ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.
Abstract
Een afzonderlijke cel genexpressie indringende maakt de identificatie van celtype en cel staat. Eencellige RNA sequencing heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de studie van transcriptionele profielen van cellen, met name in heterogene weefsels zoals het centrale zenuwstelsel. Echter, dissociatie methoden die nodig zijn voor het eencellige rangschikken kunnen leiden tot experimentele wijzigingen in de gen-expressie en cel dood. Bovendien, deze methoden zijn over het algemeen beperkt aan verse weefsel, waarbinnen de studies over de archivering en bio-bank materiaal te beperken. Enkele kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een aantrekkelijk alternatief voor transcriptionele studies, gezien het feit dat het nauwkeurig identificeert celtypes, vergunningen van de studie van weefsel dat is bevroren of moeilijk te distantiëren, en vermindert dissociatie-geïnduceerde transcriptie. Hier presenteren we een protocol hoge gegevensdoorvoer voor snelle Isolatievan kernen voor downstream snRNA-Seq. Deze methode maakt Isolatievan kernen van vers of bevroren ruggenmerg monsters en kan gecombineerd worden met twee massaal parallelle druppel inkapseling platforms.
Introduction
Het zenuwstelsel bestaat uit heterogene groepen van cellen die een veelzijdige elektrofysiologische, morfologische en biochemische eigenschappen worden weergegeven. Terwijl de bulk RNA sequencing is nuttig voor het bepalen van weefsel bestrijkende veranderingen in de genexpressie onder verschillende omstandigheden, het verzet zich tegen de detectie van transcriptionele veranderingen op het niveau van één cel. Recente vooruitgang in de eencellige transcriptionele analyse de indeling van heterogene cellen in functionele groepen op basis van hun moleculaire repertoire hebt ingeschakeld en zelfs kunnen worden benut voor het detecteren van sets van neuronen die had onlangs actief geweest. 1 , 2 , 3 , 4 de afgelopen tien jaar heeft de ontwikkeling van eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq) de studie van genexpressie in afzonderlijke cellen, die een mening wordt celtype diversiteit. 5
De opkomst van schaalbare benaderingen zoals Seq-massively parallel scRNA, heeft verstrekt platformen op volgorde heterogene weefsels, met inbegrip van vele regio's in het centrale zenuwstelsel. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter eencellige dissociatie methoden kunnen leiden tot de dood van de cel, evenals de experimentele wijzigingen in genexpressie. 16 recent werk heeft aangepast methodes van eencellige sequencing zodat behoud van endogene transcriptionele profielen. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 deze strategieën zijn bijzonder geschikt voor het opsporen van onmiddellijke vroege (IEG) genexpressie na zintuiglijke prikkel of gedrag. 3 , 4 In de toekomst deze strategie kan ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in weefsels in ziekte staten of in reactie op spanning te bestuderen. Van deze methoden, één kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een veelbelovende aanpak die geen stress-inducerende cel dissociatie en kan gebruikt worden op de moeilijk te distantiëren van weefsel (zoals het ruggenmerg), evenals bevroren weefsel. 4 , 17 , 18 , 19 aangepast uit de vorige kernen isolatie methoden,20,21,22,23,25 snRNA-Seq meestal maakt gebruik van verstoring van de snelle weefsel en cel Lysis onder koude omstandigheden, centrifugeren en scheiding van de kernen van cellulaire puin. 4 kernen kunnen worden geïsoleerd voor de downstream sequencing van de volgende generatie op meerdere microfluidic druppel inkapseling platformen. 4 , 7 , 24 , 25 deze methode zorgt voor een momentopname van de transcriptionele activiteit van duizenden cellen op een moment.
