Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å raskt isolere høykvalitets kjerner fra friske eller frosne vev for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Vi inkluderer vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske vev avbrudd og celle lysis alternativer, begge kan brukes for isolering av kjerner.

Abstract

Undersøkelser en enkeltcelle genuttrykk aktiverer identifisering av celle type og celle tilstand. Encellede RNA sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy for å studere transcriptional profiler av celler, spesielt i heterogen vev som sentralnervesystemet. Dissosiasjon metoder for enkeltcelle sekvensering kan imidlertid føre til eksperimentelle endringer i gene expression og celle død. Videre er disse metodene vanligvis begrenset til friske vevet, dermed begrense studier på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, gitt at det nøyaktig identifiserer celletyper, tillater studiet av vev som frosne eller vanskelig å oppheve tilknytningen, og reduserer dissosiasjon-indusert transkripsjon. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming protokoll for rask isolering av kjerner for nedstrøms snRNA-Seq. Denne metoden gjør at isolering av kjerner fra friske eller frosne ryggmargen prøver og kan kombineres med to massivt parallelle slippverktøy innkapsling plattformer.

Introduction

Nervesystemet består av heterogene grupper av celler som viser et variert utvalg av morfologiske, biokjemiske og elektrofysiologiske. Mens den bulk RNA sekvensering har vært nyttig for å bestemme vev-omfattende endringer i genuttrykk under ulike forhold, utelukker det gjenkjenning av transcriptional endringer på encellede nivå. Nylige fremskritt innen én celle transcriptional analysen har aktivert klassifiseringen av heterogene celler i funksjonelle grupper basert på repertoaret molekylære og kan selv bli leveraged for å oppdage sett med nevroner som hadde vært nylig aktiv. 1 , 2 , 3 , 4 de siste ti årene, utviklingen av enkeltcelle RNA sekvensering (scRNA-Seq) har aktivert studiet av genuttrykk i enkeltceller gir en oversikt over celle-type mangfold. 5

Fremveksten av skalerbare tilnærminger som massivt parallell scRNA-Seq, har gitt plattformer sekvens heterogen vev, inkludert mange områder av det sentrale nervesystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkeltcelle dissosiasjon metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle endringer i genuttrykk. 16 nyere arbeid er tilpasset enkeltcelle sekvensering metoder for å aktivere bevaring av endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategiene er spesielt egnet for å avdekke umiddelbar tidlig (IEG) genuttrykk etter sensoriske stimulans eller atferd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategien kan også brukes til å studere dynamiske endringer i vev i sykdomstilstander eller som svar på stress. Disse metodene enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er en lovende metode som ikke involverer stress-inducing celle dissosiasjon og kan brukes på vanskelig å distansere vev (som ryggmargen), samt frosne vev. 4 , 17 , 18 , 19 tilpasset fra atomkjerner isolasjon metodene,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligvis benytter rask vev avbrudd og celle lysis under kalde forhold, sentrifugering og separasjon av kjerner fra mobilnettet rusk. 4 kjerner kan være isolert for den nedstrøms neste generasjons sekvensering på flere microfluidic slippverktøy innkapsling plattformer. 4 , 7 , 24 , 25 denne metoden gir et øyeblikksbilde av transcriptional aktivitet av celler på et tidspunkt.

Det er flere strategier for å slippe kjerner fra celler før isolasjon og sekvensering, hver med sine egne fordeler og ulemper. Her beskriver vi og sammenligne to protokoller for å aktivere isolering av kjerner fra voksen ryggmargen for den nedstrøms massivt parallelle snRNA-Seq: vaskemiddel mekaniske lyse og hypotonisk mekaniske lysis. Vaskemiddel mekaniske lysis gir komplett vev avbrudd og en høyere siste avkastning av kjerner. Hypotonisk mekanisk-lysis inkluderer en kontrollerbar grad av vev avbrudd, gir en mulighet for å velge en balanse mellom antallet og renhet av den endelige kjernefysiske Sprengkraften. Disse gir sammenlignbare RNA avkastning, oppdaget antall gener per kjerne og celle-type profilering og også begge kan brukes med hell for snRNA-Seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til en protokoll som er godkjent av National Institute av nevrologiske lidelser og hjerneslag Animal Care og bruk komiteen. Balansert prøver av mannlige og kvinnelige ICR/CD-1 vill-type mus, mellom 8 og 12 uker gamle, ble brukt til alle eksperimentene. Mus skal håndteres i henhold til lokale institusjonelle Animal Care og bruk komiteen retningslinjer.

