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Neuroscience

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Abstract

Sondant l’expression des gènes de la cellule individuelle permet l’identification du type de cellule et de l’état de la cellule. Séquençage de RNA unicellulaire a émergé comme un outil puissant pour l’étude des profils de transcriptional des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes tels que le système nerveux central. Cependant, méthodes de dissociation requis pour l’ordonnancement de la cellule unique peuvent conduire à des changements expérimentaux dans la gène expression et la mort cellulaire. En outre, ces méthodes sont généralement limités aux tissus frais, limitant ainsi les études sur les archives et le matériel de bio-Banque. Séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une alternative attrayante pour études transcriptionnels, étant donné qu’il identifie les types de cellules, permet l’étude des tissus congelés ou difficile de dissocier, avec précision et réduit la dissociation induite par le transcription. Nous présentons ici un protocole haut débit pour l’isolement rapide de noyaux pour aval snRNA-suiv. Cette méthode permet l’isolement des noyaux des échantillons frais ou congelés de la moelle épinière et peut être combinée avec deux plates-formes d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle.

Introduction

Le système nerveux est composé de groupes hétérogènes de cellules qui présentent une grande diversité de propriétés morphologiques, biochimiques et électrophysiologiques. Alors que le séquençage de RNA en vrac a été utile pour déterminer les modifications à l’échelle tissulaire dans l’expression de gène dans des conditions différentes, il s’oppose à la détection de changements transcriptionnelles au niveau unicellulaire. Les progrès récents dans l’analyse transcriptionnelle unicellulaires ont permis la classification des cellules hétérogènes en groupes fonctionnels basé sur leur répertoire moléculaire et peuvent même être exploités pour détecter les ensembles de neurones qui avaient été récemment actifs. 1 , 2 , 3 , 4 au cours des dix dernières années, le développement de l’ARN unicellulaire séquençage (scRNA-Seq) a permis l’étude de l’expression des gènes dans des cellules individuelles, offrant ainsi une vue de la diversité type de cellule. 5

L’émergence d’approches évolutives telles que massivement parallèle scRNA-Seq, a fourni des plates-formes de tissus hétérogènes de séquence, dont de nombreuses régions du système nerveux central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Toutefois, méthodes de dissociation unicellulaire peuvent conduire à la mort cellulaire, mais aussi les changements expérimentaux dans l’expression des gènes. 16 travaux récents a adapté des méthodes de séquençage unicellulaire pour permettre la préservation des profils de transcriptionnelles endogènes. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 ces stratégies ont été particulièrement adaptés pour la détection de l’expression des gènes (IEG) début immédiat après le stimulus sensoriel ou comportement. 3 , 4 dans le futur, cette stratégie pourrait également servir à étudier les changements dynamiques dans les tissus dans les états pathologiques ou en réponse au stress. De ces méthodes, séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une approche prometteuse qui n’implique pas de stress induisant la dissociation cellulaire et peut être utilisée sur difficile de dissocier les tissus (par exemple, la moelle épinière), mais aussi gelé des tissus. 4 , 17 , 18 , 19 adapté des précédentes méthodes d’isolement de noyaux,20,21,22,23,25 snRNA-Seq utilise généralement cellulaire et interruption rapide des tissus lyse dans des conditions froides, centrifugation et séparation des noyaux de débris cellulaires. 4 noyaux peuvent être isolés pour le séquençage de nouvelle génération en aval sur plusieurs plateformes d’encapsulation de gouttelettes microfluidiques. 4 , 7 , 24 , 25 cette méthode permet une capture instantanée de l’activité transcriptionnelle de milliers de cellules à un moment dans le temps.

Il existe plusieurs stratégies pour libérer les noyaux des cellules avant d’isolement et de séquençage, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients. Nous décrivons ici et comparer deux protocoles pour permettre l’isolement des noyaux de la moelle épinière adulte pour la snRNA-Seq massivement parallèle en aval : détergent-mechanical lyse et lyse hypotonique-mécanique. Détergent-mechanical lyse fournit la désorganisation complète de tissus et un meilleur rendement final des noyaux. Mécanique-lyse hypotonique comprend une certaine désorganisation du tissu, offrant la possibilité de sélectionner un équilibre entre la quantité et la pureté de la dernière puissance nucléaire contrôlable. Ces approches fournissent le rendement comparable de RNA, détecté un nombre de gènes par noyau et le profilage de type cellulaire et aussi peuvent être utilisés avec succès pour snRNA-suiv.