Er zijn meerdere strategieën voor het vrijgeven van de kernen van cellen voor isolatie en sequencing, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier, we beschrijven en vergelijken van twee protocollen om te schakelen van de isolatie van de kernen van de volwassen ruggenmerg voor de downstream massively parallel snRNA-Seq: wasmiddel-mechanische lysis en hypotone-mechanische lysis. Wasmiddel-mechanische lysis biedt volledige weefsel verstoring en een hogere uiteindelijke opbrengst van kernen. Hypotone mechanische-lysis omvat een beheersbare mate van verstoring van de weefsel, een mogelijkheid voor het selecteren van een evenwicht tussen de hoeveelheid en de zuiverheid van het definitieve nucleaire rendement bieden. Deze benaderingen bieden vergelijkbare RNA opbrengst, gedetecteerde aantal genen per celkern, en celtype profilering en ook kunnen zowel worden gebruikt met succes voor snRNA-Seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig een protocol goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders beroerte Animal Care en gebruik Comité. Evenwichtig monsters van mannelijke en vrouwelijke ICR/CD-1 wild-type muizen, tussen 8 en 12 weken oud, werden gebruikt voor alle experimenten. Muizen moeten worden behandeld in overeenstemming met lokale institutionele Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren.
1. voorbereiding van de materialen en Buffers
- Bereiden alle buffers de dag van gebruik en vooraf chill op ijs (Zie tabel 1).
- Als gebruikt wasmiddel-mechanische lysis, bereiden de wasmiddel lysis-buffermengsel (> 500 μL per monster), lage sacharose buffer (> 6 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster) en de resuspensie oplossing (> 1 mL).
- Als gebruikt hypotone-mechanische lysis, bereiden de hypotone lysis-buffermengsel (> 5 mL per monster) HEB medium (> 5 mL per monster), lage sacharose buffer (> 3 mL per monster), sacharose dichtheid buffer (> 12,5 mL per monster), en de resuspensie oplossing (> 1 mL).
- 25 μL van dithiothreitol (DTT) aan 25 mL van de lage sacharose buffer en een ander 25 μL van DTT tot 25 mL van de dichtheid van de kleurovergang buffer van sacharose net voordat het protocol toevoegen.
- Betrekking hebben op het ontleden oppervlak met aluminium-folie om te minimaliseren van verontreiniging van het monster met vezels van papieren handdoeken of bench beschermers, die microfluidic kanalen gebruikt voor het vastleggen van enkele kernen kunnen verstoppen.
- Spray ontleden tools en Bank ruimte met een RNase decontaminatie oplossing. Bovendien, de binnenkant van de Dounce homogenizer buis (als gebruikt wasmiddel-mechanische cellysis) en Oak Ridge buis te spuiten met een RNase decontaminatie oplossing. De Dounce en Oak Ridge buis met ultrazuiver, RNase-gratis water spoelen.
- Chill vooraf alle collectie buizen (50 mL kegelvormig, Oak Ridge) en Dounce homogenizer buizen op ijs.
- Brand Pools een reeks van Pasteur pipetten (als hypotone-mechanische cellysis gebruikt).
2. voorbereiding van het ruggenmerg
- Als met behulp van vers weefsel, euthanaseren de muis bij CO2 inademing. Spray na euthanasie, de vacht van de muis met 70% ethanol tot een minimum beperken van haar besmetting in de steekproef.
- Decapitate de muis met een scherpe, RNase-gratis chirurgische schaar. Vervolgens voorzichtig het opheffen van de abdominale huid met een tang en een sneetje langs de lengte van het lichaam bloot de binnenorganen te maken.
- Verwijderen van de ingewanden de muis door te trekken van de innerlijke organen uit de lichaamsholte met pincet. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of te verwijderen van organen zoals dit verontreinigingen kan invoeren. Met behulp van schaar, sneed de wervelkolom tussen de L2 en L3 wervelkolom wervels.
Opmerking: Met de praktijk, deze stap kan worden bereikt in minder dan 30 seconden.- Passen om uit te werpen het ruggenmerg, een 3 mL injectiespuit met ijskoude PBS met een 25 G ¼ inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale einde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om te knijpen van de wervels te maken van een goede afdichting rond de punt van de naald en druk naar beneden op de plunjer rostrally uitwerpen van het ruggenmerg. Plaats het ruggenmerg in een petrischaal met ijskoude PBS.
- Op dit moment bevriezen van het weefsel en opslaan bij-80 ° C of onmiddellijk voor wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4) gebruiken.
- Als met behulp van bevroren weefsel, onderhoudt het weefsel op droog ijs, gaat u verder met wasmiddel-mechanische (stap 3) of hypotone-mechanische lysis van de (stap 4).
