Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58413
Automatic Translation
1, 1, 2, 3,4, 3, 1
1Spinal Circuits and Plasticity Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Bioinformatics Section, Information Technology Program, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Laboratory of Cochlear Development, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, 4Single Cell Analysis Facility, Frederick National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at hurtigt isolere høj kvalitet kerner fra frisk eller frossen væv til downstream massivt parallel RNA sekvensering. Vi medtager vaskemiddel-mekaniske og hypotonic-mekaniske væv forstyrrelser og celle lysis muligheder, som begge kan bruges til isolering af kerner.

Abstract

Sondering en enkelt celle genekspression muliggør identifikation af celletype og celle stat. Encellede RNA sekventering fremstod som et effektivt redskab til at studere transcriptional profiler af celler, især i heterogen væv som det centrale nervesystem. Dog kan dissociation metoder kræves til enkelt celle sekvensering føre til eksperimentelle ændringer i gen expression og celle død. Desuden, disse metoder er generelt begrænset til frisk væv, hvilket begrænser undersøgelser på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kerne RNA sekventering (snRNA-FF.) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, givet at det præcist identificerer celletyper, tillader undersøgelse af væv, der er frosne eller vanskeligt at adskille, og reducerer dissociation-induceret transskription. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed protokol for hurtige isolering af kerner til downstream snRNA-FF. Denne metode gør det muligt for isolation af kerner fra frisk eller frossen rygmarven prøver og kan kombineres med to massivt parallel droplet indkapsling platforme.

Introduction

Nervesystemet består af heterogene grupper af celler, der viser en bred vifte af morfologiske, biokemiske og elektrofysiologiske egenskaber. Mens hovedparten RNA sekventering har været nyttig til bestemmelse af væv-wide ændringer i genekspression under forskellige betingelser, det er til hinder påvisning af transcriptional ændringer på én celle-niveau. Seneste fremskridt inden for en enkelt celle transcriptional analyse har aktiveret klassificering af heterogene celler i funktionelle grupper baseret på deres molekylære repertoire og endda være gearede til at opdage sæt af neuroner, der havde været aktive for nylig. 1 , 2 , 3 , 4 i de sidste ti år, udviklingen af enkelt celle RNA sekventering (scRNA-FF.) har aktiveret studier af genekspression i individuelle celler, hvorfra der er udsigt til celletype mangfoldighed. 5

Fremkomsten af skalerbare metoder såsom massivt parallel scRNA-FF., har givet platforme til sekvens heterogen væv, herunder mange områder i det centrale nervesystem. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkelt celle dissociation metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle ændringer i genekspression. 16 seneste arbejde har tilpasset enkelt celle sekventering metoder for at aktivere bevarelse af endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategier har været særligt velegnet til påvisning af umiddelbar tidlig gen (IEG) udtryk efter sensorisk stimulus eller adfærd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategi kunne også bruges til at studere dynamiske ændringer i væv i sygdomstilstande eller som reaktion på stress. Af disse metoder, enkelt kerne RNA sekventering (snRNA-FF.) er en lovende tilgang, der involverer ikke stress-fremkaldende celle dissociation og kan bruges på svært at adskille væv (såsom rygmarv), såvel som frosne væv. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted fra tidligere kerner isolation metoder,20,21,22,23,25 snRNA-Seq typisk udnytter hurtige væv forstyrrelser og celle lysis under kolde forhold, centrifugering og adskillelsen af kerner fra celleaffald. 4 kerner kan isoleres til den downstream næste generations sekvensering på flere mikrofluid droplet indkapsling platforme. 4 , 7 , 24 , 25 denne metode giver mulighed for et øjebliksbillede af det transkriptionel aktivitet af tusindvis af celler på et tidspunkt.

