ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt isolera högkvalitativa kärnor från färska eller frysta vävnaden för nedströms massivt parallella RNA-sekvensering. Vi inkluderar rengöringsmedel-mekaniska och hypoton-mekaniska vävnad störningar och cell lysis alternativ, som båda kan användas för isolering av atomkärnor.
Abstract
Sondera en enskild cell genuttryck möjliggör identifiering av celltyp och cell staten. Encelliga RNA-sekvensering har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionell profiler av celler, särskilt i heterogena vävnader såsom det centrala nervsystemet. Dock kan dissociation metoder krävs för enstaka cell sekvensering leda till experimentella förändringar i genen uttryck och cell död. Dessa metoder är dessutom generellt begränsad till färsk vävnad, vilket begränsar studier på arkivering och bio-bank material. Enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är ett tilltalande alternativ för transkriptionell studier, med tanke på att det exakt identifierar celltyper, tillåter studiet av vävnader som är frysta eller svårt att sära på, och minskar dissociation-inducerad transkription. Här presenterar vi ett högt dataflöde protokoll för snabb isolering av kärnor för nedströms snRNA-följande punkter. Denna metod möjliggör isolering av kärnor från färska eller frysta ryggmärgen prover och kan kombineras med två massivt parallella droplet inkapsling plattformar.
Introduction
Nervsystemet består av heterogena grupper av celler som visar en mångfald av morfologiska, biokemiska och elektrofysiologiska egenskaper. Medan den bulk RNA-sekvenseringen har varit användbar för att fastställa vävnad-omfattande förändringar i genuttryck under olika förhållanden, den utgör hinder för detektion av transkriptionell ändringar på enskild cell. Senaste framstegen inom encelliga transkriptionell analysen har aktiverat Klassificering av heterogen celler i funktionella grupper baserat på deras molekylära repertoar och kan även användas för att identifiera uppsättningar av nervceller som hade varit nyligen aktiva. 1 , 2 , 3 , 4 de senaste tio åren har utvecklingen av enstaka cell RNA sekvensering (scRNA-Seq) har möjliggjort studier av genuttryck i enskilda celler, som ger en inblick i celltyp mångfald. 5
Uppkomsten av skalbara metoder såsom massivt parallella scRNA-Seq, har lämnat plattformar till sekvens heterogena vävnader, inklusive många regioner i centrala nervsystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 dock enstaka cell dissociation metoder kan leda till såväl celldöd som experimentella förändringar i genuttryck. 16 senaste arbete har anpassat enda cell sekvenseringsmetoder för att aktivera bevarande av endogena transkriptionell profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 dessa strategier har varit särskilt lämplig för att upptäcka omedelbara tidiga (IEG) genuttryck efter sinnesretning eller beteende. 3 , 4 i framtiden, denna strategi kan också användas för att studera dynamiska förändringar i vävnader i sjukdomstillstånd eller som svar på stress. Dessa metoder, enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är en lovande strategi som innebär inte stress-inducerande cell dissociation och kan användas på svårt att separera vävnad (såsom ryggmärgen), samt fryst vävnad. 4 , 17 , 18 , 19 anpassas från tidigare kärnor isoleringsmetoder,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligtvis använder snabb vävnad störningar och cell lysis under kalla förhållanden, centrifugering och separering av atomkärnor från cellulära skräp. 4 kärnor kan isoleras för nedströms nästa generations sekvensering på flera mikroflödessystem droplet inkapsling plattformar. 4 , 7 , 24 , 25 denna metod möjliggör en ögonblicksbild av tusentals celler transkriptionell verksamhet vid en tidpunkt.
I området i närheten finns det flera strategier för att frigöra kärnor från celler innan isolering och sekvensering, alla med sina egna fördelar och nackdelar. Här, vi beskriver och jämför två protokoll om du vill aktivera isolering av kärnor från vuxna ryggmärgen för de nedströms massivt parallella snRNA-Seq: tvättmedel-mekaniska lysis och hypoton-mekaniska lysis. Tvättmedel-mekaniska lysis ger komplett vävnad störningar och en högre slutliga avkastning av atomkärnor. Hypoton mekaniska-Lys inkluderar en kontrollerbar grad av vävnad störningar, vilket ger en möjlighet för att välja en balans mellan kvantitet och renhet av slutlig kärnteknisk avkastningen. Dessa metoder ger jämförbara RNA avkastning, upptäckta antal gener per kärna och celltyp profilering och också kan både användas framgångsrikt för snRNA-följande punkter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbetet utförs i enlighet med ett protokoll som godkänts av den nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke djur vård och användning kommittén. Balanserad prover av manliga och kvinnliga ICR/CD-1 vildtyp möss, mellan 8 och 12 veckor gamla, användes för alla experiment. Möss ska hanteras enligt lokala riktlinjer för institutionella djur vård och användning kommittén.
1. beredning av material och buffertar
- Förbereda alla buffertar dagen för användning och före chill på is (se tabell 1).
- Om du använder rengöringsmedel-mekaniska lysis, Förbered den tvättmedel lyseringsbuffert (> 500 μL per prov), låg sackaros buffert (> 6 mL per prov), sackaros densitet buffert (> 12,5 mL per prov) och resuspension lösningen (> 1 mL).
- Om använder hypotonisk-mekaniska lysis, förbereda den hypoton lyseringsbuffert (> 5 mL per prov), HEB medium (> 5 mL per prov), låg sackaros buffert (> 3 mL per prov), sackaros densitet buffert (> 12,5 mL per prov), och resuspension lösningen (> 1 mL).
- Tillsätt 25 μL av Ditiotreitol (DTT) till 25 mL av låga sackaros buffert och en annan 25 μL av DTT 25 ml av sackaros täthet lutning bufferten precis innan protokollet.
- Täcka dissekera ytan med aluminium-folie för att minimera kontaminering av provet med fibrer från pappershanddukar eller bänk beskyddare, som kan täppa mikroflödessystem kanaler som används för att fånga enstaka kärnor.
- Spray dissekera verktyg och bänk utrymme med ett RNase sanering lösning. Dessutom, spraya insidan av Dounce Homogenisatorer röret (om du använder rengöringsmedel-mekaniska cellys) och Oak Ridge tube med RNase sanering lösning. Skölj ur Dounce och Oak Ridge röret med ultrarent, RNase-gratis vatten.
- Pre chill alla samling rör (50 mL konisk, Oak Ridge) och Dounce Homogenisatorer rör på is.
- Brand polska en serie av Pasteur-pipetter (om du använder hypotonisk-mekaniska cellys).
2. beredning av ryggmärgen
- Om du använder färsk vävnad, avliva musen av CO2 inandning. Efter eutanasi, spraya pälsen av musen med 70% etanol att minimera hår kontaminering i provet.
- Halshugga musen med skarpa och RNase-fria kirurgisk sax. Sedan försiktigt lyfta buken huden med pincett och gör ett snitt längs med kroppen för att exponera de inre organen.
- Rensning musen genom att dra de inre organen från kroppen hålighet med pincett. Använd inte pappershanddukar att rengöra området eller att ta bort organ som detta kan medföra föroreningar. Med sax, klippa ryggraden mellan L2 och L3 spinal kotorna.
Obs: Med övning, detta steg kan uppnås på mindre än 30 sekunder.- För att mata ut ryggmärgen, passa en 3 mL spruta innehåller iskall PBS med 25 G ¼ tum nål. Placera spetsen på nålen i sakrala slutet av kotpelaren. Använd två fingrar för att nypa kotorna för att skapa en tät förslutning runt spetsen av nålen och tryck ned kolven att mata ut ryggmärgen rostrally. Placera ryggmärgen i en petriskål med iskall PBS.
- Vid denna punkt, frysa vävnaden och förvaras vid-80 ° C eller använder omedelbart för antingen tvättmedel-mekaniska (steg 3) eller hypotoniska-mekaniska (Steg4) Lys.
- Om använda fryst vävnad, behålla vävnaden på torris, Fortsätt till tvättmedel-mekaniska (steg 3) eller hypotoniska-mekaniska (Steg4) Lys.
3. rengöringsmedel-mekaniska Cell Lysis
- Placera ländryggen ryggmärgen i en pre kylda Dounce Homogenisatorer och tillsätt 500 mL kylt pre tvättmedel lyseringsbuffert.
Obs: En mus ländryggen ryggmärgen är 325,5 mg ± 63,9 mg standardavvikelsen för medelvärdet (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g vävnad kan användas framgångsrikt. - Dounce med 5 slag av mortelstöten en ('Lös' mortelstöt), sedan 5-10 slag av mortelstöten B ('tight' mortelstöt). Undvik lyft homogenisatorn ut ur lysis lösningen mellan stroke och införa bubblor.
- Placera en 40 mm SIL över en pre kylda 50 mL koniska tub och prewet med 1 mL låg sackaros buffert.
- Tillsätt 1 mL låg sackaros buffert till den Dounce Homogenisatorer som innehåller obearbetade kärnor i lyseringsbuffert och blanda försiktigt genom pipettering 2 – 3 gånger.
- Passera det obearbetade kärnor prep över 40 mm silen i förväg kylda 50 mL koniska röret.
- Passera en ytterligare 1 mL låg sackaros buffert över 40 mm silen, föra den slutliga volymen 3 mL låg sackaros bufferten och 500 mL lyseringsbuffert.
- Upprepa steg 3.1 – 3.6 om att kombinera flera sladdar, sammanslagning i samma koniska rör.
- Centrifugera provet vid 3,200 x g under 10 minuter vid 4 ° C. När centrifugeringen är klar, Dekantera supernatanten. Fortsätt till steg 5.
4. hypotonisk-mekaniska Cell Lysis
- Placera ländryggen ryggmärgen i 5 mL av den hypoton lyseringsbuffert i en vävnadskultur maträtt. Använd den trubbiga änden våren sax Tudela ryggmärgen, sedan använda våren sax för att klippa sladden i 3 – 4 mm bitar, men inte skräda.
Obs: 50 mg – 1,5 g vävnad kan framgångsrikt användas. - Inkubera i isen för 15 min, virvlande 2 – 3 gånger.
- Tillsätt 5 mL av HEB medium att späda den hypoton lyseringsbuffert.
- Pulverisera vävnaden 10 gånger med 5 mL serologiska pipett, eller tills alla bitar av vävnad röra sig smidigt genom öppnandet av pipetten.
- Pulverisera med en serie av tre eld polerade Pasteur-pipetter med gradvis smalare diametrar (~ 900 – 600 mm).
- För varje pipett, hackad 5 - 15 gånger, tillåta vävnad att bosätta sig, avlägsna 1 – 2 mL av supernatanten innehållande dissocierade kärnor och passera över en 40 mm SIL i ett pre kylda 50 mL koniska rör.
- Efter sönderdelning med den minsta storlek Pasteur-pipetten, se till att Homogenatet flyter smidigt genom pipettspetsen. Passera den återstående lösningen över 40 mm silen i 50 mL koniska röret.
Obs: Det totala antalet triturations kan justeras efter behov. Hjärnhinnorna av mus ryggmärgen kommer att förbli, men det är viktigt att pulverisera några synliga bitar av ryggmärgen. Passera återstående Homogenatet över 40 m Silen. Undvika att införa bubblor under sönderdelning.
- Centrifugera filtrerade provet vid 1 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. När centrifugeringen är klar, Dekantera och kasta bort supernatanten. Fortsätt till steg 5.
5. homogenisering och sackaros täthetlutning
- Efter steg 3 eller 4, återsuspendera pelleten med 3 mL låg sackaros buffert. Snurra försiktigt ta bort pelleten från väggen för att underlätta resuspension. Låt provet sitta på is i 2 min och överför till en Oak Ridge röret.
- Använder homogenisatorn vid inställning 1, homogenisera atomkärnor i låg sackaros buffert för 15 – 30 s, att hålla provet på is.
Obs: Använd 15 s om använder en ländryggen ryggmärgen eller 30 s om använder poolade prover eller en hela ryggmärgen. - Med serologisk pipett lager 12,5 mL densitet sackaros buffert under låg sackaros buffert Homogenatet, noga med att inte skapa en bubbla som stör densitet lagren.
- Centrifugera rören vid 3,200 x g i 20 min vid 4 ° C.
- När centrifugeringen är klar, omedelbart Dekantera supernatanten i en snärta rörelse.
Obs: En residualvolym (mindre än 400 mL) av sackaros buffert kan kastas om så önskas att producera en lägre volym och renare slutligt prov, men denna residualvolym innehåller kärnor och kan bevaras för att maximera atomkärnor avkastning. - Använda 100 mL - 1 mL resuspension lösning, resuspendera kärnorna kvar på väggen. Undvika den myelin 'rynka pannan' som återstår med diskmedel-baserade förberedelsen.
- Filtrera atomkärnor genom en 30 – 35 mm porstorlek sil och samla i en pre kyld tub.
- Bestämma atomkärnor avkastning med hjälp av en hemocytometer för att räkna atomkärnor under ett 10 X-objektiv.
Obs: Trypan blå kan läggas för att visualisera kärnor, som bör visas blå. Notera mängden cellulära skräp. - Gå vidare till steg 6 eller 7.
6. massivt parallella snRNA-sekvensering: akademiska plattform7
- Utföra den massivt parallella snRNA-sekvenseringen (t.ex., Drop-Seq) metod som tidigare beskrivits7 med följande ändringar:4
- Justera kärnor till en slutlig koncentration av 225 kärnor per mL.
- Förbereda barcoded pärlor med en koncentration på 250 pärlor per mL.
- Förbereda lyseringsbuffert med 0,7% sarkosyl.
- Justera flödesvärden 35 ml per min för pärlor, 35 mL per minut för kärnor och 200 mL per minut för olja.
7. massivt parallella snRNA-sekvensering: kommersiella plattform26
- Utföra massivt parallella snRNA-sekvensering använder kommersiella plattform (t.ex., krom enda Cell Gene Expression lösning) produkter enligt tillverkarens instruktioner26 med följande ändring:
- Efter omvänd-Transkription, lägga till en ytterligare PCR-cykel det beräknade antalet cykler för cDNA förstärkning utifrån riktade cell återhämtningen att kompensera för minskad cDNA från kärnor jämfört med celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här, utfört vi isolering av kärnor från vuxen mus ländryggen ryggmärgen för nedströms massivt parallella RNA-sekvensering. Protokollet inblandade tre huvudkomponenter: vävnad störningar och cellulär Lys, homogenisering och sackaros densitet centrifugering (figur 1). Inom sekunder gav tvättmedel-mekaniska Lys en rå atomkärnor preparationen med ett stort antal kärnor samt cellulär och vävnad skräp (figur 2Atabell 2). Efter femton minuter gav hypoton-mekaniska Lys en rå atomkärnor preparat som hade mindre skräp, men också färre kärnor (figur 2Btabell 2). Båda preparat genomgick homogenisering (figur 2 c och D) och sackaros täthet lutning centrifugering före återsuspension i PBS med 0,04% BSA (figur 2E och F). I genomsnitt, en mus ländryggen ryggmärgen (325,5 mg ± 63,9 mg standardavvikelsen för medelvärdet, SEM, N = 4) gav 5,1 x 105 kärnor (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) följande rengöringsmedel-mekaniska Lys och 2,0 x 105 kärnor (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) efter hypotonisk-mekaniska Lys. Antalet kärnor i ländryggen ryggmärgen uppskattades från första rå förberedelse efter Dounce homogenisering i tvättmedel-mekaniska lysis protokoll (2.6 x 106 kärnor ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, tabell 2). Det slutliga provet från tvättmedel-mekaniska lysis protokoll består av 20% av den ursprungliga kärnan (± 2% SEM, N = 3, tabell 2). Obearbetade kärnor preparatet från hypotonisk-mekaniska Lys efter sönderdelning innehåller 62% av den ursprungliga kärnan (± 2% SEM, N = 3, tabell 2). Slutliga hypotonisk-mekaniska lysis provet innehåller endast 8% av inledande atomkärnor (± 1% SEM, N = 3, tabell 2). Vi inte upptäcka någon skillnad i den totala RNA avkastningen eller cDNA avkastningen för en städning gen (Gapdh) mellan de två beredningsmetoder. Metoden tvättmedel använder qPCR, och gav 463,7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) av total-RNA och ett genomsnittligt tröskelvärde identifieringscykel av 25,2 (± 1,3 SEM) för Gapdh cDNA som qPCR och hypoton metoden gav 419,2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) av total-RNA och genomsnittliga upptäckt tröskelvärden cykeln av 26,1 för Gapdh cDNA (± 0,8 SEM). Två LYS-alternativ både isolera kärnor från svårt-att-ta avstånd vävnader och ger högkvalitativa material för den efterföljande singeln-nucleus RNA-sekvenseringen.
Med tanke på mikroflödessystem kanaler storlek för nedströms massivt parallella enda nucleus sekvensering plattformar, är det viktigt att mata in en atomkärnor suspension utan stora partiklar, eller cellulära skräp att förhindra igensättning. Efter protokollet presenteras här, fanns det inga instanser av igensättning på plattform anpassad från Macosko et al. 2015 (N = 17) och en delvis täppa på kommersiella plattform (N = 16).
Tvättmedel-mekaniska och hypoton-mekaniska förfaranden användes för att isolera atomkärnor framgångsrikt för två massivt parallella droplet inkapsling plattformar och representativa resultat visas i figur 3. Båda dessa metoder aktiverat transkriptionell profilering av tusentals kärnor och klassificering av celltyper i vuxen mus ländryggen ryggmärgen (figur 3). 4 dessa tillvägagångssätt resulterat i jämförbara gener per kärna för varje celltyp (figur 3 c och D). Täckningsgraden av ingående atomkärnor mellan två plattformar skiljer sig åt. Plattformen anpassad från Macosko et al. 2015 med ändringar från Rickards o.a. 2018 återhämtade sig uppskattningsvis 0,59% av atomkärnor (± 0,05% SEM, N = 17), medan den kommersiella plattformen återvinns en uppskattad 53,7% kärnor (N = 2).
Detta protokoll berikar något för neuronal kärnor i den slutliga beredningen. I ländryggen ryggmärgen vävnadssnitt, fann vi att 27% av atomkärnor var positiva för neuronal markören NeuN (N = 7,368 kärnor från 2 djur), medan rengöringsmedel-mekaniska atomkärnor beredning av ländryggen ryggmärgen resulterade i 31,9% av totala atomkärnor att uttrycka NeuN, som bestäms av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS, ± 2,0% SEM, N = 13 oberoende atomkärnor förberedelser använda samlingsprover från flera djur varje förberedelse, figur 4). Detta är liknande till vad har observerats tidigare för procent av NeuN-positiva kärnor i hela ryggmärgen (20% till 24% beroende på ålder),27 inklusive hals och bröstkorg regioner som har fler vit substans och oligodendrocyter. Notera, NeuN/Rbfox3 uttrycks inte i alla neuroner och, följaktligen, dessa siffror är sannolikt blygsamma underskattningar. Det är möjligt att mindre icke-neuronala celler något tar slut under sackaros gradient rening. Dessutom nedströms parametrar för filtrering och analys efter sekvensering kan förändra sista cell-typen distribution eftersom nervceller har fler gener per kärna (figur 3 c och D) och, därför, är mindre benägna att tas bort under filtreringsprocessen.
I området i närheten finns det flera viktiga steg i detta protokoll som kräver vård. Första, överdriven douncing eller trituration (i steg 3 eller 4, respektive) kan leda till en ökning av cellulära skräp och partiklar bildas. Även filtrering och sackaros densitet centrifugering kan separera stora partiklar, när små partiklar genereras under Lys, är de svåra att avlägsna. För det andra under homogenisering, placera inte homogenisatorn direkt på botten av Oak Ridge röret. Istället, sänk slutet av homogenisatorn till låga sackaros lösningen innehållande återsuspenderade kärnor, utan att röra botten av röret. Homogenisering förbättrar nukleära isolering genom att ta bort cellulära skräp och minska klumpar och multiplets (figur 5). Efter sackaros densitet centrifugering är det viktigt att omedelbart ta bort Oak Ridge röret från centrifugen och snabbt Dekantera supernatanten i en snabb 'snärta' rörelse. När omblandning kärnor från väggen i Oak Ridge röret, Återsuspendera 'salta' pelleten från halvvägs mellan myelin bandet och botten av röret. Observera att pelleten kan vara synliga. Omblandning kärnor högre längs röret kan resultera i myelin kontaminering i atomkärnor preparatet. I Lys och sackaros densitet centrifugering steg är de mest kritiska till att minska partiklar som kan täppa till mikroflödessystem kanaler för efterföljande ansökan.
| Namnet på Material / utrustning | Beståndet koncentration | Slutlig koncentration | Volym / belopp |
| Rengöringsmedel lyseringsbuffert | |||
| Låg sackaros buffert | - | - | 600 ΜL |
| Triton-X | 20% | 0,10% | 3 ΜL |
| Hypoton lyseringsbuffert | |||
| Tris-HCl (pH = 7.4) | 1 M | 10 mM | 100 ΜL |
| NaCl | 5 M | 10 mM | 20 ΜL |
| MgCl2 | 1 M | 3 mM | 30 ΜL |
| Nonidet P40 | - | 0,01% | 1 ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | upp till 10 mL | ||
| HEB Medium | |||
| Övervintra-A | - | - | 10 mL |
| Glutamax | - | - | 100 ΜL |
| B27 | - | - | 200 ΜL |
| Låg sackaros buffert | |||
| Sackaros | - | 0.32 M | 2,75 g |
| HEPES (pH = 8,0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| CaCl2 | 1 M | 5 mM | 125 ΜL |
| MgAc | 1 M | 3 mM | 75 ΜL |
| EDTA | 0,5 M | 0,1 mM | 5 ΜL |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | upp till 25 mL | ||
| Sackaros densitet buffert | |||
| Sackaros | - | 1 M | 8,6 g |
| HEPES (pH = 8,0) | 1 M | 10 mM | 250 ΜL |
| MgAc | 1 M | 3 mM | 75 ΜL |
| DTT | 1 M | 1 mM | 25 ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | upp till 25 mL | ||
| Resuspension lösning | |||
| 1 X PBS | - | - | 1 mL |
| BSA | 20 mg/mL | 0,4 mg/mL | 20 ΜL |
| RNAse Inhibitor | 40 U/ΜL | 0,2 U/ΜL | 5 ΜL |
Tabell 1: Tabell över lösningar.
| Råolja | Homogeniserad | Slutliga | |
| Tvättmedel-mekaniska | 100 ± 15% | 87 ± 9% | 20 ± 2% |
| Hypotonisk-mekaniska | 62 ± 12% | 35 ± 4% | 8 ± 1% |
Tabell 2: avkastning av atomkärnor vid varje steg i protokollet. Antalet kärnor i inledande rå preparatet efter dounce homogenisering i tvättmedel-mekaniska lysis protokoll användes för att uppskatta antalet kärnor i ländryggen ryggmärgen. Den inledande kärnan avkastning (2.6 x 106 kärnor ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) användes för att beräkna atomkärnor avkastning vid varje efterföljande steg för båda tvättmedel - och hypoton-mekaniska lysis protokoll. Antalet kärnor som isolerats av hypoton-mekaniska preparatet var normaliserade till uppskattade inledande kärnor. Värdena i tabellen är medelvärde ± SEM, N = 3.
Figur 1: Schematisk av nukleära isolering. Kärnor från vuxna ryggmärgen kan isoleras med tvättmedel-mekanisk eller hypotoniska-mekaniska cellys, följt av homogenisering och sackaros täthet lutning centrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant brightfield och DAPI-färgade kärnor på viktiga steg i protokollet. (A, B) råolja kärnor efter tvättmedel-mekanisk eller hypotoniska-mekaniska lysis. (C, D) Atomkärnor efter homogenisering. (E, F) Atomkärnor resuspended i PBS med 0,04% BSA efter sackaros densitet centrifugering. Atomkärnor var fast med 2% PARAFORMALDEHYD och därefter målat med Trypan blå eller DAPI. Bilder togs på 10 X (skalstapeln = 100 µm) med hjälp av brightfield och påljusfluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representant tSNE tomt på sekvenserade kärnor: använda tvättmedel-mekaniska och hypoton-mekaniska lysis. (A) resultat från sekvensering över 17000 kärnor från dissekerade vuxen mus ländryggen ryggmärgen efter tvättmedel-mekaniska lysis och enligt Macosko et al. 2015 med ändringar från Rickards o.a. 2018. denna siffra har modifierats med tillstånd från Rickards o.a. 2018.4 (B) resultaten från sekvensering 5.000 kärnorna från utkastade vuxen ländryggen ryggmärgen efter hypotonisk-mekaniska lysis och en kommersiell mikroflödessystem enda cell inkapsling plattform. 26 (C, D) genomsnittliga gener per kärna resultat genom klustring av stora celltyper i vuxen mus ryggmärgen ± SEM. Notera, tvättmedel-mekaniska lysis förfarandet följt av Macosko et al. 2015 plattform utfördes med hjälp av dissekerade ländryggen ryggmärgen, medan hypotonisk-mekaniska Lys följt av den kommersiella plattformen utfördes med hjälp av utkastade ländryggen ryggmärgen (som beskrivs i detta protokoll). Med tanke på att mata ut sladden tar bort dura och dorsala rotganglier, meningeal/Schwann cell klustret är frånvarande från figur 3B och D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FACS tomt på NeuN+ kärnor efter tvättmedel-mekaniska lysis. FACS tomt visar fasta kärnor färgas för NeuN (genomsnitt 31,9% av totala atomkärnor ± 2,0% SEM, N = 13), isolerade med tvättmedel-mekaniska Lys-protokollet. För den direkta upptagningen, kärnor för FACS validering, erhölls en rå atomkärnor beredning av dounce homogenisering av ryggmärgen som använder tvättmedel-mekaniska preparatet, följt av omedelbar fixering med 1% PFA med en 5 min inkubationstid. Fixering var kylda med 250 mM glycin och atomkärnor samlades. Färgning med anti-NeuN antikropp utfördes i lösning. FACS utfördes på fast, NeuN missfärgade kärnor använder en cell sorterare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kärnor beredning utan homogenisering. Atomkärnor var resuspended före sackaros densitet centrifugering efter A tvättmedel-mekanisk eller B hypotonisk-mekaniska Lys, utan homogenisering. * Betecknar cellulära skräp bifogas atomkärnor (A) och en multipleten av atomkärnor knutna av cellulära skräp (B). Atomkärnor resuspended i PBS med 0,04% BSA efter sackaros densitet centrifugering. Atomkärnor var fast med 2% PARAFORMALDEHYD och därefter målat med Trypan blå eller DAPI. Bilder togs på 10 X (skala bar 100 µm) med hjälp av brightfield och påljusfluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det slutliga målet med detta protokoll är att isolera atomkärnor som innehåller högkvalitativa RNA för nedströms transkriptionell analys. Vi anpassat snRNA-Seq metoder för att profilera alla celltyper i ryggmärgen. Vi hittade inledningsvis att typiska cell dissociation metoder var ineffektivt för enstaka cell RNA sekvensering, som ryggmärgen nervceller är särskilt utsatta för celldöd. Dessutom inducerar cell dissociation metoder uttryck av olika aktivitet och stress-och svar gener av upp till flera hundrafaldigt. 3 , 4 , 16 med tanke på de nackdelar som är förknippade med enstaka cell preparaten, har vi och andra använt atomkärnor som ett alternativ. 16 , 17 , 18 , 24 denna metod kan även användas på mänsklig vävnad, inklusive frysta ryggmärgsvävnad. 4 , 19 , 24 här, vi kommer att beskriva styrkor och begränsningarna med denna metod.
Styrkor av denna metod inkluderar undvikande av experimentellt inducerad IESG samt möjligheten att använda både färsk och fryst vävnad. 4 således detta tillvägagångssätt kan vara användbar för avsökning av endogena IESG efter en beteende eller stimulans. 1 , 3 , 4 en av fördelarna med denna metod är att det inte kräver specialiserade enheter för utnyttjande av kärnor för massivt parallella enda nucleus sekvensering, men kan använda den plattform som utvecklats av Macosko et al. 2015, med mindre justeringar av lysis buffert och flow rate, eller använda kommersiellt tillgängliga system. Dessutom är enda nucleus sekvensering visat sig vara en jämförbar metod som enda cell sekvensering för identifiering av celltyper, utlåning till styrkan i denna strategi. 28 , 29 men det finns flera viktiga begränsningarna med denna metod. Atomkärnor innehålla cirka 20-50% av cellulära mRNA, avspeglas29 och detta i ett lägre antal utskrifter per kärna jämfört enda cell sekvensering. 18 , 29 inklusive intronic läsningar från snRNA-Seq är ett sätt att öka antalet upptäckta gener.
I området i närheten finns det flera tillgängliga protokoll som möjliggör isolering av kärnor från vävnad. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 i jämförelse med de flesta andra metoder, de protokoll som presenteras här inte kräver myelin borttagning, ultracentrifugering, eller många centrifugering steg eller tvättar som kan leda till lägre sista nummer av atomkärnor. Dessutom tar detta protokoll 45 min (tvättmedel-mekanisk) eller 1 timme (hypotoniska-mekanisk) att slutföra. Kommersiella protokoll som stöds på mikroflödessystem plattformar är mer än dubbelt så lång tid, och kräver många fler centrifugering åtgärder, ökar risken att förlora atomkärnor. I motsats till atomkärnor isolering protokoll som involverar endast lysis och filtrering, inkluderar de metoder som presenteras här en sackaros övertoning för att öka renheten av den slutliga kärnan. Det här steget krävs för vuxna ryggmärgsvävnad på grund av den stora andelen vit substans och det resulterande myelin skräpet.
Tvättmedel-mekaniska lysis protokoll kan användas för komplett vävnad dissociation och lysis och hypotonisk-mekaniska lysis protokoll kan användas för att kontrollera mängden vävnad dissociation och cellulära skräp tillåtet i programmet nedströms. Dessa protokoll kan användas för bio-bank material, svårt att sära på vävnader och för utredning av aktivitet-beroende transkriptionell förändringar genom isolering av kärnor för nedströms massivt parallella snRNA-följande punkter Utöver massivt parallella enda nucleus RNA-sekvensering användas detta protokoll att isolera kärnor för alternativa tillämpningar, inklusive immunofluorescens och FACS och epigenetiska analyser såsom DNA metylering studier och ChIP-Seq (figur 4 ). 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av intramurala programet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) och NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi tackar L. Li och C.I. Dobrott för deras teknisk support och bra diskussioner, och C. Kathe för granskning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 mL) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
Tags
Neurovetenskap fråga 140 kärnor RNA sekvensering snRNA-Seq massivt parallella ryggmärgen sackaros övertoningErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