3. wasmiddel-mechanische cellysis
- Plaats het lumbale ruggenmerg in een vooraf gekoeld Dounce homogenizer en voeg 500 mL pre gekoeld wasmiddel lysis-buffermengsel.
Opmerking: Een muis lumbale ruggemerg is 325.5 mg ± 63.9 mg standaardfout van het gemiddelde (SEM, N = 4). 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt. - Dounce met 5 lijnen van stamper een ('losse' stamper), dan 5-10 slagen van stamper B ('strak' stamper). Vermijd opheffing van de homogenizer uit de lysis oplossing tussen lijnen en te voorkomen dat de invoering van de bubbels.
- Plaats een 40 mm zeef boven een vooraf gekoeld 50 mL conische buis en prewet met 1 mL lage sacharose buffer.
- 1 mL van lage sacharose buffer toevoegen aan de homogenizer van de Dounce met de ruwe kernen in de lysis-buffermengsel en meng zachtjes door pipetteren 2 tot 3 keer.
- De ruwe kernen prep voorbij door de zeef van 40 mm in de vooraf gekoeld 50 mL conische buis.
- Een extra 1 mL lage sacharose buffer voorbij de zeef van 40 mm, waardoor het eindvolume tot 3 mL van de lage sacharose buffer en 500 mL van de lysis-buffermengsel.
- Herhaal stap 3.1 – 3.6 als het combineren van meerdere koorden, bundelen in de dezelfde conische buis.
- Centrifugeer het monster bij 3200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren in de bovendrijvende substantie. Ga verder met stap 5.
4. hypotone-mechanische cellysis
- Plaats het lumbale ruggenmerg in 5 mL van de hypotone lysis-buffermengsel in een schotel weefselkweek. Met het botte uiteinde van voorjaar schaar bisect van het ruggenmerg en gebruikt u vervolgens voorjaar schaar te knippen het snoer in stukken van 3-4 mm, maar doen geen blad.
Opmerking: 50 mg-1.5 g van weefsel kan met succes worden gebruikt. - Incubeer op het ijs gedurende 15 minuten, 2 tot 3 keer zwenken.
- Voeg 5 mL van HEB medium om te verdunnen de hypotone lysis-buffermengsel.
- Triturate het weefsel 10 keer met een serologische 5 mL-Pipet, of totdat alle stukken van het weefsel soepel doorlopen naar de opening van de pipet.
- Triturate met een reeks van drie brand-gepolijst Pasteur pipetten met geleidelijk smaller diameters (~ 900-600 mm).
- Voor elke Pipet, triturate 5 - 15 keer, toestaan dat weefsel te regelen, verwijderen van 1-2 mL van het supernatans met gedissocieerde kernen en voorbij een 40 mm zeef in een conische buis van vooraf gekoeld 50 mL.
- Na verpulvering met de kleinste middelgrote Pasteur Pipet, zien erop toe dat de homogenaat vlot door het uiteinde van de pipet stroomt. De resterende oplossing voorbij door de zeef van 40 mm in de conische buis van 50 mL.
Opmerking: Het totale aantal triturations kan worden aangepast als gewenste. De hersenvliezen van het ruggenmerg muis zal blijven, maar het is belangrijk dat de triturate zichtbare stukjes van het ruggenmerg. De resterende homogenaat voorbij de 40 m-zeef. Vermijd invoering van bubbels tijdens verpulvering.
- Centrifugeer het gefilterde monster bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zodra het centrifugeren voltooid is, decanteren en verwijder het supernatant. Ga verder met stap 5.
5. de homogenisering en Sucrose dichtheid verloop
- Na stap 3 of 4, resuspendeer de pellet met behulp van 3 mL lage sacharose buffer. Zachtjes wervelen om te verwijderen van de pellet uit de muur om de resuspensie. Laat het monster zitten op het ijs gedurende 2 minuten en spoel de suspensie tot een koker Oak Ridge.
- Met behulp van de homogenizer op 1 instelt, meng de kernen in lage sacharose buffer voor 15 – 30 s, houden het monster op het ijs.
Opmerking: Gebruik 15 s als een lumbale ruggemerg of 30 s als samengevoegde monsters of een hele ruggenmerg. - Met behulp van een serologische precisiepipet, laag 12,5 mL dichtheid sacharose buffer onder de lage sacharose buffer homogenaat, verzorgen als u niet wilt maken van een zeepbel die de dichtheid lagen verstoort.
- Centrifugeer de buizen bij 3200 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Zodra het centrifugeren voltooid is, onmiddellijk decanteren in de bovendrijvende substantie in een flicking beweging.
Opmerking: Een restvolume (minder dan 400 mL) van sacharose buffer kan worden verwijderd indien gewenst een lager volume en schoner eindmonster te produceren, maar deze restvolume bevat kernen en kan worden bewaard om te maximaliseren van de opbrengst van de kernen. - Gebruik van 100 mL - 1 mL van resuspensie oplossing resuspendeer de kernen die nog op de muur. Vermijd de myeline 'frown' die bij de voorbereiding van wasmiddel gebaseerde opgeslagen blijft.
- Filtreer de kernen door een zeef 30 – 35 mm-poriegrootte en verzamelen in een vooraf gekoeld buis.
- Bepaal de kernen opleveren met behulp van een hemocytometer om te tellen kernen onder een 10 X doelstelling.
Opmerking: Trypan blauw kan worden toegevoegd aan het visualiseren van kernen, die moeten worden in blauw weergegeven. Noteer de hoeveelheid cellulaire puin. - Ga verder met stap 6 of 7.
6. massively Parallel snRNA-Sequencing: academisch Platform7
- Uitvoeren van de sequencing van massaal parallelle snRNA (b.v., Drop-Seq) zoals eerder beschreven methode7 met de volgende wijzigingen:4
- Aanpassen kernen om een eindconcentratie van 225 kernen per mL.
- Bereiden barcoded kralen bij een concentratie van 250 kralen per mL.
- De lysis-buffermengsel met 0,7% sarkosyl voor te bereiden.
- Aanpassen van de stroomsnelheid tot 35 mL per min voor kralen, 35 mL per min. voor kernen en 200 mL per min. voor olie.
7. massively parallel snRNA-sequencing: commercieel Platform26
- Uitvoeren van massaal parallelle snRNA-sequencing met behulp van de commerciële platform (bijvoorbeeld, chroom Single Cell gen expressie oplossing) producten volgens de fabrikant instructies26 met de volgende wijziging:
- Na omgekeerde-transcriptie, voeg toe een extra PCR cyclus aan het berekende aantal cycli voor versterking van cDNA op basis van het herstel van de gerichte cel ter compensatie van de verminderde cDNA van kernen in vergelijking met cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier, wij isolatie van kernen van de lumbale ruggemerg van volwassen muis voor downstream massaal parallelle RNA sequencing uitgevoerd. Het protocol betrokken drie hoofdonderdelen: weefsel verstoring en cellulaire lysis en homogenisering sacharose dichtheid centrifugeren (Figuur 1). Binnen seconden leverde het wasmiddel-mechanische lysis een ruwe kernen preparaat met een groot aantal kernen, alsmede op cellulair en weefsel puin (figuur 2Atabel 2). Na vijftien minuten leverde de hypotone-mechanische lysis een ruwe kernen preparaat dat had minder puin, maar ook minder kernen (figuur 2Btabel 2). Beide preparaten onderging homogenisering (figuur 2C en D) en sucrose dichtheid kleurovergang centrifugeren voordat hersuspensie in PBS met 0,04% BSA (figuur 2E en F). Voor een gemiddelde, een muis lumbale ruggemerg (325.5 mg ± 63.9 mg standaardfout van het gemiddelde, SEM, N = 4) leverde 5.1 x 105 kernen (± 6.3 x 10,4 SEM, N = 3) na het wasmiddel-mechanische lysis en 2.0 x 105 kernen (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) na de hypotone-mechanische lysis. Het aantal kernen in het lumbale ruggenmerg werd geschat uit de eerste ruwe voorbereiding na de homogenisering van de Dounce in het wasmiddel-mechanische lysis-protocol (2.6 x 106 kernen ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, tabel 2). Het uiteindelijke monster van het detergens-mechanische lysis-protocol bestaat uit 20% van de oorspronkelijke kernen (± 2% SEM, N = 3, tabel 2). De voorbereiding van de ruwe kernen van de hypotone-mechanische lysis na verpulvering bevat 62% van de oorspronkelijke kernen (± 2% SEM, N = 3, tabel 2). Het laatste hypotone-mechanische lysis monster bevat slechts 8% van de oorspronkelijke kernen (± 1% SEM, N = 3, tabel 2). We did niet speurder ieder verschil in de totale opbrengst van RNA of de cDNA opbrengst voor een huishouden gen (Gapdh) tussen de twee bereidingswijzen. Met behulp van qPCR, de wasmiddel methode leverde 463.7 ng (± 98.9 SEM, N = 6) van de totale RNA en een gemiddelde drempel detectiecyclus van 25,2 (± 1,3 SEM) voor Gapdh cDNA door qPCR en de hypotone methode leverde 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) van de totale RNA en de drempel van een gemiddelde detectie cyclus van 26,1 voor Gapdh, cDNA (± 0.8 SEM). De twee opties van de lysis van de kernen van moeilijk te distantiëren weefsels isoleren zowel bieden het hoge kwaliteit materiaal voor de downstream single-nucleus RNA sequencing.