Der er flere strategier for at frigive kerner fra celler før isolation og sekventering, hver med deres egne fordele og ulemper. Her, vi beskrive og sammenligne to protokoller for at aktivere isolering af kerner fra voksen rygmarven til den downstream massivt parallel snRNA-Seq: vaskemiddel-mekaniske lysis og hypotonic-mekaniske lysering. Vaskemiddel-mekaniske lysis giver komplet væv forstyrrelser og en højere endelige udbytte af kerner. Hypotonic mekanisk-lysis omfatter en kontrollerbar grad af afbrydelse af væv, give mulighed for at vælge en balance mellem mængde og renhed af det endelige nukleare udbytte. Disse metoder giver tilsvarende RNA udbytte, fundne antal gener per kerne, og celletype profilering og også kan begge bruges med succes til snRNA-FF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af det nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde Animal Care og brug udvalg. Afbalanceret prøver af mandlige og kvindelige ICR/CD-1 wild-type mus, mellem 8 og 12 uger gamle, blev brugt til alle eksperimenter. Mus skal håndteres i overensstemmelse med lokale retningslinjer for institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. forberedelse af materialer og buffere

  1. Forberede alle buffere dag af brug og pre chill på is (Se tabel 1).
    1. Hvis bruger vaskemiddel-mekaniske lysis, forberede vaskemiddel lysisbuffer (> 500 μL per prøve), lav saccharose buffer (> 6 mL pr. prøve), saccharose tæthed buffer (> 12,5 mL pr. prøve) og resuspension løsning (> 1 mL).
    2. Hvis bruger hypotonic-mekaniske lysis, forberede hypotonic lysisbuffer (> 5 mL pr. prøve), HEB medium (> 5 mL pr. prøve), lav saccharose buffer (> 3 mL per prøve), saccharose tæthed buffer (> 12,5 mL pr. prøve), og resuspension løsning (> 1 mL).
    3. Tilsættes 25 μL dithiothreitol (DTT) til 25 mL af den lave saccharose buffer og en anden 25 μL af DTT til 25 mL af saccharose tæthed gradient buffer lige før protokollen.
  2. Dække dissekere overfladen med aluminiumsfolie at minimere kontaminering af prøven med fibre fra papirhåndklæder eller bænk beskyttere, der kan tilstoppe mikrofluid kanaler bruges til at indfange enkelt kerner.
  3. Spray dissekere værktøjer og bænk plads med en RNase dekontaminering løsning. Derudover spray inde i Dounce homogeniseringsapparat tube (hvis du bruger vaskemiddel-mekaniske celle lysis) og Oak Ridge rør med en RNase dekontaminering løsning. Skylle ud Dounce og Oak Ridge røret med ultrarent, RNase-fri vand.
  4. Pre chill alle indsamling rør (50 mL konisk, Oak Ridge) og Dounce homogeniseringsapparat rør på is.
  5. Brand polsk en serie af Pasteur pipetter (hvis du bruger hypotonic-mekaniske celle lysis).

2. forberedelse af rygmarven

  1. Hvis du bruger frisk væv, aflive mus af CO2 indånding. Efter eutanasi, spray frakke af musen med 70% ethanol at minimere hår forurening i prøven.
  2. Halshugge musen med skarpe, RNase-fri kirurgisk saks. Derefter forsigtigt løfte den abdominale hud med pincet og gøre et snit langs længden af kroppen til at afdække de indre organer.
  3. Rense musen ved at trække de indre organer fra kroppen hulrum med pincet. Brug ikke papirhåndklæder til at rense området eller til at fjerne organer, som dette kan indføre forurenende stoffer. Brug saks, skåret rygsøjlen mellem L2 og L3 spinal ryghvirvler.
    Bemærk: Med praksis, dette trin kan nås på mindre end 30 sekunder.
    1. Du skubber rygmarven, passe en 3 mL sprøjte indeholdende iskold PBS med en 25 G ¼ tommer nål. Placer spidsen af nålen ind i den sakrale ende af rygsøjlen. Brug to fingre til at knibe ryghvirvler for at skabe en tæt forsegling omkring spidsen af nålen og tryk ned på stemplet til at skubbe rygmarven rostrally. Placer rygmarven i en petriskål med iskold PBS.
    2. På dette tidspunkt, fryse væv og opbevares ved-80 ° C eller bruger straks til enten vaskemiddel-mekanisk (trin 3) eller hypotonic-mekanisk (trin 4) lysering.
  4. Hvis du bruger frossen væv, opretholde væv på tøris, fortsætte til vaskemiddel-mekanisk (trin 3) eller hypotonic-mekanisk (trin 4) lysering.

3. vaskemiddel-mekaniske celle Lysis

  1. Placer lumbal rygmarven i en pre kølet Dounce homogeniseringsapparat og tilføje 500 mL pre kølet vaskemiddel lysisbuffer.
    Bemærk: En mus lumbal rygmarven er 325.5 mg ± 63.9 mg standardfejl af middelværdien (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g væv kan bruges med succes.
  2. Dounce med 5 slag af pistil en ('løs' pistil), derefter 5-10 slag af pistil B ('stram' pistil). Undgå at løfte homogeniseringsapparat ud af lysis løsning i mellem streger og undgå at indføre bobler.
  3. Placer en 40 mm si over en pre kølet 50 mL konisk rør og prewet med 1 mL af lav saccharose buffer.
  4. Der tilsættes 1 mL af lav saccharose buffer til Dounce homogeniseringsapparat der indeholder de rå kerner i lysisbuffer og bland forsigtigt af pipettering 2 – 3 gange.
  5. Pass rå kerner prep over 40 mm sien i pre kølet 50 mL konisk tube.
  6. Passere en yderligere 1 mL lav saccharose buffer over 40 mm si, at bringe de endelige mængden til 3 mL af den lave saccharose buffer og 500 mL af lysisbuffer.
  7. Gentag trin 3.1 – 3.6 Hvis kombinerer flere snore, pooling i den samme koniske rør.
  8. Centrifugeres prøve på 3.200 x g i 10 min. ved 4 ° C. Når centrifugeringen er færdig, dekanteres supernatanten. Fortsæt til trin 5.

4. hypotonic-mekaniske celle Lysis

  1. Sted lumbal rygmarven i 5 mL af hypotonic lysisbuffer i en vævskultur parabol. Brug den stumpe ende af foråret saks til at gennemskære rygmarven, så brug foråret saks til at klippe ledningen i 3 – 4 mm stykker, men ikke hakkekød.
    Bemærk: 50 mg – 1,5 g væv kan med held anvendes.
  2. Der inkuberes i isbad i 15 min, hvirvlende 2 – 3 gange.
  3. Der tilsættes 5 mL af HEB medium til at fortynde hypotonic lysisbuffer.
  4. Hakkede væv 10 gange med 5 mL serologisk pipette, eller indtil alle stykker af vævet bevæger sig jævnt gennem åbningen af en pipette.
  5. Hakkede med en serie af tre brand-poleret Pasteur pipetter med gradvis smallere diametre (~ 900 – 600 mm).
    1. Hver pipette, hakkede 5 - 15 gange, tillade væv til at bosætte sig, fjerne 1-2 mL af supernatanten indeholdende dissocierede kerner og passere over en 40 mm si ind en pre kølet 50 mL konisk slange.
    2. Efter ændring med den mindste størrelse Pasteur pipette, sikre at homogenatet flyder jævnt gennem pipette tip. Passere den resterende løsning over 40 mm si ind i 50 mL konisk rør.
      Bemærk: Det samlede antal triturationer kan tilpasses som ønsket. Hjernehinden for musen rygmarven vil fortsat være, men det er vigtigt at hakkede nogen synlige bidder af rygmarven. Passere den resterende homogenatet over 40 m si. Undgå at indføre bobler under ændring.
  6. Centrifugeres filtrerede prøven på 1.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Når centrifugeringen er fuldført, dekanteres og supernatanten. Fortsæt til trin 5.