1. forberedelse av materialer og buffere

  1. Forberede alle buffere dagen bruk og pre chill på is (se tabell 1).
    1. Hvis bruker vaskemiddel mekaniske lysis, forberede vaskemiddel lyseringsbuffer (> 500 μL per prøve), lav sukrose buffer (> 6 mL per prøve), sukrose tetthet buffer (> 12.5 mL per prøve) og rørets løsningen (> 1 mL).
    2. Hvis bruker hypotonisk mekaniske lysis, forberede hypotonisk lyseringsbuffer (> 5 mL per prøve), HEB medium (> 5 mL per prøve), lav sukrose buffer (> 3 mL per prøve), sukrose tetthet buffer (> 12.5 mL per prøve), og rørets løsningen (> 1 mL).
    3. Legg til 25 μL dithiothreitol (DTT) 25 mL av lav sukrose bufferen og en annen 25 μL DTT til 25 mL av sukrose tetthet gradert bufferen like før protokollen.
  2. Dekk dissecting overflaten med aluminiumsfolie for å redusere forurensning av prøven med fiber fra papirhåndklær eller benken beskyttere, som kan tette microfluidic kanaler som brukes for å fange enkelt kjerner.
  3. Spray dissecting verktøy og benk med en RNase dekontaminering løsning. I tillegg spray innsiden av den Dounce homogenizer tube (hvis vaskemiddel mekaniske celle lysis) og Oak Ridge rør med en RNase dekontaminering løsning. Skyll ut Dounce og Oak Ridge røret med ultrapure, RNase-gratis vann.
  4. Pre chill alle samling rør (50 mL koniske, Oak Ridge) og Dounce homogenizer rør på is.
  5. Brann polsk en rekke Pasteur Pipetter (hvis hypotonisk mekaniske celle lysis).

2. forberedelse i ryggmargen

  1. Hvis bruker ferskt vev, euthanize musen ved CO2 innånding. Etter dødshjelp, spray pelsen av musen med 70% etanol å minimere hår forurensning i utvalget.
  2. Halshugge musen med skarpe, RNase-fri kirurgisk saks. Deretter forsiktig løfte abdominal huden med tang og gjøre et snitt langs kroppen å avsløre de indre organene.
  3. Eviscerate musen ved å trekke de indre organene fra kroppens hulrom ved hjelp av pinsett. Ikke bruk papirhåndklær å rense området eller fjerne organer dette kan innføre forurensninger. Med saks, kuttet virvelsøylen mellom L2 og L3 spinal ryggvirvlene.
    Merk: Med praksis, dette trinnet kan oppnås på mindre enn 30 sekunder.
    1. Ut ryggmargen, passe en 3 mL sprøyte med iskald PBS en 25 G ¼ tomme nål. Plass tuppen av nålen i sakral slutten av virvelsøylen. Bruke to fingre for å klype ryggvirvlene å opprette en tett forsegling rundt spissen av nålen og trykk ned stempelet å mate ryggmargen rostrally. Plass ryggmargen i en Petriskål med iskald PBS.
    2. På dette punktet, fryse vevet og lagre-80 ° c eller bruke umiddelbart for vaskemiddel mekaniske (trinn 3) eller hypotonisk-mekanisk (trinn 4) lyse.
  4. Hvis bruker frossent, opprettholde vev på tørris, fortsette til vaskemiddel-mekanisk (trinn 3) eller hypotonisk-mekanisk (trinn 4) lyse.

3. vaskemiddel mekaniske celle Lysis

  1. Plasser lumbale ryggmargen i en pre kjølt Dounce homogenizer og legge til 500 mL pre kjølt vaskemiddel lyseringsbuffer.
    Merk: En mus lumbale ryggmargen er 325.5 mg ± 63.9 mg standardfeil av gjsnitt (SEM, N = 4). 50 mg-1,5 g av vev kan brukes.
  2. Dounce med 5 strøk av pistil en ("løs" støter), deretter 5-10 slag av pistil B ('tett' pistil). Unngå løfte homogenizer ut av lysis løsningen mellom slag og unngå introdusere bobler.
  3. Plass en 40 mm sil over en pre kjølt 50 mL konisk rør og prewet med 1 mL av lav sukrose buffer.
  4. Legg 1 mL av lav sukrose buffer til Dounce homogenizer som inneholder olje kjerner i lyseringsbuffer og bland forsiktig av pipettering 2 – 3 ganger.
  5. Passere det råolje kjerner prep over 40 mm silen inn i pre kjølt 50 mL konisk røret.
  6. Sende en ekstra 1 mL lav sukrose buffer over 40 mm silen, bringe det siste bindet til 3 mL av lav sukrose bufferen og 500 mL lyseringsbuffer.
  7. Gjenta trinn 3.1-3.6 Hvis kombinere flere ledninger, pooling i samme konisk rør.
  8. Sentrifuge prøven 3200 x g i 10 min på 4 ° C. Når sentrifugering er fullført, Dekanter nedbryting. Fortsett med trinn 5.

4. hypotonisk-mekanisk celle Lysis

  1. Plass lumbale ryggmargen i 5 mL av hypotonisk lyseringsbuffer i vev kultur parabol. Bruk sløv slutten av våren saks å halvere ryggmargen, og bruke vår saks til å klippe ledningen i 3-4 mm biter, men ikke hakke.
    Merk: 50 mg-1,5 g av vev kan bli brukt.
  2. Ruge på isen i 15 min, virvlende 2 – 3 ganger.
  3. Legge til 5 mL av HEB medium å fortynne hypotonisk lyseringsbuffer.
  4. Triturate vev 10 ganger med en 5 mL serologisk pipette, eller til alle bitene av vev gå greit gjennom åpningen av pipette.
  5. Triturate med en rekke tre brann-polert Pasteur Pipetter med gradvis smalere diameter (~ 900-600 mm).
    1. For hver pipette, triturate 5 - 15 ganger, tillate vev å bosette, fjerne 1-2 mL av nedbryting som inneholder dissosiert kjerner og passere over en 40 mm sil i et pre kjølt 50 mL konisk rør.
    2. Etter føden med den minste størrelse Pasteur pipette, sikre at homogenate flyter jevnt gjennom pipette spissen. Pass den gjenværende løsningen over 40 mm silen i 50 mL konisk røret.
      Merk: Antall triturations kan justeres som ønsket. Meninges i ryggmargen musen vil forbli, men det er viktig å triturate noen synlig biter av ryggmargen. Passere de gjenværende homogenate over 40 m silen. Unngå å innføre bobler under føden.
  6. Sentrifuge filtrerte prøven 1000 x g i 10 min på 4 ° C. Når sentrifugering er fullført, Dekanter og kast nedbryting. Fortsett med trinn 5.

5. homogenisering og sukrose tetthet gradert

  1. Etter trinn 3 eller 4, resuspend pellets med 3 mL lav sukrose buffer. Forsiktig virvel for å fjerne pellet fra veggen for å lette rørets. La prøven sitte på isen i 2 minutter og overføre suspensjon til en Oak Ridge rør.
  2. Bruke homogenizer på innstillingen 1, homogenize kjerner i lav sukrose buffer for 15 – 30 s, holde prøven på is.
    Merk: Bruk 15 s Hvis bruker en lumbale ryggmargen eller 30 s Hvis bruker samlet prøver eller en hel ryggmargen.
  3. Bruker en serologisk pipette, lag 12.5 mL tetthet sukrose buffer under lav sukrose buffer homogenate, ta vare ikke for å opprette en boble som forstyrrer tetthet lagene.
  4. Sentrifuge rør 3200 x g for 20 min på 4 ° C.
  5. Når sentrifugering er fullført, umiddelbart Dekanter nedbryting i flicking bevegelse.
    Merk: Et gjenværende volum (mindre enn 400 mL) sukrose bufferen kan forkastes hvis du ønsker å produsere en lavere volum og renere siste prøve, men denne residualvolum inneholder kjerner og kan bevares for å maksimere kjerner avkastning.
  6. Bruker 100 mL - 1 mL av rørets løsning, resuspend kjerner på veggen. Unngå myelin 'rynke' som forblir med vaskemiddel-baserte utarbeidelse.
  7. Filtrere kjerner gjennom en 30 – 35 mm pore-størrelse sil og samle i et pre kjølt rør.
  8. Bestemme kjerner gir bruker en hemocytometer telle kjerner under et 10 X mål.
    Merk: Trypan blå kan legges til visualisere kjerner, som skal vises i blått. Merk mengden av mobilnettet rusk.
  9. Gå videre til trinn 6 eller 7.