Gezien de omvang van microfluidic kanalen voor downstream massaal parallelle één kern sequencing platformen, is het essentieel voor het invoeren van een kernen schorsing gratis grote deeltjes of cellulaire puin ter voorkoming van verstoppingen. Na het protocol hier gepresenteerd, waren er geen exemplaren van de verstopping op het platform van Macosko et al. aangepast 2015 (N = 17) en een gedeeltelijke klomp op de commerciële platform (N = 16).
Het wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische procedures werden gebruikt voor het isoleren van de kernen met succes voor twee massaal parallelle druppel inkapseling platformen en representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 3. Beide van deze benaderingen ingeschakeld transcriptionele profilering van duizenden kernen, en de indeling van de celtypes in het lumbale ruggenmerg van volwassen muis (Figuur 3). 4 deze benaderingen resulteerde in vergelijkbare genen per kern voor elk celtype (Figuur 3 c en D). De tarieven van de terugvordering van input kernen tussen de twee platforms verschillen. Het platform van Macosko et al. 2015 aangepast met wijzigingen van Sathyamurthy et al. 2018 hersteld naar schatting 0,59% van kernen (± 0,05% SEM, N = 17), terwijl het commercieel platform hersteld een geschatte kernen van 53,7% (N = 2).
Dit protocol is enigszins verrijkt voor neuronale kernen in de uiteindelijke bereiding. In de lumbale ruggemerg weefselsecties, vonden we dat 27% van de kernen positief voor de neuronale marker NeuN waren (N = 7,368 kernen van 2 dieren), terwijl wasmiddel-mechanische kernen voorbereiding van het lumbale ruggenmerg resulteerde in 31,9% van de totale kernen NeuN, uiten zoals bepaald door de fluorescentie-activated cell sorting (FACS, ± 2,0% SEM, N = 13 onafhankelijke kernen preparaten met behulp van samengevoegde monsters van meerdere dieren in elk preparaat, Figuur 4). Dit is vergelijkbaar met wat is waargenomen eerder voor het percentage van NeuN-positieve kernen in het gehele ruggenmerg (20% tot 24% afhankelijk van de leeftijd),27 , met inbegrip van de cervicale en thoracale regio's, die meer witte stof en oligodendrocyten hebben. Van de nota, NeuN/Rbfox3 wordt niet uitgedrukt in alle neuronen en, dienovereenkomstig, deze nummers zijn waarschijnlijk bescheiden onderschat. Het is mogelijk dat kleinere non-neuronale cellen iets tijdens de kleurovergang zuivering van sacharose zijn uitgeput. Daarnaast stroomafwaarts worden gefilterd of geanalyseerd parameters sequencing na de laatste cel-type verdeling kunnen wijzigen omdat neuronen meer genen per nucleus hebben (Figuur 3 c en D) en, derhalve, minder waarschijnlijk worden verwijderd tijdens het filteren.
Er zijn verscheidene belangrijke stappen in dit protocol die verzorging nodig hebben. Eerste, overmatige douncing of verpulvering (in stappen 3 of 4, respectievelijk) kan leiden tot een toename van de cellulaire puin en deeltje formatie. Hoewel filtratie en sacharose dichtheid centrifugeren grote deeltjes, scheiden kunnen zodra de kleine deeltjes worden gegenereerd tijdens cellulaire lysis, zijn ze moeilijk te verwijderen. In de tweede plaats tijdens homogenisering, zet geen de homogenizer rechtstreeks op de onderkant van de buis van de Oak Ridge. Onderdompelen in plaats daarvan, het einde van de homogenizer in de lage sacharoseoplossing met geresuspendeerde kernen, zonder het aanraken van de onderkant van de buis. Nucleaire isolatie verbetert homogenisering door het verwijderen van cellulaire puin en vermindering van de klontjes en flavorgroep (Figuur 5). Na sacharose dichtheid centrifugeren is het essentieel voor de onmiddellijke verwijdering van de Oak Ridge buis van de centrifuge, en snel decanteren in de bovendrijvende substantie in een snelle 'flicking' beweging. Wanneer resuspending kernen van de wand van de buis Oak Ridge, resuspendeer de 'Zoute' pellet uit halverwege de myeline-band en de onderkant van de buis. Merk op dat de pellet zijn niet altijd zichtbaar. Resuspending kernen hoger langs de buis kan resulteren in myeline besmetting bij de voorbereiding van de kernen. De cellulaire lysis en sacharose dichtheid centrifugeren stappen zijn het meest essentieel zijn voor de vermindering van de deeltjes die microfluidic kanalen voor downstream toepassing kunnen verstoppen.
| Naam van materiaal / apparatuur | Voorraad concentratie | Eindconcentratie | Volume / bedragen |
| Wasmiddel Lysis Buffer | |||
| Lage sacharose buffer | - | - | 600 ΜL |
| Triton-X | 20% | 0,10% | 3 ΜL |
| Hypotone Lysis-buffermengsel | |||
| Tris-HCl (pH = 7.4) | 1 M | 10 mM | 100 ΜL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 20 ΜL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 30 ΜL |
| Nonidet P40 | - | 0,01% | 1 ΜL |
| Nuclease-gratis water | tot 10 mL | ||
| HEB Medium | |||
| Slaapstand-A | - | - | 10 mL |
| Glutamax | - | - | 100 ΜL |
| B27 | - | - | 200 ΜL |
| Lage sacharose buffer | |||
| Sacharose | - | 0.32 M | 2.75 / g |
| HEPES (pH = 8.0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| CaCl2 | 1 M | 5 mM | 125 ΜL |
| MgAc | 1 M | 3 mM | 75 ΜL |
| EDTA | 0,5 M | 0.1 mM | 5 ΜL |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Nuclease-gratis water | tot 25 mL | ||
| Sacharose dichtheid buffer | |||
| Sacharose | - | 1 M | 8.6 g |
| HEPES (pH = 8.0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| MgAc | 1 M | 3 mM | 75 ΜL |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Nuclease-gratis water | tot 25 mL | ||
| Resuspensie oplossing | |||
| 1 X PBS | - | - | 1 mL |
| BSA | 20 mg/mL | 0,4 mg/mL | 20 ΜL |
| RNAse Inhibitor | 40 U/ΜL | 0.2 U/ΜL | 5 ΜL |
Tabel 1: Tabel van oplossingen.
| Ruwe | Gehomogeniseerd | Laatste | |
| Wasmiddel-mechanische | 100 ± 15% | 87 ± 9% | 20 ± 2% |
| Hypotone-mechanische | 62 ± 12% | 35 ± 4% | 8 ± 1% |
Tabel 2: rendement van kernen bij elke stap in het protocol. Het aantal kernen in de eerste ruwe voorbereiding na de homogenisering van de dounce in het wasmiddel-mechanische lysis-protocol werd gebruikt om het aantal kernen in het lumbale ruggenmerg te schatten. De eerste kernen opleveren (2.6 x 106 kernen ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) werd gebruikt voor het berekenen van de kernen opleveren bij elke stroomafwaarts stap voor beide wasmiddel - en hypotone-mechanische lysis van protocollen. Het aantal kernen geïsoleerd door de hypotone-mechanische voorbereiding was genormaliseerd naar de geschatte eerste kernen. Waarden in de tabel zijn gemiddelde ± SEM, N = 3.