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Protocol

Tous les animaux travaux ont été réalisés conformément à un protocole approuvé National Institute of Neurological Disorders and Stroke animalier et Comité d’urbanisme. Équilibré des échantillons des souris mâles et femelles ICR/CD-1 sauvage, entre 8 et 12 semaines vieux, ont été utilisés pour toutes les expériences. Souris doivent être traités selon les directives locales institutionnelles animalier et Comité d’urbanisme.

1. préparation des matériaux et des tampons

  1. Préparer tous les tampons le jour d’utilisation et pré refroidir sur glace (voir tableau 1).
    1. Si vous utilisez le détergent-mechanical lyse, préparer le tampon de lyse détergent (> 500 μL / échantillon), tampon saccharose faible (> 6 mL par exemple), tampon de densité de saccharose (12,5 mL > par échantillon) et la solution de remise en suspension (> 1 mL).
    2. Si vous utilisez la lyse hypotonique-mécanique, préparer le tampon de lyse hypotonique (> 5 mL par exemple), tampon saccharose faible (> 3 mL par exemple), milieu HEB (> 5 mL par exemple), tampon de densité de saccharose (> 12,5 mL par exemple) et la solution de remise en suspension (> 1 mL).
    3. Ajouter 25 μL de dithiothréitol (DTT) à 25 mL de tampon saccharose faible et un autre 25 μL de la TNT à 25 mL de saccharose densité gradient tampon juste avant de commencer le protocole.
  2. Couvrir la surface dissection-une feuille d’aluminium pour minimiser la contamination de l’échantillon avec des fibres de papier essuie-tout ou protecteurs de banc, qui peuvent obstruer les canaux microfluidiques utilisées pour capturer des noyaux unique.
  3. Vaporiser les outils de dissection et de l’espace de banc avec une solution de décontamination de RNase. En outre, vaporisez l’intérieur du tube de homogénisateur Dounce (si vous utilisez la lyse cellulaire de détergent-mécanique) et Oak Ridge tube avec une solution de décontamination de RNase. Rincez bien le tube Dounce et Oak Ridge avec de l’eau ultrapure, RNase-libre.
  4. Pré refroidir tous les tubes de prélèvement (50 mL conique, Oak Ridge) et tubes homogénéisateur Dounce sur glace.
  5. Feu polonais une série de pipettes Pasteur (si vous utilisez la lyse hypotonique-mécanique cellulaire).

2. préparation de la moelle épinière

  1. Si vous utilisez les tissus frais, euthanasier la souris par inhalation de CO2 . Suite à l’euthanasie, vaporiser le pelage de la souris avec l’éthanol à 70 % pour minimiser la contamination de l’échantillon de cheveux.
  2. Décapiter la souris avec des ciseaux chirurgicaux sharp, libre de RNase. Ensuite, en soulevant doucement l’abdomen la peau avec une pince et faites une incision le long du corps pour exposer les organes internes.
  3. Éviscérer la souris en tirant sur les organes internes de la cavité du corps avec une pincette. N’utilisez pas de papier essuie-tout pour nettoyer la zone ou à prélever des organes comme cela peut introduire des contaminants. À l’aide de ciseaux, coupez la colonne vertébrale entre les vertèbres de la colonne vertébrale L2 et L3.
    Remarque : Avec la pratique, cette étape peut être réalisée en moins de 30 secondes.
    1. Pour éjecter la moelle épinière, adapter une seringue de 3 mL contenant PBS glacé avec une aiguille de ¼ de pouce de 25 G. Placer la pointe de l’aiguille dans l’extrémité sacrale de la colonne vertébrale. Utilisez deux doigts pour pincer les vertèbres pour créer un joint étanche autour de la pointe de l’aiguille et appuyez sur le poussoir pour éjecter la moelle épinière rostralement. Placer la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec du PBS glacée.
    2. À ce stade, geler les tissus et stocker à-80 ° C ou utiliser immédiatement pour détergent-mécanique (étape 3) ou lyse hypotonique-mécanique des (étape 4).
  4. Si à l’aide de tissus congelés, maintenir le tissu sur la glace sèche, passez à la lyse (étape 4) hypotonique-mécanique ou de détergent-mécanique (étape 3).