6. massivt parallell snRNA-sekvensering: akademiske plattform7

  1. Utføre den massivt parallelle snRNA sekvensering (f.eksDrop-Seq) metode som tidligere beskrevet7 med følgende modifikasjoner:4
    1. Justere kjerner til en siste konsentrasjon av 225 kjerner per mL.
    2. Forberede barcoded perler i en konsentrasjon av 250 perler per mL.
    3. Forberede lyseringsbuffer med 0,7% sarkosyl.
    4. Justere strømningshastigheter til 35 mL per min for perler, 35 mL per min for kjerner og 200 mL per min for olje.

7. massivt parallell snRNA-sekvensering: kommersiell plattform26

  1. Utføre massivt parallelle snRNA-sekvenser ved hjelp av reklamen plattformen (f.ekskrom enkelt celle Gene Expression løsning) produkter i henhold til produsentens instruksjoner26 følgende endringen:
    1. Etter omvendt-transkripsjon, legge til en ekstra PCR syklus beregnet antall sykluser for cDNA forsterkning basert på målrettet celle utvinning å kompensere for redusert cDNA fra kjerner i forhold til celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her utført vi isolering av kjerner fra voksen mus lumbale ryggmargen for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Protokollen involvert tre hovedkomponenter: vev avbrudd og cellular lyse og homogenisering sukrose tetthet sentrifugering (figur 1). Innen sekunder gitt vaskemiddel mekaniske lysis en grov kjerner forberedelse med et stort antall atomkjerner samt mobilnettet og vev rusk (figur 2Atabell 2). Etter femten minutter gitt hypotonisk mekaniske lysis en grov kjerner forberedelse som hadde mindre avfall, men også færre kjerner (figur 2Btabell 2). Begge forberedelser gjennomgikk homogenisering (figur 2C og D) og sukrose tetthet gradert sentrifugering før rørets i PBS med 0,04% BSA (figur 2E og F). En gjennomsnittlig, en mus lumbale ryggmarg (325.5 mg ± 63.9 mg standardfeil av gjsnitt, SEM, N = 4) gitt 5.1 x 105 kjerner (± 6.3 x 104 SEM, N = 3) følge vaskemiddel mekaniske lyse og 2.0 x 105 kjerner (± 5.9 x 104 SEM, N = 3) følge hypotonisk mekaniske lysis. Antall kjerner i lumbal ryggmargen ble beregnet fra første råolje forberedelse etter Dounce homogenisering i vaskemiddel mekaniske lysis protokollen (2.6 x 106 kjerner ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, tabell 2). Siste utvalget fra vaskemiddel mekaniske lysis protokollen består av 20% av første kjerner (± 2% SEM, N = 3, tabell 2). Råolje kjerner utarbeidelse fra hypotonisk-mekanisk lysis etter føden inneholder 62% av første kjerner (± 2% SEM, N = 3, tabell 2). Siste hypotonisk mekaniske lysis prøven behersker bare 8% av første kjerner (± 1% SEM, N = 3, tabell 2). Vi gjorde ikke merker noen forskjell i den totale RNA avkastningen eller cDNA avkastningen for en husholdning genet (Gapdh) mellom to forberedelse metodene. Bruker qPCR, vaskemiddel metoden gitt 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) av totale RNA og en gjennomsnittlig oppdagelsen terskelen syklus av 25.2 (± 1.3 SEM) for Gapdh cDNA av qPCR og hypotonisk metoden gitt 419.2 ng (± 85.3 SEM, N = 6) av totale RNA og en gjennomsnittlig oppdagelsen terskel syklus av 26,1 for Gapdh cDNA (± 0,8 SEM). Alternativene for to lyse både isolere kjerner fra vanskelig å distansere vev og gir høy kvalitet materiale for den nedstrøms single-kjerne RNA sekvensering.

Gitt størrelsen på microfluidic kanaler for nedstrøms massivt parallelle enkelt kjernen sekvensering plattformer, er det avgjørende å input en kjerner suspensjon store partikler eller mobilnettet rusk å hindre tilstopping. Etter protokollen presenteres her, var det ingen forekomster av tilstopping av plattformen tilpasset fra Macosko et al. 2015 (N = 17) og en delvis tette på kommersielle plattformen (N = 16).

Vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske prosedyrene ble brukt til å isolere kjerner vellykket for to massivt parallelle slippverktøy innkapsling plattformer og representant resultater er vist i Figur 3. Begge disse metodene aktivert transcriptional profilering av kjerner, og klassifisering celletyper i voksen mus lumbale ryggmargen (Figur 3). 4 disse tilnærmingene resulterte i sammenlignbare gener per kjerne for hver celle type (Figur 3 c og D). Satsene for utvinning av input kjerner mellom de to plattformene er forskjellige. Plattformen tilpasset fra Macosko et al. 2015 med endringer fra Sathyamurthy et al. 2018 gjenopprettet anslagsvis 0,59% av kjerner (± 0,05% SEM, N = 17), mens reklamen plattformen gjenopprettet en estimert 53.7% kjerner (N = 2).

Denne protokollen beriker litt for neuronal atomkjerner i servering. I lumbal ryggmargen vev deler, fant vi at 27% av kjerner var positivt for neuronal markøren NeuN (N = 7,368 kjerner fra 2 dyr), mens vaskemiddel mekaniske kjerner utarbeidelse av lumbale ryggmargen resulterte i 31,9% av totale kjerner uttrykke NeuN, etter fluorescens-aktivert celle sortering (FACS, ± 2.0% SEM, N = 13 uavhengig kjerner forberedelser med grupperte eksempler fra flere dyr hver forberedelse, Figur 4). Dette ligner på hva har observert tidligere prosent av NeuN-positive kjerner i hele ryggmargen (20 til 24% avhengig av alder),27 inkludert cervical og thoracic regionene som har flere hvit substans og oligodendrocytes. Av notatet, NeuN/Rbfox3 er uttrykt ikke i alle neurons og følgelig disse tallene er sannsynligvis beskjedne undervurderer. Det er mulig at mindre ikke-neuronal celler er litt utarmet under sukrose gradient rensing. I tillegg nedstrøms oljefiltrering og analysering iht parametere følge sekvensering kan endre siste celle-type distribusjon fordi neurons har flere gener per kjerne (Figur 3 c og D), og derfor er mindre sannsynlig å bli fjernet under filtreringsprosessen.

Det er flere viktige skritt i denne protokollen som krever omsorg. Første, overdreven douncing eller føden (i trinn 3 eller 4, henholdsvis) kan føre til en økning i mobilnettet rusk og partikkel-formasjonen. Selv om filtrering og sukrose tetthet sentrifugering kan skille store partikler, når små partikler genereres under cellular lysis, er de vanskelig å fjerne. Dernest i løpet homogenisering ikke plass homogenizer direkte på bunnen av Oak Ridge røret. I stedet senke slutten av homogenizer i lav sucrose løsning som inneholder resuspended kjerner, uten å berøre bunnen av røret. Homogenisering forbedrer kjernefysiske isolasjon ved å fjerne mobilnettet rusk og redusere klumper og multiplets (figur 5). Etter sukrose tetthet sentrifugering er det avgjørende å umiddelbart fjerne Oak Ridge røret fra sentrifuge, og raskt Dekanter nedbryting i en rask 'flicking' bevegelse. Når resuspending kjerner fra veggen av Oak Ridge rør, resuspend den "Salt" pellet fra halvveis mellom myelin bandet og bunnen av røret. Merk at pellet ikke kan være synlig. Resuspending kjerner høyere langs røret kan medføre myelin forurensning i kjerner utarbeidelse. Mobilnettet lyse og sukrose tetthet sentrifugering trinnene er den mest kritiske til å redusere partikler som kan tette microfluidic kanaler for nedstrøms program.

Navnet på materiale / utstyr Lager konsentrasjon Siste konsentrasjon Volum / mengde
Vaskemiddel lyseringsbuffer
Lav sukrose buffer - - 600 ΜL
Triton-X 20% 0,10% 3 ΜL
Hypotonisk lyseringsbuffer
Tris-HCl (pH = 7.4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0,01% 1 ΜL
Nuclease-fritt vann opptil 10 mL
HEB Medium
Dvalemodus-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Lav sukrose buffer
Sukrose - 0.32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM 125 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0,5 M 0,1 mM 5 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Nuclease-fritt vann opptil 25 mL
Sukrose tetthet buffer
Sukrose - 1 M 8.6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Nuclease-fritt vann opptil 25 mL
Rørets løsning
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
RNAse hemmer 40 U/ΜL 0,2 U/ΜL 5 ΜL

Tabell 1: Tabell over løsninger.

Råolje Homogenisert Siste
Vaskemiddel mekaniske 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
Hypotonisk-mekanisk 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

Tabell 2: avkastningen av kjerner på hvert trinn i protokollen. Antall kjerner i første råolje utarbeidelsen etter dounce homogenisering i vaskemiddel mekaniske lysis protokollen ble brukt til å beregne antall kjerner i lumbal ryggmargen. Første kjerner gir (2.6 x 106 kjerner ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) ble brukt til å beregne kjerner gi på nedstrøms trinn for begge vaskemiddel - og hypotonisk-mekanisk lysis protokollene. Antall kjerner isolert av hypotonisk mekaniske utarbeidelse var normalisert til anslagsvis første kjerner. Verdier i tabellen er gjennomsnittlig ± SEM, N = 3.

Figure 1
Figur 1: skjematisk kjernefysiske isolasjon. Kjerner fra voksen ryggmargen kan isoleres ved hjelp av vaskemiddel mekaniske eller hypotonisk mekaniske lysis, etterfulgt av homogenisering og sukrose tetthet gradert sentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representant brightfield og DAPI-farget kjerner på key trinn i protokollen.  (A, B) råolje kjerner etter vaskemiddel mekaniske eller hypotonisk mekaniske lysis. (C, D) Kjerner etter homogenisering. (E, F) Kjerner resuspended på PBS med 0,04% BSA etter sukrose tetthet sentrifugering. Kjerner ble løst med 2% paraformaldehyde, og deretter farget Trypan blå eller DAPI. Bildene ble tatt på 10 X (skala bar = 100 µm) med brightfield og epi-fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant tSNE tomt sekvensert kjerner: bruke vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske lysis. (A) resultatene fra sekvensering over 17.000 kjerner fra dissekert voksen mus lumbale ryggmargen etter vaskemiddel mekaniske lyse og ifølge Macosko et al. 2015 med endringer fra Sathyamurthy et al. 2018. dette tallet er endret med tillatelse fra Sathyamurthy et al. 2018.4 (B) resultatene fra sekvensering 5000 kjerner fra utløst voksen lumbale ryggmargen følgende hypotonisk-mekanisk lyse og en kommersiell microfluidic enkeltcelle innkapsling plattform. 26  (C, D) gjennomsnittlig gener per kjernen resultater etter klynging store celletyper i voksen mus ryggmargen ± SEM. Av notatet, vaskemiddel mekaniske lysis prosedyren etterfulgt av Macosko et al. 2015 plattformen ble utført dissekert lumbale ryggmargen, mens hypotonisk-mekanisk lysis etterfulgt av reklamen plattformen ble utført ved hjelp av utløst lumbale ryggmargen (som beskrevet i denne protokollen). Gitt at utkasting ledningen fjerner dura og dorsal root Ganglion, meningeal/Schwann celle klyngen er fraværende fra figur 3B og D. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: FACS tomt NeuN+ kjerner etter vaskemiddel mekaniske lysis. FACS plottet viser fast kjerner farget NeuN (gjennomsnittlig 31,9% av totale kjerner ± 2.0% SEM, N = 13), isolert med vaskemiddel mekaniske lysis protokollen. For de umiddelbare fiksering, kjerner for FACS validering, en grov kjerner forberedelse ble innhentet av dounce homogenisering av spinal snorer med vaskemiddel mekaniske utarbeidelse, etterfulgt av øyeblikkelig fiksering med 1% PFA med en 5 min inkubasjonstid. Fiksering var slukket med 250 mM glysin og kjerner ble samlet. Flekker med anti-NeuN antistoff ble utført i løsningen. FACS ble utført på faste, NeuN farget kjerner bruker celle sortering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: kjerner forberedelse uten homogenisering. Kjerner var resuspended før sukrose tetthet sentrifugering etter A vaskemiddel mekaniske eller B hypotonisk mekaniske lysis, uten homogenisering. * Angir mobilnettet rusk knyttet til kjerner (A) og en multiplet av kjerner knyttet av mobilnettet rusk (B). Kjerner resuspended på PBS med 0,04% BSA etter sukrose tetthet sentrifugering. Kjerner ble løst med 2% paraformaldehyde, og deretter farget Trypan blå eller DAPI. Bildene ble tatt på 10 X (skala bar 100 µm) med brightfield og epi-fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det endelige målet med denne protokollen er å isolere kjerner som inneholder høykvalitets RNA for nedstrøms transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for å profilere alle celletyper i ryggmargen. Først fant vi at typisk celle dissosiasjon metoder var ineffektivt for enkeltcelle RNA sekvensering, som ryggmargen neurons er spesielt utsatt for celledød. Videre induserer celle dissosiasjon metoder uttrykk for ulike aktivitet - og stressrespons gener av opptil flere hundred-fold. 3 , 4 , 16 gitt ulempene knyttet enkeltcelle forberedelser, har vi og andre brukt kjerner som et alternativ. 16 , 17 , 18 , 24 denne metoden kan også brukes på menneskelig vev, inkludert frosne ryggmargen vev. 4 , 19 , 24 her, vil vi beskrive styrker og begrensninger av denne tilnærmingen.

Styrken i denne metoden inkluderer unngå eksperimentelt indusert IEGs og til å bruke både fersk og frossen vev. 4 derfor, dette kan være nyttig for undersøkelser endogene IEGs etter eller et stimulans. 1 , 3 , 4 en av fordelene med denne metoden er at det ikke krever spesialiserte enheter for utnyttelse av kjerner for massivt parallelle enkelt kjernen sekvensering, men kan bruke plattformen utviklet av Macosko et al. 2015, med mindre justeringer av lysis buffer og flow rate, eller bruke kommersielt tilgjengelige systemer. Dessuten er enkelt kjernen sekvensering bevist for å være sammenlignbare metode for enkelt celle sekvensering for identifikasjon av celletyper, utlån til styrken på denne tilnærmingen. 28 , 29 men det er flere viktige begrensninger av denne tilnærmingen. Kjerner inneholder ca 20-50% av mobilnettet mRNA, gjenspeiles29 og dette i et lavere antall transkripsjoner per kjernen sammenlignet enkeltcelle sekvensering. 18 , 29 inkludert intronic leser fra snRNA-Seq er en tilnærming for å øke antall oppdaget gener.

Det finnes flere tilgjengelige protokoller som muliggjør isolering av kjerner fra vev. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 sammenlignet med de fleste andre metodene, protokollene presenteres her ikke krever myelin fjerning, ultracentrifugation, eller mange sentrifugering trinn eller vasker som kan føre til lavere siste antall kjerner. Videre tar denne protokollen 45 min (vaskemiddel mekaniske) eller 1 time (hypotonisk mekaniske) å fullføre. Kommersielle protokoller som støttes på microfluidic plattformer er mer enn dobbelt, og kreve mange flere sentrifugering skritt, øker risikoen for å miste kjerner. Kontrast kjerner isolasjon protokoller som involverer bare lyse og filtrering, inkluderer metodene presenteres her sukrose gradering for å øke renheten av siste kjerner. Dette trinnet er nødvendig for voksen ryggmargen vev på grunn av hvit substans og den resulterende myelin rusk.

Vaskemiddel mekaniske lysis protokollen kan brukes for komplett vev dissosiasjon og lyse, og hypotonisk-mekanisk lysis protokollen kan brukes til å kontrollere mengden vev dissosiasjon og mobilnettet rusk tillatt i programmet nedstrøms. Disse protokollene kan brukes for bio-bank materiale, vanskelig å distansere vev og etterforskning av aktivitet-avhengige transcriptional endringer gjennom isolering av kjerner for nedstrøms massivt parallelle snRNA-Seq. I tillegg til massivt parallelle enkelt kjernen RNA sekvensering, kan denne protokollen brukes til å isolere kjerner for alternative programmer, inkludert immunofluorescence og FACS og epigenetic analyse som DNA metylering studier og ChIP-Seq (Figur 4 ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av intramural programmet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og bakgrunnsstøyreduksjon Dobrott for kundestøtte og nyttig diskusjoner og C. Kathe for gjennomgang manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Tags

Nevrovitenskap problemet 140 kjerner RNA sekvensering snRNA-Seq massivt parallell ryggmarg sukrose gradering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter