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Neuroscience

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

doi: 10.3791/58413 Published: October 12, 2018

ERRATUM NOTICE

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.

Abstract

Espressione genica di una singola cella di sondaggio consente l'identificazione del tipo di cella e stato della cellula. Sequenziamento di RNA di cella singola è emerso come un potente strumento per lo studio di profili trascrizionali delle cellule, particolarmente in tessuti eterogenei, come il sistema nervoso centrale. Tuttavia, metodi di dissociazione richiesti per il sequenziamento di singola cellula possono portare a modifiche sperimentali nella morte delle cellule e l'espressione genica. Inoltre, questi metodi sono generalmente limitati ai tessuti freschi, limitando così gli studi su archiviazione e materiale bio-banca. Sequenziamento di singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un'alternativa attraente per gli studi trascrizionale, dato che esso identifica i tipi di cellule con precisione, permette lo studio del tessuto che è congelato o difficile dissociare, e riduce la dissociazione indotta trascrizione. Qui, presentiamo un protocollo ad alta velocità per il rapido isolamento dei nuclei per downstream snRNA-segg. Questo metodo attiva l'isolamento dei nuclei da campioni di midollo spinale fresco o congelato e può essere combinato con due piattaforme di incapsulamento di parallelismo massivo della gocciolina.

Introduction

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Il sistema nervoso è composto da gruppi eterogenei di cellule che visualizzano una gamma diversificata di proprietà morfologiche, biochimiche ed elettrofisiologiche. Mentre il sequenziamento di RNA di massa è stato utile per determinare le modifiche a livello di tessuto nell'espressione genica in condizioni diverse, non preclude il rilevamento delle modifiche trascrizionali a livello di singola cellula. Gli avanzamenti recenti nell'analisi trascrizionale monocellulari hanno permesso la classificazione delle cellule eterogenee in gruppi funzionali basati sul loro repertorio molecolare e possono essere sfruttati anche per rilevare insiemi di neuroni che erano stato recentemente attivi. 1 , 2 , 3 , 4 negli ultimi dieci anni, lo sviluppo della singola cella RNA sequenziamento (scRNA-Seq) ha permesso lo studio dell'espressione genica in cellule individuali, offrendo una visione diversità di cellula-tipo. 5

L'emergere di approcci scalabili come parallelismo massivo scRNA-Seq, ha fornito piattaforme ai tessuti eterogenei sequenza, tra cui molte regioni del sistema nervoso centrale. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, metodi di dissociazione di singola cellula possono portare a morte cellulare, nonché di modifiche sperimentali nell'espressione genica. 16 lavoro recente ha adattato i metodi di sequenziamento di singola cella per consentire la conservazione dei profili trascrizionali endogeni. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 queste strategie sono state particolarmente adatte per la rilevazione di espressione genica (IEG) inizio immediato seguito stimolo sensoriale o comportamento. 3 , 4 In futuro, questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti dinamici in tessuti negli Stati di malattia o in risposta allo stress. Di questi metodi, sequenziamento singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un approccio promettente che non comporta la dissociazione di cella stressanti e può essere utilizzato su difficile dissociare il tessuto (ad esempio il midollo spinale), come pure congelati tessuto. 4 , 17 , 18 , 19 adattato da precedenti metodi di isolamento di nuclei,20,21,22,23,25 snRNA-Seq in genere utilizza delle cellule e la rottura rapida dei tessuti Lisi sotto condizioni di freddo, centrifugazione e separazione dei nuclei da detriti cellulari. 4 nuclei possono essere isolati per il sequenziamento di nuova generazione a valle su piattaforme multiple di incapsulamento gocciolina microfluidica. 4 , 7 , 24 , 25 questo metodo permette un'istantanea dell'attività trascrizionale di migliaia di cellule in un momento nel tempo.

Ci sono strategie multiple per rilasciare i nuclei dalle cellule prima di isolamento e sequenziamento, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. Qui, descriviamo e confrontare due protocolli per consentire l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale adulto per il parallelismo massivo a valle snRNA-Seq: detergente-meccanica Lisi e Lisi ipotonica-meccanico. Detergente-meccanica Lisi fornisce la rottura completa del tessuto e una maggiore resa finale dei nuclei. Meccanica-Lisi ipotonica includono un livello controllabile di rottura del tessuto, fornendo un'opportunità per la selezione di un equilibrio tra la quantità e la purezza del rendimento nucleare finale. Questi approcci forniscono paragonabile rendimento del RNA, rilevati numeri di geni al nucleo e la cellula-tipo di profilatura e anche entrambi possono essere utilizzati con successo per snRNA-segg.

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Protocol

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Tutto il lavoro animale è stato eseguito secondo un protocollo approvato dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo Animal Care e Comitato di uso. Bilanciato campioni di maschi e femminili topi wild-type ICR/CD-1, tra 8 e 12 settimane vecchio, sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti. Topi devono essere manipolati conformemente alle linee guida istituzionali Animal Care e Comitato di uso locale.

1. preparazione dei materiali e buffer

  1. Preparare tutti i buffer il giorno di utilizzo e pre-chill sul ghiaccio (Vedi tabella 1).
    1. Se usando il detersivo-meccanica Lisi, preparare il tampone di lisi detergente (> 500 µ l per campione), tampone di saccarosio basso (> 6 mL per campione), tampone di saccarosio densità (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).
    2. Se si utilizza Lisi ipotonica-meccanica, preparare il tampone di Lisi ipotonica (> 5 mL per campione), mezzo di EB (> 5 mL per campione), tampone di saccarosio basso (> 3 mL per campione), buffer di densità di saccarosio (> 12,5 mL per campione) e la soluzione di risospensione (> 1 mL).
    3. Aggiungere 25 μL di ditiotreitolo (DTT) a 25 mL di buffer di saccarosio basso e un altro 25 μL di DTT a 25 mL di buffer di gradienti di densità di saccarosio appena prima di iniziare il protocollo.
  2. Coprire la superficie per dissezione con foglio di alluminio per minimizzare la contaminazione del campione con fibre da carta assorbente o delle protezioni di banco, che possono ostruire i canali microfluidici utilizzate per acquisire i singoli nuclei.
  3. Con una soluzione di decontaminazione di RNasi, spray strumenti per dissezione e spazio sul banco. Inoltre, spruzzare all'interno del tubo di omogeneizzatore lisata (se si utilizza la lisi cellulare detergente-meccanico) e del tubo di Oak Ridge con una soluzione di decontaminazione di RNAsi. Sciacquare il tubo lisata e Oak Ridge con acqua ultrapura, RNAsi-libera.
  4. Pre-raffreddare tutte le provette per il prelievo (50 mL conica, Oak Ridge) e tubi omogeneizzatore lisata sul ghiaccio.
  5. Fuoco polacco una serie di pipette Pasteur (se utilizza Lisi ipotonica-meccanica delle cellule).

2. preparazione del midollo spinale

  1. Se si utilizza il tessuto fresco, eutanasia il mouse da inalazione di CO2 . A seguito di eutanasia, spruzzare il cappotto del mouse con etanolo al 70% per minimizzare la contaminazione di capelli nel campione.
  2. Decapita il mouse con forbici chirurgiche sharp, RNAsi-libera. Successivamente, si sollevano delicatamente addominale della pelle con il forcipe e fare un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.
  3. Eviscerate il mouse tirando gli organi interni dalla cavità del corpo usando il forcipe. Non usare asciugamani di carta per pulire la zona o per rimuovere gli organi come questo può introdurre contaminanti. Utilizzando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali, L2 e L3.
    Nota: Con la pratica, questo passaggio può essere raggiunto in meno di 30 secondi.
    1. Per espellere il midollo spinale, adatta una siringa da 3 mL contenenti PBS ghiacciata con un ago da 25 G ¼ di pollice. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una guarnizione stretta intorno alla punta dell'ago e premere lo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente. Luogo il midollo spinale in una capsula di Petri con PBS ghiacciata.
    2. A questo punto, congelare il tessuto e conservare a-80 ° C oppure utilizzare immediatamente per detergente-meccanico (passaggio 3) o lisi di ipotonico-meccanico (passaggio 4).
  4. Se utilizzando tessuto congelato, mantenere il tessuto sul ghiaccio secco, procedere al detergente-meccanico (passaggio 3) o ipotonica-meccanico (passaggio 4) lisi.

3. lisi delle cellule detersivo-meccanico

  1. Mettere il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore lisata pre-refrigerato e aggiungere 500 mL pre-refrigerati buffer di lisi detergente.
    Nota: Un mouse nel midollo spinale lombare è 325,5 mg ± mg 63,9 errore standard della media (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo.
  2. Lisata con 5 colpi di pestello (pestello 'sciolto'), quindi il 5-10 colpi di pestello B ('stretto' pestello). Evitare di sollevare l'omogeneizzatore fuori della soluzione di lisi tra colpi ed evitare di introdurre bolle.
  3. Posizionare un colino di 40 mm sopra un tubo conico pre-refrigerati da 50 mL e prewet con 1 mL di tampone basso saccarosio.
  4. Aggiungere 1 mL di tampone basso saccarosio per l'omogeneizzatore lisata contenente i nuclei grezzi nel buffer di lisi e mescolare delicatamente pipettando 2 – 3 volte.
  5. Passare la preparazione di nuclei grezza sopra il filtro di 40 mm nel tubo conico pre-refrigerati 50 mL.
  6. Passare un ulteriore 1 mL di tampone di saccarosio basso sopra il filtro di 40 mm, portando il volume finale a 3 mL di buffer di saccarosio basso e 500 mL di tampone di lisi.
  7. Ripetere i passaggi da 3.1 – 3.6 se combinando più cavi, pool nello stesso tubo conico.
  8. Centrifugare il campione a 3.200 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare il supernatante. Procedere al passaggio 5.

4. lisi delle cellule ipotonico-meccanica

  1. Luogo il midollo spinale lombare in 5 mL di tampone di Lisi ipotonica in un piatto di coltura del tessuto. Utilizzare l'estremità smussata di forbici di primavera per bisecare il midollo spinale, quindi usare le forbici di primavera per il cavo tagliato a pezzi di 3 – 4 mm, ma non tritate.
    Nota: 50 mg-1,5 g di tessuto può essere utilizzato con successo.
  2. Incubare in ghiaccio per 15 min, 2 – 3 volte di turbine.
  3. Aggiungere 5 mL di mezzo di EB per diluire il tampone di Lisi ipotonica.
  4. Triturare il tessuto 10 volte con una pipetta sierologica di 5ml, o fino a quando tutti i pezzi del tessuto muoversi agevolmente attraverso l'apertura della pipetta.
  5. Triturare con una serie di tre pipette Pasteur lucidati a fuoco con diametri progressivamente più stretto (~ 900 – 600 mm).
    1. Per ogni pipetta, triturare 5 - 15 volte, permettono di tessuto per stabilirsi, rimuovere 1 – 2 mL di surnatante contenente nuclei dissociati e passare sopra un filtro di 40 mm in una provetta conica da mL 50 pre-refrigerati.
    2. Dopo la triturazione con la pipetta di Pasteur più piccolo di dimensioni, assicurarsi che l'omogeneizzato scorre senza intoppi attraverso la punta della pipetta. Passare la soluzione rimanente sopra il filtro di 40 mm nella provetta conica da 50 mL.
      Nota: Il numero totale di triturazioni può essere registrato a piacere. Le meningi del midollo spinale del mouse resterà, ma è importante triturare qualsiasi blocchi visibili del midollo spinale. Passare il restante omogeneato sopra il filtro di 40 m. Evitare di introdurre bolle durante la triturazione.
  6. Centrifugare il campione filtrato a 1.000 x g per 10 min a 4 ° C. Una volta terminata la centrifugazione, decantare e scartare il surnatante. Procedere al passaggio 5.

5. omogeneizzazione e gradiente di densità di saccarosio

  1. Dopo il passaggio 3 o 4, risospendere il sedimento con 3 mL di tampone basso saccarosio. Agitare delicatamente per rimuovere il pellet dal muro per facilitare la risospensione. Lasciate che il campione sedersi sul ghiaccio per 2 min e trasferire la sospensione in una provetta di Oak Ridge.
  2. Utilizzando l'omogeneizzatore a impostazione 1, omogeneizzare i nuclei nel buffer di saccarosio bassa per 15 – 30 s, mantenendo il campione sul ghiaccio.
    Nota: Utilizzare 15 s se utilizza un midollo spinale lombare o 30 s se utilizzando pool di campioni o un intero midollo spinale.
  3. Utilizzando una pipetta sierologica, strato 12,5 mL di tampone di saccarosio di densità sotto omogeneato di buffer del saccarosio basso, avendo cura di non per creare una bolla che sconvolge gli strati di densità.
  4. Centrifugare le provette a 3.200 x g per 20 min a 4 ° C.
  5. Una volta terminata la centrifugazione, immediatamente decantare il supernatante in un movimento flicking.
    Nota: Un volume residuo (meno di 400 mL) di tampone di saccarosio può essere scartato se si desidera produrre un volume più basso e pulitore del campione finale, ma questo volume residuo contengono nuclei e può essere conservato per massimizzare la resa di nuclei.
  6. Utilizzando 100 mL - 1 mL di soluzione di risospensione, risospendere i nuclei restanti sulla parete. Evitare la mielina 'aggrottare le sopracciglia' che rimane con la preparazione a base di detergente.
  7. Filtrare i nuclei attraverso un colino di formato del poro di 30 – 35 mm e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.
  8. Determinare i nuclei rendimento utilizzando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10x.
    Nota: Tripan blu possa essere aggiunti per visualizzare i nuclei, che dovrebbero apparire blu. Si noti la quantità di detriti cellulari.
  9. Procedere al passaggio 6 o 7.

6. massively Parallel snRNA-Sequencing: piattaforma accademico7

  1. Eseguire il sequenziamento di parallelismo massivo snRNA (ad es., goccia-Seq) metodo descritto in precedenza7 con le seguenti modifiche:4
    1. Regolare i nuclei ad una concentrazione finale di 225 nuclei / mL.
    2. Preparare con codice a barre perline ad una concentrazione di 250 perline per mL.
    3. Preparare il tampone di lisi con 0,7% sarkosyl.
    4. Regolare le portate a 35 mL / min per perline, 35 mL / min per i nuclei e 200 mL / min per l'olio.

7. massicciamente parallelo snRNA-sequenziamento: piattaforma commerciale26

  1. Eseguire snRNA-sequenziamento massivamente parallelo utilizzando la piattaforma commerciale (ad es., soluzione di cromo Single Cell Gene Expression) prodotti secondo istruzioni26 con la seguente modifica del produttore:
    1. A seguito di d'inversione-trascrizione, aggiungere un ulteriore ciclo di PCR il numero calcolato di cicli per l'amplificazione del cDNA basata sul recupero cellulare mirata per compensare la diminuzione del cDNA da nuclei rispetto alle cellule.

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Representative Results

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Qui, abbiamo effettuato l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale lombare topo adulto per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Il protocollo ha coinvolto tre componenti principali: tessuto rottura e cellular Lisi, omogeneizzazione e saccarosio centrifugazione di densità (Figura 1). In pochi secondi, la lisi di detersivo-meccanici ha reso una preparazione di nuclei grezzo con un gran numero di nuclei così come detriti cellulari e tissutali (Figura 2Atabella 2). Dopo quindici minuti, la Lisi ipotonica-meccanici ha reso una preparazione di nuclei grezzo che aveva meno detriti, ma anche fissare nuclei meno (Figura 2Btabella 2). Entrambe le preparazioni hanno subito omogeneizzazione (Figura 2 e D) e centrifugazione in gradiente di densità saccarosio prima risospensione in PBS con 0,04% BSA (Figura 2E e F). In media, un midollo spinale lombare del mouse (325,5 mg ± mg 63,9 errore standard della media, SEM, N = 4) ha reso 5.1 x 105 nuclei (± 6,3 x 104 SEM, N = 3) seguendo la lisi di detersivo-meccanica e 2.0 x 105 nuclei (± 5,9 x 104 SEM, N = 3) seguendo la Lisi ipotonica-meccanico. Il numero dei nuclei nel midollo spinale lombare è stato stimato dalla preparazione iniziale grezza dopo omogeneizzazione lisata nel protocollo detergente-meccanica lisi (2.6 x 106 nuclei ± 4.0 x 105 SEM, N = 3, tabella 2). Il campione finale dal protocollo Lisi detergente-meccanico è costituito da 20% dei nuclei iniziali (SEM di ± 2%, N = 3, tabella 2). La preparazione di nuclei grezzo dalla Lisi ipotonica-meccanico seguito triturazione contiene 62% dei nuclei iniziali (SEM di ± 2%, N = 3, tabella 2). Il campione di Lisi ipotonica-meccanica finale contiene solo l'8% dei nuclei iniziali (SEM di ± 1%, N = 3, tabella 2). Non abbiamo rilevato alcuna differenza nel rendimento di RNA totale o il rendimento di cDNA per un gene housekeeping (Gapdh) tra i metodi di preparazione di due. Utilizzando qPCR, il metodo detergente ha reso 463.7 ng (± 98,9 SEM, N = 6) di RNA totale e un ciclo di soglia rilevamento medio di 25,2 (± 1.3 SEM) per Gapdh cDNA di qPCR e il metodo ipotonico ha reso 419.2 ng (± 85,3 SEM, N = 6) di RNA totale e una soglia di rilevamento medio ciclo di 26,1 per Gapdh cDNA (± 0,8 SEM). Le due opzioni di lisi sia isolare nuclei dai tessuti difficile dissociare e forniscono il materiale di alta qualità per il sequenziamento di RNA singolo-nucleo a valle.

Date le dimensioni dei canali microfluidici per piattaforme di sequenziamento massivamente parallelo singolo nucleo a valle, è fondamentale per inserire una sospensione di nuclei priva di particelle di grandi dimensioni o detriti cellulari per evitare intasamenti. Seguendo il protocollo presentato qui, non c'erano nessun istanze di intasamento sulla piattaforma adattata da Macosko et al. 2015 (N = 17) e un intasare parziale sulla piattaforma commerciale (N = 16).

Le procedure di detersivo-meccanica e ipotonico-meccanico sono state usate per isolare i nuclei con successo per due piattaforme di incapsulamento di parallelismo massivo gocciolina e risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 3. Entrambi questi approcci abilitato profiling trascrizionale di migliaia di nuclei e classificazione dei tipi di cellule nel midollo spinale lombare topo adulto (Figura 3). 4 questi approcci ha provocato geni paragonabile al nucleo per ogni tipo di cellula (Figura 3 e D). I tassi di recupero dei nuclei ingresso tra le due piattaforme sono diversi. La piattaforma adattata da Macosko et al 2015 con modifiche da Virgilio et al. 2018 ha recuperato circa 0,59% dei nuclei (± 0.05% SEM, N = 17), mentre la piattaforma commerciale recuperato un stimato i nuclei 53,7% (N = 2).

Questo protocollo si arricchisce leggermente per nuclei neuronali nella preparazione finale. In sezioni di tessuto del midollo spinale lombare, abbiamo trovato che il 27% dei nuclei era positivo per il marcatore di un neurone NeuN (N = 7.368 nuclei da 2 animali), mentre la preparazione di nuclei di detersivo-meccanica del midollo spinale lombare ha provocato il 31,9% dei nuclei totali esprimendo NeuN, come determinato dall'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule (FACS, SEM: ± 2.0%, N = 13 preparazioni di nuclei indipendenti utilizzando campioni riuniti da più animali in ogni preparazione, Figura 4). Questo è simile a quanto osservato in precedenza per la percentuale di nuclei NeuN-positivi nell'intero midollo spinale (20%-24% a seconda dell'età),27 , comprese le regioni cervicali e toraciche che hanno più materia bianca e oligodendrociti. Della nota, NeuN/Rbfox3 non è espressa in tutti i neuroni e, di conseguenza, questi numeri sono probabilmente sottovaluta modesto. È possibile che più piccole cellule non neuronali sono vuotate leggermente durante la purificazione di gradiente di saccarosio. Inoltre, parametri di filtraggio e di analisi a valle seguendo la sequenza possono alterare la distribuzione del tipo di cella finale perché i neuroni hanno più geni al nucleo (Figura 3 e D) e, di conseguenza, hanno meno probabilità di essere rimosso durante il processo di filtraggio.

Ci sono diversi passaggi chiave nel presente protocollo che richiedono una cura. Douncing primo, eccessivo o triturazione (in passi 3 o 4, rispettivamente) può portare ad un aumento nella formazione di detriti e particelle cellulare. Anche se la filtrazione e la centrifugazione di densità di saccarosio può separare particelle di grandi dimensioni, una volta piccole particelle vengono generate durante la lisi cellulare, sono difficili da rimuovere. In secondo luogo, durante l'omogeneizzazione, non collocare l'omogeneizzatore direttamente sul fondo del tubo di Oak Ridge. Invece, immergere la fine dell'omogeneizzatore nella soluzione di saccarosio basso contenente nuclei di sedimento, senza toccare il fondo del tubo. Omogeneizzazione migliora isolamento nucleare rimozione detriti cellulari e riducendo ciuffi e multipletti (Figura 5). Dopo la centrifugazione di densità di saccarosio, è fondamentale per rimuovere immediatamente il tubo di Oak Ridge dalla centrifuga e rapidamente decantare il supernatante in un rapido movimento 'flicking'. Quando Risospendere i nuclei dalla parete del tubo Oak Ridge, risospendere il pellet 'salato' a metà strada tra la band di mielina e la parte inferiore del tubo. Si noti che il pellet potrebbe non essere visibile. Risospendere i nuclei più alti lungo il tubo potrebbe causare contaminazione di mielina nella preparazione i nuclei. La lisi cellulare e saccarosio densità centrifugazione passi sono i più critici per la riduzione del particolato che potrebbe intasare i canali microfluidici per applicazione a valle.

Nome di materiale / attrezzatura Concentrazione d'archivio Concentrazione finale Volume / importo
Buffer di lisi detergente
Buffer di saccarosio basso - - 600 ΜL
Triton-X 20% 0,10% 3 ΜL
Buffer di lisi ipotonico
Tris-HCl (pH = 7.4) 1 M 10 mM 100 ΜL
NaCl 5 M 10 mM 20 ΜL
MgCl2 1 M 3 mM 30 ΜL
Nonidet P40 - 0,01% 1 ΜL
Acqua priva di nucleasi fino a 10 mL
HEB Medium
Sospensione-A - - 10 mL
Glutamax - - 100 ΜL
B27 - - 200 ΜL
Buffer di saccarosio basso
Saccarosio - 0,32 M 2.75 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
CaCl2 1 M 5 mM 125 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
EDTA 0,5 M 0,1 mM 5 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Acqua priva di nucleasi fino a 25 mL
Buffer di densità di saccarosio
Saccarosio - 1 M 8,6 g
HEPES (pH = 8.0) 1 M 10 mM 250 ΜL
MgAc 1 M 3 mM 75 ΜL
DTT 1 M 1 mM 25 ΜL
Acqua priva di nucleasi fino a 25 mL
Soluzione di risospensione
1X PBS - - 1 mL
BSA 20 mg/mL 0,4 mg/mL 20 ΜL
Inibitore di RNAsi 40 U/ΜL 0.2 U/Μ l 5 ΜL

Tabella 1: Tabella delle soluzioni.

Grezzo Omogeneizzato Finale
Detergente-meccanica 100 ± 15% 87 ± 9% 20 ± 2%
Ipotonico-meccanica 62 ± 12% 35 ± 4% 8 ± 1%

Tabella 2: rendimento dei nuclei ad ogni passo nel protocollo. Il numero dei nuclei nella preparazione iniziale grezza dopo omogeneizzazione lisata nel protocollo Lisi detergente-meccanico è stato utilizzato per stimare il numero dei nuclei nel midollo spinale lombare. I nuclei iniziali resa (2.6 x 106 nuclei ± 4.0 x 105 SEM, N = 3) è stato utilizzato per calcolare i nuclei resa ad ogni passo a valle per entrambi i protocolli Lisi meccanica detergente e ipotonica. Il numero di nuclei isolati dalla preparazione ipotonico-meccanico è stato normalizzato ai nuclei iniziali stimati. I valori nella tabella sono media ± SEM, N = 3.

Figure 1
Figura 1: schematico di isolamento nucleare. I nuclei dal midollo spinale adulto possono essere isolati mediante lisi cellulare detergente-meccanico o ipotonica-meccanica, seguita da omogeneizzazione e centrifugazione in gradiente di densità saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Campo chiaro rappresentante e DAPI-ha macchiato i nuclei chiave passi nel protocollo.  (A, B) nuclei greggio dopo lisi detergente-meccanico o ipotonica-meccanico. (C, D) Dopo omogeneizzazione dei nuclei. (E, F) Nuclei risospesi in PBS con 0,04% BSA dopo centrifugazione di densità di saccarosio. I nuclei sono stati fissati con 2% di paraformaldeide e successivamente macchiato utilizzando Trypan Blue o DAPI. Immagini sono state scattate a 10x (barra della scala = 100 µm) utilizzando il campo chiaro ed epi-fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: rappresentante tSNE trama dei nuclei sequenziati: usando detersivo-meccanica e ipotonico-meccanica lisi. (A) risultati ottenuti dal sequenziamento oltre 17.000 nuclei dal midollo spinale lombare dissecata topo adulto dopo lisi detergente-meccanica e secondo Macosko et al 2015 con modifiche da Virgilio et al. 2018. questa figura è stata modificata con il permesso di Virgilio et al. 2018.4 (B) risultati ottenuti dai 5.000 nuclei sequenziamento dal espulso midollo spinale lombare adulto dopo Lisi ipotonica-meccanico e una piattaforma di incapsulamento di singola cellula commerciale microfluidici. 26  (C, D) geni medio per risultati di nucleo che seguono il clustering dei tipi principali delle cellule nel topo adulto midollo spinale ± SEM Da notare, la procedura di lisi detergente-meccanica seguita dalla Macosko et al. piattaforma del 2015 è stato effettuato usando dissecato lombare del midollo spinale, mentre la Lisi ipotonica-meccanica seguita dalla piattaforma commerciale è stata effettuata utilizzando espulsa lombare del midollo spinale (come descritto in questo protocollo). Dato che espellere il cavo rimuove la dura e gangli delle radici dorsali, il cluster di cellule meningee/Schwann è assente da Figura 3B e D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: trama di FACS dei nuclei NeuN+ seguito detergente-meccanica lisi. Trama di FACS risultati fissi nuclei macchiato per NeuN (media 31,9% del totale nuclei ± 2.0% SEM, N = 13), isolato utilizzando il protocollo di lisi detergente-meccanico. Per la fissazione immediata, i nuclei per la convalida di FACS, una preparazione di nuclei grezza è stata ottenuta da lisata omogeneizzazione dei midolli spinali usando la preparazione di detersivo-meccanica, seguita da fissazione immediata con 1% PFA con un periodo di incubazione di 5 min. La fissazione è stata spenta con glicina 250mm, e i nuclei sono stati raccolti. Colorazione con anticorpo anti-NeuN è stato effettuato in soluzione. FACS è stato effettuato su fisso, i nuclei di NeuN macchiato usando un sorter delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: preparazione di Nuclei senza omogeneizzazione. I nuclei sono stati risospesi prima della centrifugazione di densità di saccarosio seguendo A detergente-meccanico o Lisi ipotonica-meccanica di B , senza omogeneizzazione. * Denota detriti cellulari collegati ai nuclei (A) e un multipletto dei nuclei collegati da detriti cellulari (B). Nuclei risospesi in PBS con 0,04% BSA dopo centrifugazione di densità di saccarosio. I nuclei sono stati fissati con 2% di paraformaldeide e successivamente macchiato utilizzando Trypan Blue o DAPI. Immagini sono state scattate a 10x (scala bar 100 µm), utilizzando il campo chiaro ed epi-fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di isolare i nuclei contenente RNA di alta qualità per analisi trascrizionale a valle. Abbiamo adattato snRNA-Seq metodi al fine di profilo di tutti i tipi di cellule nel midollo spinale. Inizialmente, abbiamo trovato che metodi dissociazione tipici delle cellule erano inefficaci per la sequenziazione di singola cellula RNA, come neuroni del midollo spinale sono particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule. Inoltre, metodi di dissociazione delle cellule inducono l'espressione di vari geni di risposta di sforzo e di attività di fino a diversi centuplica. 3 , 4 , 16 dato gli svantaggi associati con preparazioni di singole cellule, noi ed altri abbiamo usato i nuclei come alternativa. 16 , 17 , 18 , 24 questo metodo può essere utilizzato anche su tessuti umani, compreso il tessuto congelato del midollo spinale. 4 , 19 , 24 qui, descriveremo i punti di forza e le limitazioni di questo approccio.

Punti di forza di questo metodo includono l'evitare indotta sperimentalmente le gambe così come la possibilità di utilizzare il tessuto sia fresco che congelato. 4 in tal senso, questo approccio può essere utile per sondare endogene gambe seguendo un comportamento o stimolo. 1 , 3 , 4 uno dei vantaggi di questo metodo è che non richiede dispositivi specializzati per l'utilizzo dei nuclei per il sequenziamento massivamente parallelo singolo nucleo, ma possono utilizzare la piattaforma sviluppata da Macosko et al 2015, con piccoli aggiustamenti di tasso di flusso e buffer di Lisi, o utilizzare i sistemi disponibili in commercio. Inoltre, sequenziamento singolo nucleo è dimostrato di essere un metodo analogo a quello del sequenziamento di singola cellula per l'identificazione dei tipi di cellule, prestito per la forza di questo approccio. 28 , 29 tuttavia, ci sono diversi importanti limitazioni di questo approccio. I nuclei contengono circa il 20-50% di mRNA cellulare,29 e questo si riflette in un minor numero di trascrizioni per nucleo rispetto al sequenziamento di singola cellula. 18 , 29 tra cui introniche letture da snRNA-Seq è un approccio per aumentare il numero dei geni individuati.

Esistono diversi protocolli disponibili che permettono l'isolamento dei nuclei dal tessuto. 2 , 16 , 17 , 18 , 24 , 30 in confronto con la maggior parte dei altre metodi, i protocolli qui presentati non richiedono rimozione di mielina, ultracentrifugazione, o molti passaggi di centrifugazione o lavaggi che possono condurre per abbassare i numeri finali dei nuclei. Inoltre, questo protocollo richiede 45 min (detergente-meccanico) o 1 ora (ipotonico-meccanico) per completare. Commerciali protocolli supportati su piattaforme di microfluidica sono oltre il doppio del tempo e richiedono molte più fasi di centrifugazione, aumentando il rischio di perdere i nuclei. Diversamente dai protocolli di isolamento di nuclei che coinvolgono solo Lisi e filtro, i metodi qui presentati includono un gradiente di saccarosio per aumentare la purezza dei nuclei finale. Questo passaggio è necessario per il tessuto del midollo spinale adulto a causa dell'alta percentuale di materia bianca e i residui del myelin risultante.

Il protocollo di lisi detergente-meccanico può essere utilizzato per la dissociazione completa del tessuto e la lisi, e il protocollo di Lisi ipotonica-meccanico può essere utilizzato per controllare la quantità di detriti cellulari e di dissociazione del tessuto ammessi nell'applicazione a valle. Questi protocolli possono essere utilizzati per materiale bio-banca, difficile dissociare i tessuti e per l'indagine di attività-dipendente cambiamenti trascrizionali attraverso l'isolamento dei nuclei per downstream parallelismo massivo snRNA-segg. Oltre al sequenziamento massivamente parallelo singolo nucleo RNA, questo protocollo può essere utilizzato per isolare i nuclei per applicazioni alternative, tra cui l'immunofluorescenza e FACS e analisi epigenetiche quali gli studi di metilazione del DNA e ChIP-Seq (Figura 4 ). 23

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Disclosures

Non abbiamo conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale di NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Ringraziamo L. Li e C.I. Dobrott per il loro supporto tecnico e discussioni utili e Kathe C. per la revisione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Invitrogen 15503-022
1 M HEPES (pH = 8.0) Gibco 15630-080
CaCl2 Sigma Aldrich C1016-100G
MgAc Sigma Aldrich M5661-50G
0.5 M EDTA (pH = 8.0) Corning MT-46034CI
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 10197777001 Add DTT just prior to use
Triton-X Sigma Aldrich T8787
Nuclease-free water Crystalgen 221-238-10
1 M Tris-HCl (pH = 7.4) Sigma Aldrich T2194
5 M NaCl Sigma Aldrich 59222C
1 M MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Nonidet P40 Sigma Aldrich 74385
Hibernate-A Gibco A12475-01
Glutamax (100x) Gibco 35050-061
B27 (50x) Gibco 17504-044
1x PBS Crystalgen 221-133-10
0.04% BSA New England Biolabs B9000S
0.2 U/μL RNAse Inhibitor Lucigen 30281-1
Oak Ridge Centrifuge Tube Thermo Scientific 3118-0050
Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-8B
Glass Tissue Dounce (2 mL) Kimble 885303-002
Glass large clearance pestle Kimble 885301-0002
Glass small clearance pestle Kimble 885302-002
T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer IKA 3737001
Dispersing tool (S 10 N – 5G) IKA 3304000
Trypan Blue Stain (0.4%) Thermo Fisher Scientific T10282
40 μm cell strainer Falcon 352340
MACS SmartStrainers, 30 μm Miltenyi Biotec 130-098-458
Conical tubes Denville Scientific 1000799
Sorvall Legend XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004505
Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor Thermo Fisher Scientific 75003698
Sterological Pipettes: 5 mL, 10 mL Denville Scientific P7127
Hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
Chemgenes Barcoding Beads Chemgenes Macosko-2011-10
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) Corning 352235
MoFlo Astrios Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns 10X Genomics 120262
Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns 10X Genomics 120267
Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns 10X Genomics
Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm) Corning 353002

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.

Step 3.1 was updated from:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.

to:

Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.

Step 3.6 was updated from:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.

to:

Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.

Step 5.5 was updated from:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

to:

Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield

Step 5.6 was updated from:

Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

to:

Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.

Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.

to:

  1. Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
  2. Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
  3. Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
  4. Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA
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Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).More

Matson, K. J. E., Sathyamurthy, A., Johnson, K. R., Kelly, M. C., Kelley, M. W., Levine, A. J. Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58413, doi:10.3791/58413 (2018).

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