Figuur 1: schematische van nucleaire isolatie. Kernen van de volwassen ruggenmerg kunnen worden afgezonderd met behulp van lysis van de cel van het wasmiddel-mechanische of hypotone-mechanische, gevolgd door de homogenisering en sacharose dichtheid kleurovergang centrifugeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger helderveld en DAPI gebeitste kernen op sleutel stappen in het protocol. (A, B) ruwe kernen na wasmiddel-mechanische of hypotone-mechanische lysis. (C, D) Kernen na homogenisatie. (E, F) Kernen geresuspendeerde in PBS met 0,04% BSA na sacharose dichtheid centrifugeren. Kernen met 2% paraformaldehyde werden vastgesteld en vervolgens gekleurd met behulp van Trypan blauw of DAPI. Beelden werden genomen op 10 X (schaal bar = 100 µm) met helderveld en epi-fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger tSNE plot van gesequenceerd kernen: met behulp van wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische lysis. (A) de resultaten van meer dan 17.000 kernen van de ontleed volwassen muis lumbale ruggemerg na wasmiddel-mechanische lysis en volgens Macosko et al. 2015 met wijzigingen van Sathyamurthy et al. sequencing 2018. dit cijfer is met toestemming van Sathyamurthy et al. gewijzigd 2018.4 (B) resultaten van sequencing 5.000 kernen van de uitgeworpen volwassen lumbale ruggemerg na hypotone-mechanische lysis en een commerciële microfluidic eencellige inkapseling platform. 26 (C, D) gemiddelde genen per nucleus resultaten na clustering van de belangrijkste celtypen in de volwassen muis ruggenmerg ± SEM. Van de nota, het wasmiddel-mechanische lysis procedure gevolgd door de Macosko et al. 2015 platform werd uitgevoerd met behulp van ontleed lumbale ruggemerg, terwijl de hypotone-mechanische lysis gevolgd door de commerciële platform werd uitgevoerd met behulp van lumbale ruggemerg uitgeworpen (zoals beschreven in dit protocol). Gezien het feit dat het snoer uitwerpen de dura en achterwortelganglia, bevatten verwijdert, het meningeal/Schwann cel cluster afwezig is uit figuur 3B en D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: FACS plot van NeuN+ kernen na wasmiddel-mechanische lysis. FACS perceel met vaste kernen gekleurd voor NeuN (gemiddelde van 31,9% van totale kernen ± 2,0% SEM, N = 13), geïsoleerd met behulp van het wasmiddel-mechanische lysis-protocol. De onmiddellijke fixatie, kernen voor FACS validatie, een ruwe kernen voorbereiding werd behaald door dounce homogenisering spinal koorden met behulp van het wasmiddel-mechanische voorbereiding, gevolgd door onmiddellijke fixatie met 1% PFA met een incubatietijd van 5 min. Fixatie met 250 mM glycine is uitgeblust en kernen werden verzameld. Kleuring met anti-NeuN antilichaam werd uitgevoerd in oplossing. FACS werd uitgevoerd op vaste, NeuN gekleurd kernen met behulp van een cel diasorteerderweergave. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: kernen voorbereiding zonder homogenisering. Kernen werden geresuspendeerde voorafgaand aan sacharose dichtheid centrifugeren na A wasmiddel-mechanische of hypotone-mechanische lysis van de B , zonder homogenisering. * Duidt cellulaire puin gekoppeld aan kernen (A) en een multiplet van kernen gekoppeld door cellulaire puin (B). Kernen geresuspendeerde in PBS met 0,04% BSA na sacharose dichtheid centrifugeren. Kernen met 2% paraformaldehyde werden vastgesteld en vervolgens gekleurd met behulp van Trypan blauw of DAPI. Beelden werden genomen op 10 X (schaal bar 100 µm) met behulp van helderveld en epi-fluorescentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het uiteindelijke doel van dit protocol is te isoleren van de kernen met kwalitatief hoogwaardige RNA voor downstream transcriptionele analyse. We snRNA-Seq methoden aangepast om alle van de celtypes in het ruggenmerg profile. Aanvankelijk vonden we dat typische cel dissociatie methoden ineffectief voor eencellige RNA sequencing, waren zoals ruggenmerg neuronen bijzonder kwetsbaar voor de dood van de cel zijn. Bovendien veroorzaken cel dissociatie methoden expressie van genen die diverse activiteiten - en stressrespons door tot verscheidene awreken. 3 , 4 , 16 gezien de nadelen eencellige preparaten zijn gekoppeld, hebben wij en anderen gebruikt kernen als alternatief. 16 , 17 , 18 , 24 deze methode kan ook worden gebruikt op menselijk weefsel, met inbegrip van bevroren ruggenmerg weefsel. 4 , 19 , 24 hier, beschrijven we de sterke punten en beperkingen van deze aanpak.
Sterke punten van deze methode omvatten het vermijden van experimenteel-geïnduceerde IEGs alsook de mogelijkheid om gebruik van zowel verse als diepgevroren weefsel. 4 zo, deze aanpak nuttig kan zijn voor indringende endogene IEGs na een gedrag of stimulans. 1 , 3 , 4 een van de voordelen van deze methode is dat het vereist geen gespecialiseerde apparaten voor gebruik van kernen voor het massaal parallelle één kern rangschikken, maar het platform ontwikkeld door Macosko et al. 2015, met kleine aanpassingen van kunt lysis buffer en stroom tarief, of gebruik commercieel beschikbare systemen. Bovendien wordt enkele nucleus sequencing bewezen te zijn van een vergelijkbare methode aan die van de eencellige rangschikken voor de identificatie van celtypes, leningen aan de kracht van deze aanpak. 28 , 29 er zijn echter enkele belangrijke beperkingen van deze aanpak. Kernen bevatten ongeveer 20-50% van de cellulaire mRNA, wordt29 en dit weerspiegeld in een geringere aantal afschriften per kern ten opzichte van eencellige sequencing. 18 , 29 met inbegrip van intronic leesbewerkingen van snRNA-Seq is één aanpak te verhogen van het aantal gedetecteerde genen.
Er zijn diverse beschikbare protocollen waarmee Isolatievan kernen van weefsel. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 in vergelijking met de meeste andere methodes, de protocollen die hier gepresenteerd vereisen geen myeline verwijdering, ultracentrifugatie, of veel centrifugeren stappen of wast die leiden kunnen tot lagere definitieve aantal kernen. Bovendien, dit protocol, neemt 45 min (wasmiddel-mechanische) of 1 uur (hypotone-mechanische) om te voltooien. Commerciële protocollen die worden ondersteund op microfluidic platforms zijn van meer dan het dubbele van de tijd, en vereisen veel meer stappen van centrifugeren, waardoor het risico van verlies van kernen. In tegenstelling tot de kernen isolatie protocollen waarbij alleen lysis en filteren, omvatten de methoden die hier gepresenteerd een sacharose verloop te verhogen van de zuiverheid van de definitieve kernen. Deze stap is vereist voor volwassen ruggenmerg weefsel als gevolg van het grote percentage van witte stof en de resulterende puin van de myeline.
Het wasmiddel-mechanische lysis-protocol kan worden gebruikt voor de volledige weefsel dissociatie en lysis en de hypotone-mechanische lysis-protocol kan worden gebruikt om te bepalen welke van weefsel dissociatie en cellulaire puin toegestaan in de stroomafwaartse toepassing. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor bio-bank materiaal, moeilijk te distantiëren van de weefsels en voor het onderzoek van activiteit-afhankelijke transcriptionele veranderingen door het isolement van de kernen voor downstream massively parallel snRNA-Seq. Naast massaal parallelle één kern RNA sequencing, kan dit protocol worden gebruikt voor het isoleren van de kernen voor alternatieve toepassingen, waaronder immunofluorescentie en FACS en epigenetische analyse zoals DNA methylering studies en ChIP-Seq (Figuur 4 ). 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van NINDS (1 ZIA NS003153 02) en NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wij danken L. Li en C.I. Dobrott voor hun technische ondersteuning en nuttige discussies en C. Kathe voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
Tags
Neurowetenschappen kwestie 140 kernen RNA sequencing snRNA-Seq massaal parallel ruggenmerg sacharose verloopErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