3. lyse des cellules détergent-mécanique

  1. Placer la moelle lombaire dans un homogénéisateur Dounce préalablement réfrigérée et ajouter 500 mL préalablement réfrigérées tampon de lyse détergent.
    Remarque : Une souris la moelle épinière lombaire est 325,5 mg mg 63,9 ± erreur-type de la moyenne (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g de tissus peuvent être utilisé avec succès.
  2. Dounce avec 5 coups de Pilon (Pilon « lâche »), puis de 5 à 10 coups de pilon B (« serré » pilon). Éviter l’homogénéisateur hors de la solution de lyse entre coups de levage et éviter d’introduire des bulles.
  3. Placez une passoire de 40 mm sur un tube conique préalablement refroidie 50 mL et prewet avec 1 mL de tampon saccharose faible.
  4. Ajouter 1 mL de tampon saccharose faible à l’homogénéisateur Dounce contenant les noyaux bruts dans le tampon de lyse et mélanger doucement en pipettant également, 2 à 3 fois.
  5. Passez la prep de noyaux bruts sur la crépine de 40 mm dans le tube conique préalablement refroidie 50 mL.
  6. Passez un supplémentaire 1 mL de tampon de saccharose faible sur le tamis de 40 mm, ce qui porte le volume final à 3 mL du tampon saccharose faible et 500 mL de tampon lyse.
  7. Répétez les étapes 3.1 à 3.6 Si vous associez plusieurs cordes, mise en commun dans le même tube conique.
  8. Centrifuger l’échantillon à 3 200 x g pendant 10 min à 4 ° C. Une fois la centrifugation terminée, éliminer le surnageant. Passez à l’étape 5.

4. lyse des cellules hypotonique-mécanique

  1. Placer la moelle lombaire dans 5 mL de tampon lyse hypotonique dans un plat de culture de tissus. Utilisez l’extrémité arrondie des ciseaux ressort coupent la moelle épinière, puis utilisez le ressort ciseaux pour couper le cordon en morceaux de 3 à 4 mm, mais ne pas mâché.
    Remarque : 50 mg – 1,5 g de tissu peut être utilisé avec succès.
  2. Incuber sur la glace pendant 15 minutes, en remuant 2 à 3 fois.
  3. Ajouter 5 mL de milieu HEB pour diluer le tampon de lyse hypotonique.
  4. Triturer le tissu 10 fois avec une pipette sérologique de 5 mL, ou jusqu'à ce que tous les morceaux du tissu avec SOUPLESE dans l’ouverture de la pipette.
  5. Triturer avec une série de trois pipettes de Pasteur feu poli diamètre progressivement plus étroit (~ 900-600 mm).
    1. Pour chaque pipette, triturer 5 à 15 fois, permettre aux tissus à s’installer, enlever 1 à 2 mL du surnageant contenant des noyaux dissociées et passer sur un tamis de 40 mm dans un tube conique préalablement refroidie 50 mL.
    2. Après trituration avec la pipette Pasteur de la plus petite taille, faire en sorte que l’homogénat circule en douceur grâce à l’embout de la pipette. Passez le reste de la solution sur la crépine de 40 mm dans le tube conique de 50 mL.
      Remarque : Le nombre total de triturations peut être réglé comme vous le souhaitez. Les méninges de la moelle épinière de souris restera, mais il est important de triturer des morceaux visibles de la moelle épinière. Passez l’homogénat restant sur le tamis de 40 m. Éviter d’introduire des bulles au cours de la trituration.
  6. Centrifuger l’échantillon filtré à 1 000 x g pendant 10 min à 4 ° C. Une fois la centrifugation terminée, décanter et éliminer le surnageant. Passez à l’étape 5.

5. homogénéisation et Gradient de densité de saccharose

  1. Après l’étape 3 ou 4, resuspendre le culot à l’aide de 3 mL de tampon saccharose faible. Agiter doucement pour enlever le culot du mur pour faciliter la remise en suspension. Laisser l’échantillon s’asseoir sur la glace pendant 2 min et transférer la suspension dans un tube à Oak Ridge.
  2. À l’aide de l’homogénéisateur à réglage 1, homogénéiser les noyaux dans un tampon saccharose faible pour 15 à 30 s, garder l’échantillon sur la glace.
    Remarque : Utiliser 15 s si vous utilisez une moelle épinière lombaire ou 30 s si vous utilisez en commun échantillons ou toute la moelle épinière.
  3. À l’aide d’une pipette sérologique, couche 12,5 mL de tampon saccharose densité sous l’homogénat de tampon saccharose faible, prenant soin de ne pas pour créer une bulle qui perturbe les couches de densité.
  4. Centrifuger les tubes à 3 200 x g pendant 20 min à 4 ° C.
  5. Une fois la centrifugation terminée, immédiatement éliminer le surnageant dans un mouvement pichenette.
    Remarque : Un volume résiduel (moins de 400 mL) de tampon saccharose peut être ignoré si vous le souhaitez afin de produire un volume plus faible et le nettoyeur de l’échantillon final, mais ce volume résiduel contient-il des noyaux et peut être conservé pour maximiser le rendement de noyaux.
  6. À l’aide de 100 mL - 1 mL de solution de resuspension, remettre en suspension les noyaux restant sur le mur. Éviter la myéline « froncement de sourcils » qui reste avec la préparation à base de détergent.
  7. Filtrer les noyaux à travers un tamis de pores de 30 à 35 mm et de recueillir dans un tube préalablement réfrigéré.
  8. Déterminer les noyaux donnent à l’aide d’un hémocytomètre pour compter des noyaux sous un objectif 10 X.
    Remarque : Le bleu Trypan peut être ajouté pour visualiser les noyaux, qui devraient apparaître en bleus. Noter la quantité de débris cellulaires.
  9. Passez à l’étape 6 ou 7.

6. massivement parallèle snRNA-séquençage : plate-forme académique7

  1. Effectuer le séquençage massivement parallèle snRNA (p. ex., Drop-Seq) méthode décrite précédemment7 avec les modifications suivantes :4
    1. Ajuster les noyaux à une concentration finale de 225 noyaux par mL.
    2. Préparer les perles avec code à barres à une concentration de 250 perles / mL.
    3. Préparer le tampon de lyse sarkosyl 0,7 %.
    4. Ajuster les débits à 35 mL / min pour les perles, 35 mL / min pour les noyaux et 200 mL / min pour le pétrole.

7. massivement parallèle snRNA-séquençage : plate-forme commerciale26

  1. Effectuer la snRNA-séquençage massivement parallèle à l’aide de la plateforme commerciale (p. ex., Solution de chrome unique cellule Gene Expression) des produits selon instructions26 avec la modification suivante les directives du fabricant :
    1. Après transcription inverse, ajouter un cycle supplémentaire de la PCR pour le nombre de cycles d’amplification de l’ADNc basé sur la récupération de cellules ciblées afin de compenser une diminution ADNc des noyaux par rapport aux cellules.

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Representative Results

Ici, nous avons réalisé isolement des noyaux de la moelle lombaire de souris adultes en aval séquençage massivement parallèle de RNA. Le protocole implique trois éléments principaux : tissu perturbation et cellulaire lyse, homogénéisation et saccharose densité par centrifugation (Figure 1). Dans les secondes, la lyse de détergent-mécanique a donné une préparation de noyaux bruts avec un grand nombre de noyaux ainsi que des débris cellulaires et tissulaires (Figure 2 atableau 2). Après quinze minutes, la lyse hypotonique-mécanique a donné une préparation de noyaux bruts qui avait moins de débris, mais aussi moins noyaux (Figure 2 btableau 2). Les deux préparations a subi une homogénéisation (Figure 2 et D) et centrifugation en gradient de densité de sucrose avant remise en suspension dans du PBS avec 0,04 % de BSA (Figure 2E et F). En moyenne, une souris la moelle épinière lombaire (325,5 mg mg 63,9 ± erreur-type de la moyenne, SEM, N = 4) a produit 5.1 x 105 noyaux (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) suite à la lyse de détergent-mécanique et 2,0 x 105 noyaux (± 5,9 x 10-4 SEM, N = 3) suite à la lyse hypotonique-mécanique. On estimait le nombre de noyaux dans la moelle épinière lombaire de la préparation brute initiale après homogénéisation Dounce dans le protocole de détergent-mechanical lyse (2,6 x 106 noyaux ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, tableau 2). L’échantillon final du protocole lyse détergent-mécanique se compose de 20 % des noyaux initiaux (± 2 % SEM, N = 3, tableau 2). La préparation des noyaux bruts de la lyse hypotonique-mécanique après trituration contient 62 % des noyaux initiaux (± 2 % SEM, N = 3, tableau 2). L’échantillon final lyse hypotonique-mécanique ne contient que 8 % des noyaux initiaux (SEM de ± 1 %, N = 3, tableau 2). On n’a pas détecté de différence dans le rendement total de RNA ou le rendement d’ADNc pour un gène de ménage (Gapdh) entre les méthodes de préparation de deux. À l’aide de qPCR, la méthode détergente donné 463,7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) de l’ARN total et un cycle moyen de détection du seuil de 25,2 (± 1,3 SEM) pour Gapdh ADNc par qPCR et la méthode hypotonique a donné 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) de l’ARN total et un seuil de détection moyen cycle de 26,1 pour ADNc Gapdh (± 0,8 SEM). Les deux options de lyse les isoler des noyaux des tissus difficiles à dissocier et fournissent le matériel de haute qualité pour le séquençage de RNA single-noyau en aval.

Compte tenu de la taille des canaux microfluidiques pour plateformes de séquençage massivement parallèle seul noyau en aval, il est essentiel de saisir une suspension de noyaux dépourvue de grosses particules ou débris cellulaires pour éviter tout colmatage. Suite au protocole présenté ici, il n’y a aucun cas de colmatage sur la plate-forme adaptée de Macosko et al. 2015 (N = 17) et une obstruction partielle sur la plate-forme commerciale (N = 16).

Les procédures de détergent-mécanique et hypotonique-mécanique ont permis d’isoler des noyaux avec succès pour les deux plates-formes d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle et résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 3. Deux de ces approches activé profilage transcriptionnel des milliers de noyaux et la classification des types de cellules dans la moelle lombaire souris adulte (Figure 3). 4 ces approches a donné lieu à des gènes comparables par noyau pour chaque type de cellule (Figure 3 et D). Les taux de récupération des noyaux d’entrée entre les deux plates-formes diffèrent. La plate-forme adaptée de Macosko et coll. 2015 avec les modifications d’Eric et al. 2018 récupéré environ 0,59 % des noyaux (± 0,05 % SEM, N = 17), tandis que la plate-forme commerciale récupéré un noyaux estimée de 53,7 % (N = 2).

Ce protocole enrichit légèrement pour les noyaux neuronaux dans la préparation finale. Dans des sections de tissu de la moelle épinière lombaire, nous avons constaté que 27 % des noyaux étaient positifs pour les marqueurs neuronaux NeuN (N = 7 368 noyaux de 2 animaux), préparation des noyaux de détergent-mécanique de la moelle épinière lombaire a donné lieu à 31,9 % des noyaux totales exprimant NeuN, tel que déterminé par un tri cellulaire activés par fluorescence (FACS, ± SEM de 2,0 %, N = 13 préparations de noyaux indépendante en utilisant des échantillons de plusieurs animaux dans chaque préparation, Figure 4). Ceci est similaire à ce qui a été observé précédemment pour le pourcentage des noyaux NeuN-positif dans l’ensemble de la moelle épinière (20 % à 24 % selon l’âge),27 , y compris les régions cervicales et thoraciques qui ont plus de substance blanche et oligodendrocytes. Noter, NeuN/Rbfox3 n’est pas exprimée dans tous les neurones et, par conséquent, ces chiffres sont probables sous-estimés modestes. Il est possible que des cellules non neuronales plus petites sont légèrement appauvries au cours de la purification de gradient de saccharose. En outre, les paramètres de filtrage et l’analyse en aval après séquençage peuvent modifier la répartition de type cellulaire finale parce que les neurones ont plus de gènes par noyau (Figure 3 et D) et, par conséquent, sont moins susceptibles d’être enlevés pendant le processus de filtrage.

Il y a plusieurs étapes clés dans le présent protocole qui ont besoin de soins. Douncing tout d’abord, excessive ou trituration (dans les étapes 3 ou 4, respectivement) peut conduire à une augmentation de la formation de particules et de débris cellulaire. Bien que la filtration et centrifugation de densité de saccharose peuvent séparer les grosses particules, une fois que les petites particules sont générés lors de la lyse cellulaire, ils sont difficiles à enlever. Deuxièmement, au cours de l’homogénéisation, ne placez pas l’homogénéisateur directement sur le fond du tube Oak Ridge. Au lieu de cela, plonger l’extrémité de l’homogénéisateur dans la solution de saccharose faible contenant des noyaux remises en suspension, sans toucher le fond du tube. Homogénéisation améliore l’isolement nucléaire en enlevant les débris cellulaires et en réduisant les touffes et multiplets (Figure 5). Après centrifugation de densité de saccharose, il est essentiel de retirer immédiatement le tube Oak Ridge de la centrifugeuse et rapidement éliminer le surnageant dans un mouvement rapid « pichenette ». Quand resuspendant les noyaux de la paroi de la trompe d’Oak Ridge, resuspendre le culot « salé » d’à mi-chemin entre la bande de la myéline et le fond du tube. Notez que le culot n’est peut-être pas visible. Resuspendant noyaux plus élevés le long du tube peut entraîner une contamination de la myéline dans la préparation de noyaux. La lyse cellulaire et les étapes de centrifugation saccharose densité sont les plus critiques à la réduction des particules qui pourraient obstruer les canaux microfluidiques pour application en aval.

Nom de matériel / équipement Concentration de stock Concentration finale Volume / montant
Tampon de lyse détergent
Mémoire tampon saccharose faible - - 600 ΜL
Triton-X 20 % 0,10 % 3 ΜL
Tampon de lyse hypotonique
Tris-HCl (pH = 7,4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0,01 % 1 ΜL
Eau exempte de nucléase jusqu'à 10 mL
HEB Medium
Mise en veille prolongée-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Mémoire tampon saccharose faible
Saccharose - 0,32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8,0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM ΜL 125
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0. 5 M 0,1 mM 5 ΜL
TNT 1 M 1 mM 25 ΜL
Eau exempte de nucléase jusqu'à 25 mL
Tampon de densité de saccharose
Saccharose - 1 M 8,6 g
HEPES (pH = 8,0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
TNT 1 M 1 mM 25 ΜL
Eau exempte de nucléase jusqu'à 25 mL
Solution de la remise en suspension
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
Inhibiteur de RNAse 40 U/ΜL 0.2 U/ΜL 5 ΜL

Tableau 1 : Tableau des Solutions.

Pétrole brut Homogénéisé Finale
Détergent-mécanique 100 ± 15 % 87 ± 9 % 20 ± 2 %
Hypotonique-mécanique 62 ± 12 % 35 ± 4 % 8 ± 1 %

Tableau 2 : rendement des noyaux à chaque étape du protocole. Le nombre de noyaux dans la préparation brute initiale après homogénéisation dounce dans le protocole de détergent-mechanical lyse a servi à estimer le nombre de noyaux dans la moelle lombaire. Le noyau initial de rendement (2,6 x 106 noyaux ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) a été utilisée pour calculer les noyaux donnent à chaque étape en aval des deux protocoles de lyse de détergent et hypotonique-mécanique. Le nombre de noyaux isolés par la préparation mécanique hypotonique a été normalisé au noyau initial estimé. Les valeurs dans le tableau sont moyenne ± SEM, N = 3.

