Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Abstract

Eine einzelne Zelle Genexpression sondieren ermöglicht die Identifizierung von Zelltyp und Zellstatus. Einzelne Zelle RNA Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium transcriptional Profile der Zellen, vor allem in heterogenen Geweben wie das zentrale Nervensystem entstanden. Dissoziation-Methoden, die für die einzelne Zelle Sequenzierung erforderlich können jedoch auf experimentelle Veränderungen in der Gen-Ausdruck und Zelle Tod führen. Darüber hinaus sind diese Methoden in der Regel auf frischem Gewebe, wodurch Studien zur Archivierung und Bio-Bank Material beschränkt. Einzigen Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist eine attraktive Alternative für transkriptionelle Studien, da es genau identifiziert Zelltypen, erlaubt die Untersuchung von Gewebe, das gefrorene oder schwer zu distanzieren, und reduziert die Dissoziation-induzierte die Transkription. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Protokoll für schnelle Lokalisierung der Kerne für nachgeschaltete SnRNA-Seq. Diese Methode ermöglicht die Trennung der Kerne von frischen oder gefrorenen Rückenmark Proben und kann mit zwei parallelen Tröpfchen Kapselung Plattformen kombiniert werden.

Introduction

Das Nervensystem besteht aus heterogenen Gruppen von Zellen, in denen vielfältige morphologische, Biochemische und elektrophysiologische Eigenschaften angezeigt. Während die Masse RNA Sequenzierung nützlich für die Bestimmung der Gewebe-Änderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen wurde, schließt es die Erkennung von transcriptional Änderungen auf der Ebene der einzelnen Zelle. Jüngste Fortschritte in der einzelligen transkriptionelle Analyse konnten die Einteilung der heterogenen Zellen in funktionellen Gruppen anhand ihrer molekularen Repertoire und können auch genutzt werden, um Gruppen von Neuronen zu erkennen, die vor kurzem aktiv gewesen. 1 , 2 , 3 , 4 in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung der einzelnen Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq) die Untersuchung der Genexpression in Einzelzellen, bietet einen Blick in Zelltyp Vielfalt ermöglicht. 5

Die Entstehung der skalierbare Ansätze wie massiv parallelen ScRNA-FF, lieferte Plattformen zur Sequenz heterogene Gewebe, einschließlich viele Regionen des zentralen Nervensystems. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch einzelne Zelle Dissoziation Methoden Zelltod sowie experimentelle Veränderungen in der Genexpression führen. 16 neuere Arbeiten adaptierte Einzelzelle sequenziermethoden um Erhaltung der endogenen transcriptional Profile zu aktivieren. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 diese Strategien wurden besonders geeignet zur Erkennung von unmittelbaren frühen (IEG) Genexpression nach Sinnesreiz oder Verhalten. 3 , 4 In der Zukunft könnte diese Strategie auch verwendet werden, dynamische Veränderungen in den Geweben bei Krankheitszuständen oder in Reaktion auf stress zu studieren. Dieser Methoden einzelne Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist ein vielversprechender Ansatz, das beinhaltet keine Stress auslösende Zelle Dissoziation und kann verwendet werden, schwierig, Gewebe (z. B. das Rückenmark) zu distanzieren, sowie gefrorene Gewebe. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted von früheren Kerne Isolierung Methoden nutzt20,21,22,23,25 SnRNA-Seq in der Regel schnelle Gewebe Störungen und Zelle lyse unter kalten Bedingungen, Zentrifugierung und Trennung der Kerne von zelltrümmer. 4 Kerne für die nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation auf mehreren Plattformen in mikrofluidischen Tröpfchen Kapselung absperrbar. 4 , 7 , 24 , 25 diese Methode ermöglicht einen Überblick über die transkriptionelle Aktivität aus Tausenden von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt.

Es gibt mehrere Strategien für die Freigabe von Kernen von Zellen vor Isolation und Sequenzierung, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile. Hier beschreiben wir vergleichen zwei Protokolle zur Isolierung von Kernen aus dem Erwachsenen Rückenmark für die nachgelagerten massiv parallelen SnRNA-Seq ermöglichen: Waschmittel-mechanische Lyse und hypotone-mechanische Lyse. Waschmittel-mechanische Lyse liefert komplette Gewebe Störungen und eine endgültige Mehrertrag von Kernen. Hypotone Maschinenbau-Lyse enthält eine steuerbare Maß an Gewebe Störungen, bietet eine Möglichkeit für die Auswahl ein Gleichgewicht zwischen der Menge und Reinheit der letzten nuklearen Ausbeute. Diese Ansätze bieten vergleichbare RNA-Ausbeute, ermittelte Anzahl von Genen pro Kern und Zelltyp profiling und können auch beide verwendet werden erfolgreich für SnRNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle tierische Arbeit wurde nach einem Protokoll genehmigt von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care und Use Committee durchgeführt. Ausgewogene Proben von männlichen und weiblichen ICR/CD-1 Wildtyp Mäusen, zwischen 8 und 12 Wochen alt, wurden für alle Experimente verwendet. Mäuse sollten in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Animal Care und Use Committee Richtlinien behandelt werden.

1. Vorbereitung von Materialien und Puffer

  1. Bereiten Sie alle Puffer Tag der Nutzung und Pre-chill auf Eis (siehe Tabelle 1).
    1. Wenn Reinigungsmittel-mechanische Lyse, bereiten Sie Waschmittel Lyse-Puffer (> 500 μL pro Probe), niedrigen Saccharose Puffer (> 6 mL pro Probe), Saccharose Dichte Puffer (> 12,5 mL pro Probe) und die Wiederfreisetzung Lösung (> 1 mL).
    2. Wenn hypoton-mechanische Lyse, bereiten hypotone Lyse Puffer (> 5 mL pro Probe), HEB Medium (> 5 mL pro Probe), niedrigen Saccharose Puffer (> 3 mL pro Probe) Saccharose Dichte Puffer (> 12,5 mL pro Probe), und die Wiederfreisetzung Lösung (> 1 mL).
    3. Hinzu kommen 25 μL der Dithiothreitol (DTT) 25 mL des Puffers niedrigen Saccharose und eine weitere 25 μL von DVB-t, 25 mL des Puffers Saccharose Dichte Gradienten vor dem Starten des Protokolls.
  2. Bedecken Sie die sezierenden Oberfläche mit Alufolie zu minimieren Kontamination der Probe mit Fasern aus Papiertüchern oder Bank-Protektoren, die mikrofluidische Kanäle verwendet werden, für die Erfassung der einzelnen Kerne verstopfen können.
  3. Sprühen Sie resektionsinstrumente und Sitzbank Platz mit einer RNase Dekontaminationslösung. Darüber hinaus spray innen von der Dounce Homogenisator (bei Verwendung von Reinigungsmittel-mechanische Zelle Lysis) und Oak Ridge Rohr mit einer RNase Dekontaminationslösung. Spülen Sie das Dounce und Oak Ridge Rohr mit hochreinen, RNase-freies Wasser.
  4. Pre-chill alle Röhrchen (50 mL konisch, Oak Ridge) und Dounce Homogenisator Röhren auf dem Eis.
  5. Feuer Polieren eine Reihe von Pasteur Pipetten (bei Verwendung von hypoton-mechanische Zelle Lysis).

2. Vorbereitung des Rückenmarks

  1. Wenn frische Gewebe, einschläfern der Maus durch CO2 Einatmen. Sprühen Sie nach Euthanasie das Fell der Maus mit 70 % Ethanol, Haar-Verunreinigungen in der Probe zu minimieren.
  2. Enthaupten Sie die Maus mit scharfen, RNase-freie chirurgische Scheren. Als nächstes leichtes Anheben der Bauch Haut mit Pinzette und machen einen Schnitt entlang der Länge des Körpers, um die inneren Organe aussetzen.
  3. Ausweiden der Maus durch Ziehen an die inneren Organen aus der Körperhöhle mit Pinzette. Verwenden Sie keine Papiertücher auf den Bereich sauber oder Organe zu entfernen, da diese Verunreinigungen einführen kann. Mit Schere, Schnitt die vertebrale Spalte zwischen L2 und L3 Wirbelsäule Wirbel.
    Hinweis: Mit der Praxis, kann dieser Schritt in weniger als 30 Sekunden erreicht werden.
    1. Passen Sie zum Auswerfen des Rückenmarks eine 3 mL-Spritze mit eiskaltem PBS mit einer Nadel 25 G ¼ Zoll. Setzen Sie die Spitze der Nadel in die sakrale Ende der Wirbelsäule. Verwenden Sie zwei Finger Einklemmen der Wirbel um eine gute Abdichtung um die Spitze der Nadel zu erstellen und auf den Kolben drücken, um das Rückenmark Rostral auswerfen. Legen Sie das Rückenmark in einer Petrischale mit eiskaltem PBS.
    2. An dieser Stelle frieren Sie das Gewebe ein und bei-80 ° C lagern Sie oder verwenden Sie sofort für Waschmittel-mechanische (Schritt 3) oder hypotone-mechanische (Schritt 4) Lyse.
  4. Wenn mit tiefgefrorenem Gewebe, pflegen das Gewebe auf Trockeneis, fahren Sie mit Spülmittel-mechanische (Schritt 3) oder hypotone-mechanische (Schritt 4) Lyse.

3. Reinigungsmittel-mechanische Zelle Lysis

  1. Legen Sie die Lendenwirbelsäule Rückenmark in einen vorgekühlt Dounce-Homogenisator und fügen Sie 500 mL Waschmittel Lyse Puffer vorab gekühlt.
    Hinweis: Eine Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark ist 325,5 mg ± 63,9 mg Standardfehler des Mittelwertes (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g des Gewebes kann erfolgreich eingesetzt werden.
  2. Dounce mit 5 Schlägen der Stößel ("lose" zerstoßen), dann ca. 5-10 Schläge der Stößel B ('eng' Stößel). Aufhebung der Homogenisator aus der Lyse Lösung zwischen Strichen und vermeiden Sie Einführung Bläschen.
  3. Legen Sie ein 40 mm Sieb über einer vorgekühlt 50 mL konische Rohr und Prewet mit 1 mL der niedrigen Saccharose Puffer.
  4. Die Dounce-Homogenisator, enthält die rohen Kerne in der Lyse Puffer 1 mL der niedrigen Saccharose Puffer hinzu und Mischen von 2 – 3 Mal pipettieren.
  5. Die 40 mm-Sieb übergehen Sie die rohen Kerne Prep in das vorgekühlt 50 mL konische Röhrchen.
  6. Die 40 mm-Sieb, 3 mL des Puffers niedrigen Saccharose und 500 mL des Puffers Lyse das Endvolumen bringen übergehen Sie einen zusätzliche 1 mL niedrigen Saccharose Puffer.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, wenn mehrere Schnüre, Bündelung in der gleichen konische Röhre kombinieren.
  8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.200 x g für 10 min bei 4 ° C. Nach Abschluss der Zentrifugation Dekantieren Sie überstand. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.

4. hypoton-mechanische Zelle Lysis

  1. Ort die Lendenwirbelsäule Rückenmark in 5 mL des Puffers hypotone Lyse in einer Gewebekultur-Schale. Das stumpfe Ende Frühjahr Schere halbieren das Rückenmark und dann Frühjahr Schere um die Schnur in 3 – 4 mm Stücke schneiden verwenden, aber nicht hacken.
    Hinweis: 50 mg – 1,5 g des Gewebes kann erfolgreich eingesetzt werden.
  2. Auf dem Eis für 15 min, 2 – 3 Mal wirbelnden inkubieren.
  3. Zugeben Sie 5 mL HEB Medium den hypotone Lyse Puffer verdünnen.
  4. Genannte Gewebe 10 mal mit einem serologischen 5-mL-Pipette, oder bis alle Teile des Gewebes durch die Öffnung der Pipette reibungslos bewegen.
  5. Mit einer Reihe von drei feuerpolierte Pasteur Pipetten mit zunehmend schmaler Durchmesser genannte (~ 900 – 600 mm).
    1. Für jede Pipette genannte 5 - 15 Mal, Gewebe zu begleichen, 1 – 2 mL überstand mit getrennten Kerne entfernen und ein 40 mm-Sieb in ein vorgekühlt 50 mL konische Röhrchen übergehen lassen.
    2. Sicherstellen Sie nach der Verreibung mit der kleinsten Größe Pasteurpipette, dass die Homogenat reibungslos durch die PIPETTENSPITZE fließt. Die 40 mm-Sieb übergehen Sie die restliche Lösung in der 50 mL konische Röhrchen.
      Hinweis: Die Gesamtzahl der verreibungen eingestellt werden wie gewünscht. Die Hirnhaut des Rückenmarks Maus bleibt, aber es ist wichtig, sichtbaren Klumpen des Rückenmarks genannte. Die 40 m Sieb übergehen Sie die restlichen Homogenat. Vermeiden Sie Luftblasen während der Verreibung Einführung.
  6. Zentrifugieren Sie die gefilterten Probe bei 1.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Nach Abschluss der Zentrifugation, Dekantieren und den überstand verwerfen. Fahren Sie mit Schritt 5 fort.

5. Homogenisierung und Saccharose Dichtegradient

  1. Nach Schritt 3 oder 4 Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL niedrigen Saccharose Puffer. Schwenken Sie vorsichtig um die Pellets von der Wand zur Erleichterung der Wiederfreisetzung zu entfernen. Lassen Sie die Probe sitzen für 2 min auf Eis und die Aussetzung auf einem Oak Ridge Rohr übertragen.
  2. Mit Hilfe der Homogenisator bei Einstellung 1, die Kerne im niedrigen Saccharose Puffer für 15-30 s, halten Sie die Probe auf dem Eis zu homogenisieren.
    Hinweis: Verwendung 15 s bei Verwendung einer lumbalen Rückenmarks oder 30 s wenn gebündelt Proben oder eine ganze Rückenmark.
  3. Mit Hilfe einer serologischen Pipette Schicht 12,5 mL Dichte Saccharose Puffer unter niedrigen Saccharose Puffer Homogenat, kümmert sich nicht um eine Blase zu erstellen, die die Dichte Schichten stört.
  4. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.200 x g für 20 min bei 4 ° C.
  5. Nach Abschluss der Zentrifugation sofort Dekantieren des Überstands in einer flinken Bewegung.
    Hinweis: Ein Restvolumen (weniger als 400 mL) von Saccharose Puffer kann verworfen werden, wenn gewünscht, ein leiser und sauberer Endprobe zu produzieren, aber dieses Restvolumen enthält Kerne und erhalten werden kann, um die Kerne Ertrag zu maximieren.
  6. Mit 100 mL - 1 mL der Lösung Wiederfreisetzung, Aufschwemmen der Kerne auf der Wand bleiben. Vermeiden Sie das Myelin "Stirnrunzeln", das mit der Waschmittel-Basis Vorbereitung bleibt.
  7. Filtern Sie die Kerne durch ein 30 – 35 mm Porengröße Sieb und sammeln Sie in einem vorgekühlt Rohr.
  8. Bestimmen Sie die Kerne liefern mit einem Hemocytometer Kerne unter einem 10 X-Objektiv zu zählen.
    Hinweis: Trypan blau kann hinzugefügt werden, Kerne, visualisieren die blau erscheinen soll. Beachten Sie die Höhe der zelltrümmer.
  9. Fahren Sie mit Schritt 6 oder 7.

(6) massiv parallele SnRNA-Sequenzierung: akademische Plattform7

  1. Führen Sie die massiv parallele SnRNA Sequenzierung (z. B.Drop-Seq) Methode wie oben beschrieben7 mit folgenden Änderungen:4
    1. Stellen Sie Kerne, eine Endkonzentration von 225 Kerne pro mL.
    2. Bereiten Sie Barcodes Perlen in einer Konzentration von 250 Perlen pro mL.
    3. Die Lyse-Puffer mit 0,7 % Sarkosyl vorzubereiten.
    4. Passen Sie die Volumenströme bis 35 mL / min. für Perlen, 35 mL / min. für Kerne und 200 mL / min. für Öl.

(7) massiv parallele SnRNA-Sequenzierung: kommerzielle Plattform26

  1. Führen Sie massiv parallelen SnRNA-Sequenzierung mit dem kommerziellen Plattform (z.B.Chrom Zelle Gene Expression Einzellösung) Produkte nach dem Hersteller Anleitungen26 mit der folgenden Änderung:
    1. Fügen Sie nach rückwärts-Transkription einen zusätzliche PCR-Zyklus um die berechnete Anzahl von Zyklen für cDNA Amplification basierend auf die gezielte Zelle Erholung zum Ausgleich der verminderten cDNA aus Kernen im Vergleich zu Zellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier haben wir Isolierung der Kerne aus dem Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark für nachgeschaltete massiv parallelen RNA Sequenzierung durchgeführt. Das Protokoll beteiligten drei Hauptkomponenten: Gewebe Störungen und zellulären Lyse, Homogenisierung und Saccharose Dichte Zentrifugation (Abbildung 1). Innerhalb von Sekunden ergab die Waschmittel-mechanische Lyse eine grobe Kerne Vorbereitung mit einer großen Anzahl von Kernen sowie Mobilfunk und Gewebe Schmutz (Abb. 2ATabelle 2). Nach einer Viertelstunde ergab die hypotone-mechanische Lyse eine grobe Kerne-Vorbereitung, die weniger Schmutz, aber auch weniger Kerne (Abb. 2 bTabelle 2) hatte. Beide Präparate unterzog Homogenisierung (Abbildung 2 und D) und Saccharose Dichte Gradienten-Zentrifugierung vor Wiederfreisetzung in PBS mit 0,04 % BSA (Abbildung 2E und F). Im Durchschnitt eine Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark (325,5 mg ± 63,9 mg Standardfehler des Mittelwerts, SEM, N = 4) ergab 5,1 x 105 Kerne (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) nach der Waschmittel-mechanische-Lyse und 2.0 x 105 Kerne (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) Anschluss an die hypotone-mechanische Lyse. Die Zahl der Kerne in der Lendenwirbelsäule Rückenmark wurde geschätzt, von der ersten groben Vorbereitung nach Dounce Homogenisierung in der Waschmittel-mechanische Lyse-Protokoll (2,6 x 106 Kerne ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, Tabelle 2). Die endgültige Stichprobe aus dem Waschmittel-mechanische Lyse-Protokoll besteht aus 20 % der ursprünglichen Kerne (± 2 % SEM, N = 3, Tabelle 2). Das rohe Kerne Präparat aus der hypotone-mechanische Lyse nach Verreibung enthält 62 % der ursprünglichen Kerne (± 2 % SEM, N = 3, Tabelle 2). Die endgültige hypoton-mechanische Lyse-Probe enthält nur 8 % der ursprünglichen Kerne (± 1 % SEM, N = 3, Tabelle 2). Wir keinen Unterschied in den Gesamtertrag RNA oder die cDNA-Rendite für ein Housekeeping-gen (Gapdh) nicht zwischen den beiden Vorbereitung Methoden erkennen. Mit qPCR, die Waschmittel-Methode ergab 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) von Gesamt-RNS und eine durchschnittliche Schwelle Erkennungszyklus von 25,2 (1,3 ± SEM) für Gapdh cDNA qPCR und die hypotone Methode ergab 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) von Gesamt-RNS und eine durchschnittliche Nachweisgrenze Zyklus von 26,1 für Gapdh cDNA (0,8 ± SEM). Die beiden Lyse Optionen sowohl isolieren Kerne aus den Geweben schwierig zu distanzieren und das qualitativ hochwertige Material für die nachgelagerten Single-Kern-RNA-Sequenzierung.

Angesichts der Größe des mikrofluidische Kanäle für nachgeschaltete massiv parallelen einzigen Kern Sequenzierung Plattformen, ist es wichtig, geben Sie eine Kerne Aufhängung frei von großen Partikeln oder zelltrümmer, Verstopfung zu verhindern. Nach dem hier vorgestellten Protokoll gab es keine Fälle von Verstopfung auf der Plattform angepasst von Macosko Et al. 2015 (N = 17) und eine teilweise verstopfen auf die Plattform (N = 16).

Die Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Verfahren wurden verwendet, um die Kerne erfolgreich für zwei parallele Tröpfchen Kapselung Plattformen zu isolieren und repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt. Beide Ansätze aktiviert transkriptionelle Profilierung der Tausende von Kernen und Klassifizierung der Zelltypen im Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark (Abbildung 3). 4 diese Ansätze führten zu vergleichbaren Gene pro Kern für jeden Zelltyp (Abbildung 3 und D). Die Preise für eine Erholung der Eingabe Kerne zwischen den beiden Plattformen unterscheiden sich. Die Plattform angepasst von Macosko Et Al. 2015 mit Modifikationen von Sathyamurthy Et al. 2018 erholte sich schätzungsweise 0,59 % der Kerne (± 0,05 % SEM, N = 17), während die Plattform wieder eine geschätzte 53,7 % Kerne (N = 2).

Dieses Protokoll bereichert leicht neuronalen Kerne in die letzten Vorbereitungen. Im lumbalen Rückenmarks Gewebeschnitte, wir fanden, dass 27 % der Kerne für die neuronale Marker NeuN positiv (N = 7.368 Kerne von 2 Tieren), während 31,9 % Gesamt Kerne mit dem Ausdruck NeuN, Waschmittel-mechanische Kerne Vorbereitung des lumbalen Rückenmarks führte durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS, ± 2,0 % SEM, N = 13 unabhängigen Kerne Vorbereitungen mit gepoolten Proben von mehreren Tieren in jeder Vorbereitung, Abbildung 4). Dies ist vergleichbar mit was zuvor für den Prozentsatz der NeuN-positiven Kerne in das gesamte Rückenmark (20 % bis 24 % je nach Alter), beobachtet wurde27 einschließlich die zervikalen und thorakalen Regionen, die mehr weiße Substanz und Oligodendrozyten. Der Hinweis NeuN/Rbfox3 drückt sich nicht in alle Neuronen und dementsprechend sind diese Zahlen wahrscheinlich bescheidene unterschätzt. Es ist möglich, dass kleinere nicht-neuronalen Zellen während der Saccharose gradient Reinigung leicht erschöpft sind. Darüber hinaus können nachgeschaltete Filterung und Analyse Parameter nach Sequenzierung die endgültigen Zelltyp Verteilung verändern, da Neuronen mehr Gene pro Kern haben (Abbildung 3 und D) und sind daher weniger wahrscheinlich entfernt werden während der Filterung.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die betreut werden müssen. Erste, übermäßiges Douncing oder Verreibung (in Schritt 3 oder 4, beziehungsweise) kann zu einem Anstieg der zellulären Schmutz und Partikel-Bildung führen. Obwohl Filtration und Saccharose Dichte Zentrifugation große Partikel trennen können, sobald kleine Partikel während der zellulären Lyse erzeugt werden, sind sie schwer zu entfernen. Zweitens während der Homogenisierung, stellen Sie nicht den Homogenisator direkt auf den Boden des Röhrchens Oak Ridge. Stattdessen tauchen Sie Ende der Homogenisator in die niedrigen Saccharoselösung, die resuspendierte Kerne, ohne Sie zu berühren den Boden des Röhrchens enthält. Homogenisierung verbessert nuklearen Isolierung durch Entfernen zelltrümmer und Verringerung der Klumpen und Multiplets (Abbildung 5). Im Anschluss an Saccharose Dichte Zentrifugation ist es wichtig, umgehend entfernen die Oak Ridge-Röhre aus der Zentrifuge und schnell Dekantieren des Überstands in ein "flimmernden" Eilgang. Wenn die Kerne aus der Wand des Rohres Oak Ridge resuspending, Aufschwemmen Sie "salzige" Pellets aus auf halbem Weg zwischen der Myelin-Band und der Boden des Röhrchens. Beachten Sie, dass die Tablette möglicherweise nicht sichtbar. Resuspending Kerne höher entlang der Röhre kann dazu führen, dass Myelin Verunreinigungen bei der Herstellung von Kernen. Die zelluläre Lyse und Saccharose Dichte Zentrifugation Schritte sind die kritischsten zur Verringerung der Partikel, die mikrofluidische Kanäle für nachgeschaltete Anwendung verstopfen können.

Namen von Material / Ausrüstung Lager Konzentration Endkonzentration Volumen / Menge
Waschmittel Lysis Puffer
Niedrigen Saccharose Puffer - - 600 ΜL
Triton-X 20 % 0,10 % 3 ΜL
Hypotone Lysis Puffer
Tris-HCl (pH = 7,4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0,01 % 1 ΜL
Nuklease-freies Wasser bis zu 10 mL
HEB-Medium
Hibernate-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Niedrigen Saccharose Puffer
Saccharose - 0,32 M 2,75 g
HEPES (pH = 8,0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM 125 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0,5 M 0,1 mM 5 ΜL
DVB-T 1 M 1 mM 25 ΜL
Nuklease-freies Wasser bis zu 25 mL
Saccharose-Dichte-Puffer
Saccharose - 1 M 8,6 g
HEPES (pH = 8,0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
DVB-T 1 M 1 mM 25 ΜL
Nuklease-freies Wasser bis zu 25 mL
Wiederfreisetzung Lösung
1 X PBS - - 1 mL
OS, 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
RNAse-Inhibitor 40 U/ΜL 0,2 U/ΜL 5 ΜL

Tabelle 1: Tabelle der Lösungen.

Rohöl Homogenisiert Endgültige
Waschmittel-Maschinenbau 100 ± 15 % 87 ± 9 % 20 ± 2 %
Hypotone-mechanische 62 ± 12 % 35 ± 4 % 8 ± 1 %

Tabelle 2: Rendite der Kerne bei jedem Schritt in das Protokoll. Die Anzahl der Kerne in der ersten groben Vorbereitung nach Dounce Homogenisierung in der Waschmittel-mechanische Lyse-Protokoll wurde verwendet, um die Anzahl der Kerne in der Lendenwirbelsäule Rückenmark zu schätzen. Die ersten Kerne ergeben (2,6 x 106 Kerne ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) wurde verwendet, um die Kerne Ertrag bei jedem nachgeschalteten Schritt für beide Waschmittel und hypotone mechanischen Lyse Protokolle zu berechnen. Die Anzahl der Kerne durch die hypotone-mechanische Vorbereitung isoliert wurde auf die geschätzte erste Kerne normalisiert. Werte in der Tabelle sind Mittelwert ± SEM, N = 3.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische der nuklearen Isolation. Kerne aus dem Erwachsenen Rückenmark können mithilfe von Waschmittel-mechanische oder hypotone-mechanische Zelle Lysis, gefolgt von Homogenisierung und Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugierung isoliert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schritte im Protokoll Vertreter Hellfeld und DAPI-gefärbten Kernen bei Key.  (A, B) rohe Kerne nach Waschmittel-mechanische oder hypotone-mechanische Lyse. (C, D) Kerne nach Homogenisierung. (E, F) Kerne mit PBS-Puffer mit 0,04 % BSA nach Zentrifugation Saccharose Dichte Nukleinsäuretablette. Kerne wurden mit 2 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend gebeizt Trypan blau oder DAPI verwenden. Bilder wurden bei 10 X (Maßstabsleiste = 100 µm) mit Hellfeld und Epi-Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Vertreter tSNE Grundstück von sequenzierten Kerne: mit Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Lyse. (A) Ergebnisse der Sequenzierung über 17.000 Kerne aus dem seziert Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark nach Waschmittel-mechanische Lyse und nach Macosko Et Al. 2015 mit Modifikationen von Sathyamurthy Et al. 2018. diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Sathyamurthy Et Al. modifiziert 2018.4 (B) Ergebnisse von Sequenzierung 5.000 Kernen aus dem ausgeworfenen Erwachsenen Lendenwirbelsäule Rückenmark nach hypoton-mechanische Lyse und eine kommerzielle mikrofluidischen Einzelzelle Kapselung Plattform. 26  (C, D) durchschnittliche Gene pro Kern Ergebnisse nach der wichtigsten Zelltypen in der Erwachsenen Maus Rückenmark ± SEM clustering Der Hinweis, das Waschmittel-mechanische Lyse Verfahren gefolgt von Macosko Et Al. 2015-Plattform erfolgte mittels seziert Lendenwirbelsäule Rückenmark, während die hypotone-mechanische Lyse, gefolgt von der Handelsplattform durchgeführt wurde mit lumbalen Rückenmarks ausgeworfen, (wie in diesem Protokoll beschrieben). Angesichts der Tatsache, dass die Schnur Auswerfen der Dura und Dorsal Root Ganglien entfernt, die meningealen/Schwann-Zelle-Cluster fehlt aus Abbildung 3 b und D. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: FACS-Grundstück von NeuN+ Kerne nach Waschmittel-mechanische Lyse. FACS-Plot zeigt feste Kerne gebeizt für NeuN (durchschnittliche 31,9 % der gesamten Kerne ± 2,0 % SEM, N = 13), isoliert mit dem Waschmittel-mechanische Lyse-Protokoll. Für die sofortige Fixierung, Kerne für FACS Validierung, erhielt eine grobe Kerne Vorbereitung durch Dounce Homogenisierung der Wirbelsäule Schnüre mit den Reinigungsmittel-mechanische Vorbereitung, gefolgt von sofortige Fixierung mit 1 % PFA mit einer Inkubationszeit von 5 Minuten. Fixierung mit 250 mM Glycin gestillt war, und Kerne wurden gesammelt. Färbung mit Antikörper Anti-NeuN erklang in Lösung. FACS wurde an durchgeführt behoben, NeuN gebeizt Kerne mit einer Zelle Sorter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Kerne Zubereitung ohne Homogenisierung. Kerne wurden vor der Saccharose Dichte Zentrifugation nach A Waschmittel-mechanische oder B hypoton-mechanische Lyse ohne Homogenisierung Nukleinsäuretablette. * Kennzeichnet zelltrümmer befestigt Kerne (A) und eine Multiplet von Kernen durch zelltrümmer (B)befestigt. Kerne mit PBS-Puffer mit 0,04 % BSA nach Zentrifugation Saccharose Dichte Nukleinsäuretablette. Kerne wurden mit 2 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend gebeizt Trypan blau oder DAPI verwenden. Bilder wurden bei 10 X (Skala Bar 100 µm) mit Hellfeld und Epi-Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist, Kerne mit qualitativ hochwertigen RNA für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu isolieren. Wir angepasst SnRNA-Seq Methoden um alle Zelltypen im Rückenmark zu profilieren. Zunächst fanden wir, dass typische Zelle Dissoziation Methoden für einzelne Zelle RNA Sequenzierung, unwirksam waren, wie Rückenmark Neuronen Absterben von Zellen besonders anfällig sind. Darüber hinaus verursachen Zelle Dissoziation Methoden Ausdruck der verschiedenen Aktivitäten und Stressantwort Gene von bis zu mehreren hundertfach. 3 , 4 , 16 angesichts der Nachteile mit den einzelnen Zelle Vorbereitungen, haben wir und andere Kerne als Alternative verwendet. 16 , 17 , 18 , 24 diese Methode kann auch auf menschliches Gewebe, einschließlich gefrorene Rückenmark Gewebe verwendet werden. 4 , 19 , 24 hier, werden wir die Stärken und Grenzen dieses Ansatzes beschreiben.

Die Vermeidung von experimentell induzierten IEGs sowie die Möglichkeit, frisches und gefrorenes Gewebe verwenden gehören zu den Stärken dieser Methode. 4 so, kann dieser Ansatz zum Sondieren endogenen IEGs infolge eines Verhaltens oder Anregung nützlich. 1 , 3 , 4 einer der Vorteile dieser Methode ist, dass es keine spezielle Geräte für die Nutzung von Kernen für massiv parallele einzigen Kern-Sequenzierung erfordert, aber kann von Macosko Et Al. 2015, mit geringfügigen Anpassungen der entwickelte Plattform lyse Puffer und Flow Rate oder im Handel erhältlichen Systeme. Darüber hinaus einzelne Kern Sequenzierung erweist sich eine vergleichbare Methode der Einzelzelle Sequenzierung zur Identifizierung von Zelltypen, die Kreditvergabe an die Stärke dieses Ansatzes. 28 , 29 es gibt jedoch einige wichtige Einschränkungen dieses Ansatzes. Kerne enthalten ca. 20-50 % der zellulären mRNA,29 , und dies spiegelt sich in einer geringeren Anzahl von Abschriften pro Kern im Vergleich zu einzelnen Zelle Sequenzierung. 18 , 29 einschließlich intronischen liest aus SnRNA-Seq ist ein Ansatz zur Erhöhung der Zahl der gefundenen Gene.

Es gibt mehrere verfügbaren Protokolle, die Isolation der Kerne von Gewebe zu ermöglichen. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 im Vergleich zu den meisten anderen Methoden, die hier vorgestellten Protokolle benötigen keine Myelin Entfernung, Ultrazentrifugation, oder viele Zentrifugation Schritte oder Waschungen, die um endgültige Anzahl der Kerne zu niedrigeren führen können. Darüber hinaus findet dieses Protokoll 45 min (Waschmittel-mechanisch) oder 1 Stunde (hypotone-mechanisch) abgeschlossen. Kommerzielle Protokollen auf mikrofluidischen Plattformen sind mehr als doppelt so lange und erfordern viele Zentrifugation Schritte, erhöhen das Risiko des Verlustes Kerne. Im Gegensatz zu den Kernen Isolierung Protokolle, die nur Zerstörung und Filterung beinhalten, gehören der hier vorgestellten Methoden einen Saccharose-Gradienten um die Reinheit der endgültigen Atomkerne zu erhöhen. Dieser Schritt ist erforderlich für Erwachsene Rückenmark Gewebe durch den großen Anteil der weißen Substanz und die daraus resultierende Myelin Trümmer.

Das Waschmittel-mechanische Lyse-Protokoll eignet sich für das komplette Gewebe Dissoziation und Lyse und hypotone-mechanische Lyse-Protokoll kann verwendet werden, um die Lichtmenge Gewebe Dissoziation und zellulären Schutt in der nachgeschalteten Anwendung erlaubt. Diese Protokolle können für Bio-Bank Material, schwer zu Geweben zu distanzieren und für die Untersuchung von aktivitätsabhängige transcriptional Änderungen durch die Isolation der Kerne für nachgeschaltete massiv parallelen SnRNA-FF verwendet werden Neben massiv parallelen einzigen Kern RNA Sequenzierung kann dieses Protokoll verwendet werden, um Kerne für alternative Anwendungen, einschließlich Immunfluoreszenz und FACS und epigenetische Analyse wie DNA-Methylierung Studien und ChIP-Seq (Abbildung 4 isolieren ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wir haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das intramurale Programm der NINDS (1 ZIA NS003153 02) und NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wir danken L. Li und CI Dobrott für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen und C. Käthe für die Überprüfung der Handschrift.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Tags

Neurowissenschaften Ausgabe 140 Kerne RNA Sequenzierung SnRNA-Seq massiv parallelen Rückenmark Saccharose gradient

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter