA-Seq métodos para o perfil de todos os tipos de células na medula espinhal. Inicialmente, achamos que métodos de dissociação típica célula eram ineficazes para sequenciamento do RNA de única célula, como os neurônios da medula espinhal são particularmente vulneráveis à morte celular. Além disso, métodos de dissociação celular induzem a expressão de vários genes de atividade - e -resposta ao estresse por até vários cem vezes mais. 3 , 4 , 16 tendo em conta os inconvenientes associados com preparações de célula única, nós e os outros usaram núcleos como alternativa. 16 , 17 , 18 , 24 este método também pode ser usado em tecidos humanos, incluindo o tecido congelado da medula espinhal. 4 , 19 , 24 aqui, descreveremos os pontos fortes e as limitações desta abordagem.
Pontos fortes deste método incluem a vacância de pernas induzida experimentalmente, bem como a capacidade de usar o tecido fresco ou congelado. 4 assim, essa abordagem pode ser útil para sondar endógenas pernas após um estímulo ou comportamento. 1 , 3 , 4 uma das vantagens deste método é que ele não requer dispositivos especializados para utilização de núcleos para sequenciamento de núcleo único maciçamente paralelo, mas pode usar a plataforma desenvolvida por Macosko et al 2015, com pequenos ajustes de taxa de fluxo e o buffer de Lise, ou usam sistemas comercialmente disponíveis. Além disso, sequenciamento de núcleo único é provado para ser um método comparável àquele de sequenciamento de célula única para a identificação dos tipos de célula, empréstimos para a força desta abordagem. 28 , 29 no entanto, existem várias limitações importantes desta abordagem. Núcleos contêm cerca de 20-50% de mRNA celular,29 e isto é refletido em um número menor de transcritos por núcleo em relação ao sequenciamento de célula única. 18 , 29 incluindo intrônicas leituras de snRNA-Seq é um abordagem para aumentar o número de genes detectados.
Existem vários protocolos disponíveis que permitem o isolamento dos núcleos do tecido. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 em comparação com a maioria dos outros métodos, os protocolos aqui apresentados não exige remoção de mielina, ultracentrifugação, ou muitas etapas de centrifugação ou lavagens que podem levar a diminuir os números finais dos núcleos. Além disso, este protocolo leva 45 min (detergente-mecânica) ou 1 hora (hipotônica-mecânica) para completar. Comerciais protocolos suportados em plataformas microfluídicos são mais que o dobro do tempo e requerem muitas mais etapas de centrifugação, aumentando o risco de perder os núcleos. Em contraste com protocolos de isolamento de núcleos que envolvem apenas a Lise e a filtragem, os métodos aqui apresentados incluem um gradiente de sacarose para aumentar a pureza dos núcleos finais. Esta etapa é necessária para o tecido adulto da medula espinhal, devido a grande porcentagem de matéria branca e os restos de mielina resultante.
O protocolo de Lise detergente-mecânico pode ser usado para o tecido completa dissociação e Lise, e o protocolo de Lise hipotónica-mecânico pode ser usado para controlar a quantidade de detritos de dissociação e celular de tecido permitido no aplicativo a jusante. Estes protocolos podem ser usados para material de bio-banco, difícil dissociar os tecidos e para a investigação de dependente da atividade transcricionais alterações através do isolamento de núcleos para jusante maciçamente paralelo snRNA-Seq Além de sequenciamento maciçamente paralelo único núcleo RNA, este protocolo pode ser usado para isolar núcleos para aplicações alternativas, incluindo imunofluorescência e FACS e análise epigenética, tais como estudos de metilação de DNA e ChIP-Seq (Figura 4 ). 23
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Disclosures
Temos sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li e C.I. Dobrott pelo apoio técnico e discussões úteis e C. Kathe para revisar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
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Neurociência questão 140 núcleos RNA sequencing snRNA-Seq maciçamente paralelo medula espinhal gradiente de sacaroseErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