Figure 1
Figure 1 : schéma de l’isolement nucléaire. Les noyaux de la moelle épinière adulte peuvent être isolés à l’aide de la lyse des cellules détergent-mécanique ou hypotonique-mécanique, suivie de l’homogénéisation et centrifugation en gradient de densité de sucrose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fond clair représentant et noyaux colorés au DAPI à clé les étapes dans le protocole.  Noyaux bruts (A, B), suite à la lyse hypotonique-mécanique ou de détergent-mécanique. (C, D) Après homogénéisation des noyaux. (E, F) Noyaux remis en suspension dans du PBS avec 0,04 % de BSA après centrifugation de densité de saccharose. Les noyaux ont été fixés à 2 % de paraformaldéhyde et souillé par la suite en utilisant le bleu Trypan ou DAPI. Des images ont été prises à 10 X (barre d’échelle = 100 µm) en utilisant le fond clair et épifluorescente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : parcelle tSNE représentant des noyaux séquencés : à l’aide de lyse hypotonique mécanique et détergent-mechanical. (A) résultats de séquençage plus 17 000 noyaux la souris adulte disséqué la moelle épinière lombaire suite à la lyse de détergent-mécanique et en fonction des Macosko al 2015 sous réserve de modifications d’Eric et al. 2018. ce chiffre a été modifié avec la permission d’Eric et al. 2018.4 (B) résultats obtenus à partir des noyaux 5 000 de séquençage de l’éjecté adulte moelle lombaire suite à la lyse hypotonique-mécanique ainsi qu’une plate-forme d’encapsulation unicellulaire microfluidic commerciale. 26  (C, D) gènes moyenne par résultats de noyau après regroupement des types de cellules principales chez la souris adulte moelle épinière ± SEM À noter, la procédure de détergent-mechanical lyse suivie de Macosko et al. plate-forme de 2015 a été réalisé à l’aide de la moelle épinière lombaire disséquée, tandis que la lyse hypotonique-mécanique suivie de la plate-forme commerciale s’est déroulée à l’aide d’éjecté de la moelle épinière lombaire (comme décrit dans le présent protocole). Étant donné que l’éjection du cordon supprime la dure-mère et les ganglions de la racine dorsale, l’amas de cellules méningée/Schwann est absent de la Figure 3 b et D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : terrain de FACS de noyaux NeuN+ suite à la lyse de détergent-mechanical. Diagrammes de FACS montrant fixes noyaux colorés pour NeuN (moyenne de 31,9 % des noyaux total ± SEM de 2,0 %, N = 13), isolé en utilisant le protocole de détergent-mechanical lyse. Pour la fixation immédiate, noyaux pour la validation de FACS, une préparation de noyaux bruts a été obtenue par dounce homogénéisation des moelles épinières en utilisant la préparation détergent-mécanique, suivie de la fixation immédiate avec 1 % PFA avec une période d’incubation de 5 min. Fixation a été trempée avec glycine de 250 mM, et les noyaux ont été recueillis. Coloration avec anticorps anti-NeuN a été réalisée en solution. FACS se faisait sur fixe, noyaux de NeuN teinté à l’aide d’un trieur de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : préparation de noyaux sans homogénéisation. Les noyaux ont été remises en suspension avant la centrifugation de densité de saccharose suite A détergent-mécanique ou B la lyse hypotonique-mécanique, sans homogénéisation. * Dénote les débris cellulaires attaché à noyaux (A) et un multiplet de noyaux attaché par des débris cellulaires (B). Noyaux remis en suspension dans du PBS avec 0,04 % de BSA après centrifugation de densité de saccharose. Les noyaux ont été fixés à 2 % de paraformaldéhyde et souillé par la suite en utilisant le bleu Trypan ou DAPI. Des images ont été prises à 10 X (échelle bar 100 µm) en utilisant le fond clair et épifluorescente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le but ultime de ce protocole est d’isoler les noyaux contenant ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptionnelle en aval. Nous avons adapté le snRNA-Seq méthodes afin de profil de tous les types de cellules dans la moelle épinière. Au départ, nous avons constaté que les méthodes de dissociation cellulaire typique étaient inefficaces de séquençage d’unicellulaire RNA, comme les neurones de la moelle épinière sont particulièrement vulnérables à la mort cellulaire. En outre, méthodes de dissociation cellulaire induisent l’expression de gènes de diverses activités - et réponse au stress par jusqu'à plusieurs centuple. 3 , 4 , 16 étant donné les inconvénients liés à des préparations de cellules du même, nous et autres avons utilisé noyaux comme alternative. 16 , 17 , 18 , 24 cette méthode peut aussi servir sur les tissus humains, y compris le tissu médullaire congelés. 4 , 19 , 24 ici, nous allons décrire les forces et les limites de cette approche.

Points forts de cette méthode incluent l’évitement des IEG expérimentalement induite, ainsi que la possibilité d’utiliser des tissus frais et surgelés. 4 par conséquent, cette approche peut être utile pour sonder des IEG endogènes suite à un comportement ou un stimulus. 1 , 3 , 4 l’un des avantages de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas d’appareils spécialisés pour une utilisation de noyaux pour le séquençage massivement parallèle seul noyau, mais peut utiliser la plateforme développée par des Macosko et coll. 2015, avec des ajustements mineurs de taux de tampon et flux de lyse ou systèmes d’utilisation des disponibles dans le commerce. De plus, le séquençage seul noyau s’avère une méthode comparable à celle du séquençage de cellule unique pour l’identification des types de cellules, prêts à la force de cette approche. 28 , 29 Toutefois, il existe plusieurs limitations importantes de cette approche. Les noyaux contiennent environ 20 à 50 % de l’ARNm cellulaire,29 et cela se reflète dans un nombre réduit de transcriptions par noyau par rapport au séquençage de cellule unique. 18 , 29 y compris intronic lectures depuis snRNA-Seq sont une façon d’augmenter le nombre de gènes détectés.

Il existe plusieurs protocoles disponibles qui permettent l’isolement des noyaux du tissu. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 par rapport à la plupart des autres méthodes, les protocoles présentés ici ne nécessitent pas suppression de la myéline, ultracentrifugation, ou plusieurs étapes de centrifugation ou lavages qui peuvent conduire à faire pour baisser les chiffres définitifs des noyaux. En outre, ce protocole prend 45 min (détergent-mécanique) ou 1 heure (hypotonique-mécanique) pour terminer. Commerciales protocoles pris en charge sur les plateformes microfluidiques sont plus que doubler le temps et nécessitent de nombreuses étapes de centrifugation plus, augmentant le risque de perdre des noyaux. Contrairement aux protocoles d’isolement de noyaux qui impliquent uniquement la lyse et filtrage, les méthodes présentées ici comprennent un gradient de saccharose pour augmenter la pureté du noyau final. Cette étape est requise pour les tissus adultes de la moelle épinière en raison de la forte proportion de substance blanche et les débris résultant de la myéline.

Le protocole de détergent-mechanical lyse peut être utilisé pour la dissociation complète de tissus et de la lyse et le protocole de lyse hypotonique-mécanique peut être utilisé pour contrôler la quantité de débris a permis l’application en aval de la dissociation et cellulaire tissulaires. Ces protocoles peuvent être utilisés pour le matériel bio-Banque, difficile de dissocier les tissus et pour l’étude des changements transcriptionnelles dépendant de l’activité par le biais de l’isolement des noyaux pour aval snRNA massivement parallèle-suiv. Outre le séquençage massivement parallèle seul noyau RNA, ce protocole peut être utilisé pour isoler les noyaux pour applications alternatives, y compris l’immunofluorescence et FACS et épigénétique analyse tels que les études de méthylation de l’ADN et ChIP-Seq (Figure 4 ). 23

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Disclosures

Nous n’avons aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le programme intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) et NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Nous remercions L. Li et C.I. Dobrott pour leur soutien technique et des discussions utiles et Kathe C. pour l’examen du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

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References

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Tags

Neurosciences numéro 140 noyaux RNA séquençage snRNA-Seq massivement parallèle la moelle épinière gradient de saccharose

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau
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Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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