5. homogenisering og saccharose tæthed farveforløb

  1. Efter trin 3 eller 4, resuspenderes med 3 mL af lav saccharose buffer. Forsigtigt hvirvel for at fjerne toerstoffet fra væggen for at lette ophvirvling. Lad prøven sidde på is i 2 min. og overføre suspension til en Oak Ridge tube.
  2. Ved hjælp af homogeniseringsapparat på indstilling 1, homogeniseres kerner i lav saccharose buffer for 15 – 30 s, at holde prøve på is.
    Bemærk: Brug 15 s hvis bruger en lumbal rygmarven eller 30 s hvis bruger Puljet prøver eller en hel rygmarven.
  3. Ved hjælp af en serologisk pipette, lag 12,5 mL af tæthed saccharose buffer under lav saccharose buffer homogenatet, pas på ikke for at skabe en boble, der forstyrrer tæthed lag.
  4. Centrifugeres rør på 3.200 x g i 20 min. ved 4 ° C.
  5. Når centrifugeringen er færdig, straks dekanteres det i en flicking bevægelse.
    Bemærk: En residualvolumen (mindre end 400 mL) af saccharose buffer kan kasseres, hvis det ønskes at producere en lavere volumen og renere slutprøven, men denne residualvolumen indeholder kerner og kan bevares for at maksimere kerner udbytte.
  6. Bruger 100 mL - 1 mL af resuspension løsning, resuspend kerner resterende på væggen. Undgå myelin 'panderynken' der er fortsat med vaskemiddel-baseret forberedelse.
  7. Atomkerner der filtreres på en 30-35 mm porestørrelse si og indsamle i en pre kølet tube.
  8. Bestemme kerner udbytte ved hjælp af en hemocytometer til at tælle kerner under en 10 X mål.
    Bemærk: Trypan blå kan tilføjes for at visualisere kerner, som bør vises blå. Bemærk mængden af celleaffald.
  9. Fortsæt til trin 6 eller 7.

6. massivt Parallel snRNA-sekventering: akademisk Platform7

  1. Udføre massivt parallel snRNA Sekventeringen (f.eks., Drop-Seq) metode som tidligere beskrevet7 med følgende ændringer:4
    1. Justere kerner til en endelig koncentration på 225 kerner pr. mL.
    2. Forberede barcoded perler i en koncentration på 250 perler pr. mL.
    3. Forberede lysisbuffer med 0,7% sarkosyl.
    4. Justere strømningshastigheder til 35 mL pr. min til perler, 35 mL / min for kerner og 200 mL / min for olie.

7. massivt parallel snRNA-sekventering: kommerciel Platform26

  1. Udføre massivt parallel snRNA-sekventering ved hjælp af kommerciel platform (f.eks.chrom enkelt celle gen Expression løsning) produkter i overensstemmelse med producentens instruktioner26 med følgende ændring:
    1. Efter reverse-transskription, skal du tilføje en ekstra PCR cyklus med det beregnede antal cyklusser for cDNA forstærkning baseret på målrettede celle opsving til at kompensere for nedsat cDNA fra kerner i forhold til cellerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her, udført vi isolering af kerner fra voksne mus lumbal rygmarven til downstream massivt parallel RNA sekvensering. Protokollen involveret tre hovedkomponenter: væv forstyrrelser og cellulære lysis, homogenisering og saccharose tæthed centrifugering (figur 1). Inden for sekunder viste vaskemiddel-mekaniske lysis en rå kerner forberedelse med et stort antal kerner samt cellulære og væv vragrester (figur 2Atabel 2). Efter femten minutter viste hypotonic-mekaniske lysis en rå kerner forberedelse, der havde mindre snavs, men også færre kerner (figur 2Btabel 2). Begge præparater undergik homogenisering (figur 2 c og D) og saccharose tæthed gradient centrifugering før resuspension i PBS med 0,04% BSA (figur 2E og F). På et gennemsnit, en mus lumbal spinal cord (325.5 mg ± 63.9 mg standardfejl af middelværdien, SEM, N = 4) givet 5.1 x 105 kerner (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) følgende vaskemiddel-mekaniske lysis og 2.0 x 105 kerner (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) efter hypotonic-mekaniske lysering. Antallet af kerner i lumbal rygmarven blev anslået fra den oprindelige rå forberedelse efter Dounce homogenisering i vaskemiddel-mekaniske lysis protokol (2,6 x 106 kerner ± 4,0 x 105 SEM, N = 3, tabel 2). Den endelige prøve fra vaskemiddel-mekaniske lysis protokollen består af 20% af de oprindelige kerner (± 2% SEM, N = 3, tabel 2). Rå kerner forberedelse fra hypotonic-mekaniske lysis efter ændring indeholder 62% af de oprindelige kerner (± 2% SEM, N = 3, tabel 2). Den endelige hypotonic-mekaniske lysis prøve indeholder kun 8% af den oprindelige kerner (± 1% SEM, N = 3, tabel 2). Vi ikke påvise nogen forskel i den samlede RNA udbytte eller cDNA afkastet for en husholdning gen (Gapdh) mellem to præparationsmetoder. Ved hjælp af qPCR metoden vaskemiddel givet 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) af total RNA og en gennemsnitlig påvisning tærskel cyklus af 25,2 (± 1.3 SEM) for Gapdh cDNA af qPCR og metoden hypotonic givet 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) af total RNA og en gennemsnitlig påvisningsgrænse cyklus af 26,1 for Gapdh cDNA (± 0,8 SEM). De to lysis muligheder både isolere kerner fra vanskeligt at adskille væv og giver høj kvalitet materiale til den downstream enkelt-kerne RNA sekvensering.

I betragtning af størrelsen af mikrofluid kanaler for downstream massivt parallel enkelt kerne sekventering platforme, er det afgørende at input en kerner suspension fri for store partikler eller celleaffald at forhindre tilstopning. Efter den protokol, der præsenteres her, var der ingen forekomster af tilstopning på platformen tilpasset fra Macosko et al. 2015 (N = 17) og et delvis træsko på kommerciel platform (N = 16).

De detergent-mekaniske og hypotonic-mekaniske procedurer blev brugt til at isolere kerner held for to massivt parallel droplet indkapsling platforme og repræsentative resultater er vist i figur 3. Begge disse tilgange aktiveret, transcriptional profilering af tusindvis af kerner og klassificering af celletyper i voksen mus lumbal rygmarven (figur 3). 4 disse tilgange resulterede i sammenlignelige gener per kerne for hver celletype (figur 3 c og D). Satserne for nyttiggørelse af input kerner mellem de to platforme varierer. Platformen tilpasset fra Macosko et al. 2015 med ændringer fra sothees et al. 2018 genvundet en anslået 0,59% af kerner (± 0,05% SEM, N = 17), mens den kommercielle platform kommet en anslået 53.7% kerner (N = 2).

Denne protokol beriger lidt for neuronal kerner i den endelige forberedelse. I lænde rygmarven væv sektioner, fandt vi, at 27% af kerner var positive for den neuronale markør NeuN (N = 7,368 kerner fra 2 dyr), mens vaskemiddel-mekaniske kerner forberedelse af lumbal rygmarven resulterede i 31,9% af samlede kerner udtrykker NeuN, som fastlagt af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS, ± 2,0% SEM, N = 13 uafhængige kerner præparater ved hjælp af poolede prøver fra flere dyr i hvert præparat, figur 4). Dette er lig hvad er blevet observeret tidligere procent af NeuN-positive kerner i hele rygmarven (20% til 24% afhængigt af alder),27 herunder regionerne livmoderhalskræft og brysthule, der har mere hvide substans og oligodendrocytes. Af note, NeuN/Rbfox3 er ikke udtrykt i alle neuroner, og derfor, disse tal er sandsynligvis beskedne undervurdering. Det er muligt, at mindre ikke-neuronale celler udfiskes lidt under saccharose gradient rensning. Derudover downstream filtrering og analyse parametre efter sekvensering kan ændre den endelige celletype distribution fordi neuroner har flere gener per kerne (figur 3 c og D) og derfor er mindre tilbøjelige til at blive fjernet Under filtreringsprocessen.

Der er flere vigtige skridt i denne protokol, der kræver pleje. Første, overdreven douncing eller ændring (i trin 3 eller 4, henholdsvis) kan føre til en stigning i cellular vragdele og partikel dannelse. Selv om filtrering og saccharose tæthed centrifugering kan adskille store partikler, når små partikler der genereres under cellulære lysis, er de vanskelige at fjerne. For det andet, i løbet af homogenisering, Placer ikke homogeniseringsapparat direkte på bunden af Oak Ridge tube. I stedet dykke i slutningen af homogeniseringsapparat ind i den lave rørsukkeropløsning, indeholdende resuspenderet kerner, uden at røre bunden af røret. Homogenisering forbedrer nukleare isolation ved fjernelse af celleaffald og reducere klumper og multiplets (figur 5). Efter saccharose tæthed centrifugering er det afgørende for straks at fjerne Oak Ridge røret fra centrifugen, og hurtigt dekanteres i en hurtig 'svippede' bevægelse. Når resuspending kerner fra væggen i Oak Ridge tube, resuspenderes 'salte' fra halvvejs mellem myelin band og bunden af røret. Bemærk at pellet ikke kan være synlige. Resuspending kerner højere langs røret kan resultere i myelin forurening i kerner forberedelse. Cellulære lysis og saccharose tæthed centrifugering trin er den mest kritiske til at reducere partikler, der kan tilstoppe mikrofluid kanaler for downstream ansøgning.

Navnet på materiale / udstyr Stock koncentration Endelig koncentration Mængde / beløb
Vaskemiddel lysisbuffer
Lav saccharose buffer - - 600 ΜL
Triton-X 20% 0,10% 3 ΜL
Hypotonic lysisbuffer
Tris-HCl (pH = 7.4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0,01% 1 ΜL
Nukleasen-frit vand op til 10 mL
HEB Medium
Dvale-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Lav saccharose buffer
Saccharose - 0,32 M 2,75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM 125 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0,5 M 0,1 mM 5 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Nukleasen-frit vand op til 25 mL
Saccharose tæthed buffer
Saccharose - 1 M 8,6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Nukleasen-frit vand op til 25 mL
Resuspension løsning
1 X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
RNAse hæmmer 40 U/ΜL 0,2 U/ΜL 5 ΜL

Tabel 1: Oversigt over løsninger.

Rå Homogeniseret Endelige
Vaskemiddel-mekaniske 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
Hypotonic-mekaniske 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

Tabel 2: udbytte af kerner på hvert trin i protokollen. Antallet af kerner i den oprindelige rå forberedelse efter dounce homogenisering i vaskemiddel-mekaniske lysis protokol blev brugt til at estimere antallet af kerner i lumbal rygmarven. De indledende kerner udbytte (2,6 x 106 kerner ± 4,0 x 105 SEM, N = 3) blev brugt til at beregne kerner udbytte ved hver downstream skridt for både vaske - og hypotonic-mekaniske lysis protokoller. Antallet af kerner isoleret ved hypotonic-mekaniske forberedelse var normaliseret til de anslåede første kerner. Værdierne i tabellen er gennemsnit ± SEM, N = 3.

Figure 1
Figur 1: skematisk af nukleare isolation. Kerner fra voksen rygmarven kan isoleres ved hjælp af vaskemiddel-mekaniske eller hypotonic-mekaniske celle lysis, efterfulgt af homogenisering og saccharose tæthed gradient centrifugering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentant brightfield og DAPI-farvede kerner på nøglen trin i protokollen.  (A, B) rå kerner efter vaskemiddel-mekaniske eller hypotonic-mekaniske lysering. (C, D) Kerner efter homogenisering. (E, F) Kerner genopslemmes i PBS med 0,04% BSA efter saccharose tæthed centrifugering. Kerner blev fastsat med 2% PARAFORMALDEHYD og efterfølgende farves benytter Trypan blå eller DAPI. Billeder blev taget på 10 X (skalalinjen = 100 µm) ved hjælp af brightfield og epi-fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant tSNE plot af sekventeret kerner: ved hjælp af vaskemiddel-mekaniske og hypotonic-mekaniske lysering. (A) resultaterne fra sekventering over 17.000 kerner fra dissekeret voksen mus lumbal rygmarven efter vaskemiddel-mekaniske lysis og ifølge Macosko et al. 2015 med ændringer fra sothees et al. 2018. denne figur er blevet ændret med tilladelse fra sothees et al. 2018.4 (B) opnåede resultater fra sekventering 5.000 kerner fra skubbet voksen lumbal rygmarven efter hypotonic-mekaniske lysis og en kommerciel mikrofluid enkelt celle indkapsling platform. 26  (C, D) gennemsnitlige gener per kerne resultater efter klynger af store celletyper i voksen mus rygmarven ± SEM. Af note, vaskemiddel-mekaniske lysis procedure efterfulgt af Macosko mfl. 2015 platform blev udført ved hjælp af dissekerede lumbal rygmarven, mens hypotonic-mekaniske lysis efterfulgt af den kommerciel platform blev udført ved hjælp af bortvist lumbal rygmarven (som beskrevet i denne protokol). I betragtning af at skubbe ledningen fjerner dura og dorsalrodsganglier, meningeal/Schwann celle klynge er fraværende fra figur 3B og D. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: FACS plot af NeuN+ kerner efter vaskemiddel-mekaniske lysering. FACS plot viser fast cellekerner farves for NeuN (gennemsnitlig 31,9% af samlede kerner ± 2,0% SEM, N = 13), isoleret ved hjælp af vaskemiddel-mekaniske lysis protokollen. For den umiddelbare fiksering, kerner til FACS validering, en rå kerner forberedelse blev opnået ved dounce homogenisering af rygmarv ved hjælp af vaskemiddel-mekaniske forberedelse, efterfulgt af umiddelbar fiksering med 1% PFA med en 5 min inkubationstid. Fiksering var slukkes med 250 mM glycin, og kerner blev indsamlet. Farvning med anti-NeuN antistof blev udført i løsning. FACS blev udført på faste, NeuN farves kerner ved hjælp af en celle sorteringsanlæg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: kerner forberedelse uden homogenisering. Kerner blev genopslemmes før saccharose tæthed centrifugering efter A vaskemiddel-mekaniske eller B hypotonic-mekaniske lysis, uden homogenisering. * Betegner celleaffald knyttet til kerner (A) og en multiplet af cellekerner fastgjort ved celleaffald (B). Kerner genopslemmes i PBS med 0,04% BSA efter saccharose tæthed centrifugering. Kerner blev fastsat med 2% PARAFORMALDEHYD og efterfølgende farves benytter Trypan blå eller DAPI. Billeder blev taget på 10 X (skala bar 100 µm) ved hjælp af brightfield og epi-fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det ultimative mål for denne protokol er at isolere kerner indeholder høj kvalitet RNA for downstream transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for at profilere alle celletyper i rygmarven. I første omgang, fandt vi, at typiske celle dissociation metoder var ineffektive for enkelt celle RNA sekventering, da rygmarven neuroner er særligt sårbare over for celledød. Derudover inducerer celle dissociation metoder udtryk af forskellige aktiviteter - og stress-respons gener af op til flere hundredfold. 3 , 4 , 16 da ulemper forbundet med enkelt celle præparater, har vi og andre brugt kerner som et alternativ. 16 , 17 , 18 , 24 denne metode kan også bruges på menneskelige væv, herunder frosne rygmarv væv. 4 , 19 , 24 her, vil vi beskrive styrker og begrænsninger af denne fremgangsmåde.

Styrker af denne metode omfatter undgåelse af eksperimentelt inducerede IEGs samt evnen til at bruge både ferske og frosne væv. 4 således, kan denne fremgangsmåde være nyttige for sondering endogene IEGs efter en adfærd eller stimulus. 1 , 3 , 4 en af fordelene ved denne metode er, at det ikke kræver specialiserede enheder for udnyttelse af kerner til massivt parallel enkelt kerne sekvensering, men kan bruge den platform, udviklet af Macosko et al. 2015, med mindre justeringer af lysis buffer og flow sats, eller brug kommercielt tilgængelige systemer. Desuden er enkelt kerne sekventering bevist for at være en sammenlignelig metode til at af enkelt celle sekventering til identifikation af celletyper, udlån til styrken af denne fremgangsmåde. 28 , 29 men der er flere vigtige begrænsninger ved denne fremgangsmåde. Kerner indeholder ca. 20-50% af cellulære mRNA, afspejles29 og dette i en lavere antal udskrifter per kerne i forhold til enkelt celle sekvensering. 18 , 29 herunder intronic læser fra snRNA-Seq er en tilgang til at øge antallet af fundne gener.

Der er flere tilgængelige protokoller, der aktiverer isolation af kerner fra væv. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 i forhold til de fleste andre metoder, protokollerne præsenteres her kræver ikke myelin fjernelse, ultracentrifugering, eller mange centrifugering trin eller vasker, der kan føre til lavere endelige antal kerner. Desuden, denne protokol tager 45 min (vaskemiddel-mekanisk) eller 1 time (hypotonic-mekanisk) at fuldføre. Kommercielle protokoller, der understøttes på mikrofluid platforme er mere end dobbelt så lang tid og kræver mange flere centrifugering trin, øger risikoen for at miste kerner. I modsætning til kerner isolation protokoller, der involverer kun lysis og filtrering, omfatter de metoder, der præsenteres her et saccharose forløb for at øge renheden af de endelige kerner. Dette trin er påkrævet for voksen rygmarven væv på grund af den store andel af hvide substans og den resulterende myelin debris.

Vaskemiddel-mekaniske lysis protokol kan bruges til komplet væv dissociation og lysis, og hypotonic-mekaniske lysis protokol kan bruges til at kontrollere mængden af væv dissociation og cellular vragdele tilladt i programmet downstream. Disse protokoller kan bruges til bio-bank materiale, vanskeligt at adskille væv og for undersøgelse af aktivitet-afhængige transcriptional ændringer gennem isolation af kerner til downstream massivt parallel snRNA-FF. Ud over massivt parallel enkelt kerne RNA sekventering, kan denne protokol bruges til at isolere kerner til alternative programmer, herunder immunofluorescens og FACS og epigenetiske analyse såsom DNA methylering undersøgelser og ChIP-Seq (figur 4 ). 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af programmet murene af NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og kt Dobrott for deres tekniske support og nyttige diskussioner og C. Kathe for gennemgang af håndskriftet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
  2. Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
  3. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  4. Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
  5. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
  6. Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
  7. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  8. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  9. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  10. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
  11. Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  12. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  13. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  14. Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
  15. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  16. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
  17. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  18. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  21. Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  22. Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  23. Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
  24. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  25. 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
  26. 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
  27. Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
  28. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
  29. Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
  30. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).

Tags

Neurovidenskab spørgsmål 140 kerner RNA sekventering snRNA-FF. massivt parallel rygmarven saccharose gradient

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A.,… More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter