Summary
هنا، نحن تصف 3 نماذج الإصابة الزرد الكبار واستخدامها مجتمعة مع العلاج بالعقاقير المثبطة للمناعة. نقدم التوجيه على تصوير لتجديد الأنسجة وكشف تمعدن العظام فيه.
Abstract
الزرد قادرون على تجديد الأجهزة المختلفة، بما في ذلك الملاحق (زعانف) بعد بتر الأطراف. وهذا ينطوي على تجديد العظام، والتي ريجرووس خلال أسبوعين تقريبا بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، الزرد قادرون على شفاء العظام سريعاً بعد تريبانيشن الجمجمة، وإصلاح الكسور التي يمكن إدخالها بسهولة إلى أشعة الزعنفة عظمى الزرد. تمثل هذه فحوصات الإصابة ممكن نماذج تجريبية لاختبار تأثير المخدرات التي تدار على سرعة تشكيل العظام. هنا، نحن تصف استخدام هذه النماذج إصابة 3 واستخدامها مجتمعة مع العلاج جلوكوكورتيكويد المنهجية، التي تمارس الآثار المثبطة وكآبته العظام. نحن توفير سير عمل حول كيفية التحضير للمعالجة المثبطة للمناعة في الزرد الكبار وتوضح كيفية إجراء البتر زعنفة، تريبانيشن كالفاريال العظام والكسور زعنفة، ووصف كيف يؤثر استخدام الكورتيزون كلا تشكيل العظام خلايا الاوستيوبلاستس وخلايا لنسب الوحيدات/بلعم كجزء من الحصانة الفطرية في أنسجة العظام.
Introduction
الزرد تمثل نموذجا حيوان قوية لدراسة التنمية الفقاريات والمرض. وهذا يرجع إلى أن هم الحيوانات الصغيرة التي تتكاثر في شكل جيد للغاية وأن على الجينوم التسلسل الكامل وقابلة للتلاعب1. وتشمل المزايا الأخرى خيار القيام بتصوير العيش المتواصل في مراحل مختلفة، بما في ذلك التصوير في فيفو الزرد الكبار2، والقدرة على أداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية في الزرد اليرقات3. بالإضافة إلى ذلك، الزرد تملك قدرة التجدد عالية في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة بما في ذلك العظام، وهكذا تكون بمثابة نظام مفيد لدراسة أمراض الهيكل العظمى وإصلاح4،5.
مرض ترقق العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد (جيو) الذي ينجم عن العلاج الطويل الأجل مع الكورتيزون، على سبيل المثال أثناء علاج أمراض المناعة الذاتية مثل الربو أو التهاب المفاصل. يطور في حوالي 30% مرضى معاملة جلوكوكورتيكويد جيو ويمثل مشكلة صحية رئيسية6؛ ولذلك، من المهم للتحقق من أثر الكبت المناعي في أنسجة العظام في قدر كبير من التفصيل. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الزرد التي تتعامل مع الآلية المرضية لجيو في السنوات الأخيرة. وقد حملت فقدان العظام جلوكوكورتيكويد بوساطة في الزرد اليرقات، على سبيل المثال، مما أدى إلى تحديد هوية المركبات تكييف زيادة كتلة العظام في شاشة المخدرات7. وعلاوة على ذلك، قد تم تحاكي الآثار المثبطة التي يسببها جلوكوكورتيكويد العظام في جداول الزرد في المختبر و في فيفو8،9. هذه الاختبارات مقنعة جداً النهج، ولا سيما عندما يتعلق الأمر بتحديد هوية الرواية العقاقير المنشطة المثبطة للمناعة والعظام. بيد أنها جزئيا فقط تأخذ في الاعتبار اندوسكيليتون وقد لا أجريت في سياق التجدد. وهكذا، أنها لا تتيح تحقيق الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد خلال طرق سريعة لتكوين العظام الكبار، والتجدد.
نقدم هنا، بروتوكول تمكن الباحثين لدراسة آثار جلوكوكورتيكويد بوساطة على عظام الكبار الزرد تمر بالتجدد. نماذج الإصابة تشمل بتر جزئي زعنفة والذيلية الزرد، trepanation الجمجمة، وكذلك إنشاء الكسور رأي زعنفة (الشكل 1Aج-1)، وهي جنبا إلى جنب مع جلوكوكورتيكويد التعرض عن طريق الحضانة (الشكل 1E ). أننا استخدمت مؤخرا جزءا من هذا البروتوكول لوصف النتائج المترتبة على التعرض البردنيزولون، واحد من الأدوية القشرية توصف عادة، على الكبار الزرد تجديد زعنفة والجمجمة العظم10. في الزرد، الإدارة البردنيزولون يؤدي إلى انتشار osteoblast انخفاض، والتمايز osteoblast غير مكتملة والاستقراء السريع للمبرمج في نسب الوحيدات/بلعم10. في هذا البروتوكول، كما يصف لنا كيف يمكن إدخال الكسور في زعنفة عظمى وحيدة رأي قطاعات11، هذا النهج قد تكون مفيدة عند دراسة الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد على العظام التي تحدث أثناء تصليح الكسر. الأساليب المقدمة هنا سيساعد على مواصلة معالجة الأساسية لآليات العمل جلوكوكورتيكويد في سرعة تجديد العظام، ويجوز أيضا في أماكن أخرى من إدارة المخدرات الجهازية في السياق تجديد الأنسجة الزرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر جميع الأساليب الموصوفة هنا درسدن لانديسديريكتيون (السماح بالأرقام: "من الألف إلى الياء" د 24-9168.11-1/2008-1، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2011-52، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2013-5، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2013-14، "من الألف إلى الياء" DD24.1--5131/354/87).
1-إعداد مواد وحلول
ملاحظة: بريدنيسولون، مثل الكورتيزون الأخرى، يؤدي إلى الكبت المناعي. وبالتالي، يجب اتخاذ الاحتياطات للوقاية من العدوى في الحيوانات المعالجة أثناء التجربة. لهذا الغاية، اﻷوتوكﻻف الزجاج وير و 'أسماك المياه' (أي المياه التي تستخدم في تربية الكبار الزرد) قبل البدء التجربة.
- حساب عدد الزرد التي ستستخدم في هذه التجربة. من المؤكد أن تشمل الأفراد بمثابة عناصر التحكم.
- اﻷوتوكﻻف 600 مل قنينة الزجاج التي تغطي برقائق الألومنيوم مع شريط اﻷوتوكﻻف. الزرد سوف يعامل بشكل فردي، وبالتالي مطلوب الكأس الزجاج 1 كل الزرد.
- حساب كمية المياه الأسماك اللازمة للتجربة. 300 مل مطلوبة من كل فرد واليوم. تأخذ في الاعتبار طول مدة التجربة (مثل 1/7 أيام).
- تعبئة الزجاجات بالماء الأسماك، أغلق عليهم والاوتوكلاف الزجاجات مع شريط اﻷوتوكﻻف. ومن الناحية المثالية، استخدام زجاجات ل 2، ولكن يمكن استخدام زجاجات أخرى مثل 1 لتر أو 5 لتر، وكذلك.
ملاحظة: إذا كانت التجارب الطويلة (مثلاً 4 أسابيع/28 يوما) ويقتصر الكمية الزجاجات، تأكد من إعداد زجاجات لعدة أيام في وقت واحد على الأقل وكرر العملية (1.3 إلى 1.4) طوال التجربة. - إعداد حل أسهم البردنيزولون من البردنيزولون العقيمة التي تمت تصفيتها 100 ملم في ديميثيلسولفوكسيدي ([دمس]). تجميد الأسهم في 1 مل أو 2 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة مختبرين.
تنبيه: دائماً ارتداء ملابس عند العمل مع البردنيزولون (قفازات واقية ونظارات واقية ومعطف مختبر). - في اليوم الأول من التجربة، إعداد الحلول الحضانة مع البردنيزولون و [دمس]، على التوالي. وتحقيقا لهذه الغاية، إذابة الكمية المطلوبة من 100 مم البردنيزولون الأسهم الحل وإضافة البردنيزولون إلى السمك يعقم الماء بتركيز 50 ميكرومتر نهائي.
- لعلاجات التحكم، إضافة الحجم [دمس] المقابلة للسمك يعقم الماء. على سبيل مثال، لإنتاج 2 ل البردنيزولون المحتوية على أسماك المياه، إضافة 1 مل مخزون البردنيزولون 100 مم إلى 2 ل أسماك المياه. في آخر زجاجة 2 لتر من المياه الأسماك، أضف 1 مل [دمس]، في المقابل.
- العمل في مكان مناسب الذي تم تعيينه لإجراء العلاج بالعقاقير، ومن الناحية المثالية في غرفة في 27 درجة مئوية.
2-جيل إصابات في زعانف الزرد
ملاحظة: لتصيب العظام في زعانف الزرد، أداء بتر زعنفة (البتر، عادة في fin والذيلية) أو كسر أشعة الزعنفة عظمى منفردة (كسر النموذج). وتحقيقا لهذه الغاية تخدير الزرد الكبار أولاً.
- بتر الأعضاء
- لتخدير الزرد الكبار، تعد قطر 100 ملم طبق بتري تحتوي على 0.02% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (إيثيل-3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي) في المياه الأسماك (لا تحتاج هذه المياه أن يعقم).
- نقل الزرد واحد في وقت واحد إلى طبق بتري تحتوي على مرض التصلب العصبي المتعدد-222 باستخدام سمكة صافي واحتضان أنه حتى تقع على جانبه بدون حركة ولا تستجيب للمس. اختبار الأخير بلمس الزعنفة الشرجية مع الملقط حادة.
- انتظر حتى يتم التوصل إلى مستوى 4 من التخدير وهو المستوى المناسب ل استئصال زعنفة12. في هذه المرحلة، انخفض معدل حركة أوبيركولار وفقدان قوة العضلات والأسماك لا تتحرك عند اللمس12.
- تأخذ الملقط حادة ونقل الزرد أنايسثيتيزيد بعناية لغطاء المقلوب مم 100 طبق بيتري. مكان الزرد على جانبها الوحشي. تأكد من الزرد تكمن دائماً في نفس الاتجاه، على سبيل المثال إلى جانبهم الجسم الصحيح. مع مشرط أو شفرة حلاقة، يرسخ 50% fin (الشكل 1A, 2A).
ملاحظة: تعتمد سرعة التجدد زعنفة الزرد على كمية الأنسجة مستأصل زعنفة، أي أنسجة زعنفة أكثر هو مستأصل، أسرع fin لتجدد13. وهكذا تأكد الاختلافات في التجدد زعنفة التقليل إلى أدنى حد من الالتئام دائماً fin بنفس المستوى في جميع الزرد. - نقل الزرد المصابين الكأس زجاج يعقم التي تحتوي على 300 مل من البردنيزولون أو [دمس] التي تحتوي على السمك يعقم الماء. وتغطي الكأس الزجاج مع رقائق الألومنيوم لتجنب هروب الزرد.
- كرر الخطوات من 2.1.2 إلى 2.1.3 حتى يتم التوصل إلى العدد المطلوب من الزرد للتجربة.
- لتخدير الزرد الكبار، تعد قطر 100 ملم طبق بتري تحتوي على 0.02% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 (إيثيل-3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي) في المياه الأسماك (لا تحتاج هذه المياه أن يعقم).
- زعنفة الكسر
- إعداد ملم 100 [اغروس] المغلفة طبق بيتري بتدفئة حلاً [اغروس] 2% في المياه الأسماك أو E3 (الجنين وسائط 3، كلوريد الصوديوم 50 مم، 0.17 ملم كلوريد البوتاسيوم، كلوريد الكالسيوم 0.33 ملم، وسلفات المغنزيوم 0.33 ملم). صب بعناية تقريبا 10 – 15 مل الحل في طبق بيتري. ينبغي أن تغطي الجزء السفلي من الطبق تماما. واسمحوا [اغروس] يصلب.
- تخدير الزرد على النحو المبين في الفرع 2-1.
- تأخذ الملقط حادة ونقل الزرد أنايسثيتيزيد مم 100 طبق بتري [اغروس] المغلفة بعناية. مكان الزرد على جانبها الوحشي. تحت مجهر التشريح، انتشرت fin والذيلية تماما لتكون قادرة على التعرف على أشعة الزعنفة عظمى متميزة وزعنفه شرائح رأي. تأكد من الزرد تكمن دائماً في نفس الاتجاه، على سبيل المثال إلى جانبهم الجسم الصحيح.
- مع حقن إدخال إبرة (0.3 ملم × 13 ملم) بكسر في وسط قطعة رأي زعنفة عظمى (الشكل 1B). للقيام بذلك، الإبرة هو الضغط قليلاً إلى الجزء حتى يظهر وجود صدع (السهم في الشكل 2). بينما يؤدي ضغط لطيف للكسر من واحد فقط من هيميرايس المعارضة هما أقوى الضغوط ستؤدي إلى كسر كل قطاعات هيميراي.
- عدم إدخال عدد كبير جداً من كسور في الزعانف، منذ هذا سيضعف إلى حد كبير استقرار fin. كاقتراح، تطبيق الكسور في أشعة الزعنفة 3 إلى 5 فقط.
- تؤدي دائماً إلى كسور في الأجزاء المقابلة عبر أشعة الزعنفة مختلفة والزرد، على سبيل المثال في الزعنفة الظهرية أشعة 3 (7 أو 8) ورأى زعنفة ventral 3. مستوى الكسر الدانية القاصي مثالي في 3 الأجزاء الدانية لأشعة الزعنفة التشعب النقطة 11.
- نقل الزرد المصابين الكأس زجاج يعقم التي تحتوي على 300 مل من البردنيزولون أو [دمس] التي تحتوي على السمك يعقم الماء. وتغطي الكأس الزجاج مع رقائق الألومنيوم لتجنب هروب الزرد.
- كرر الخطوات من 2.2.2 إلى 2.2.5 حتى يتم التوصل إلى العدد المطلوب من الزرد للتجربة.
3-توليد إصابات الجمجمة كالفاريال (تريبانيشن)
ملاحظة: يتم كالفاريا في الزرد مثلى للعظام كالفاريال في الثدييات. وهكذا، تمثل هذه العظام اكسوسكيليتال14 أنسجة ذات أهمية خاصة عند دراسة الآلية المرضية لجيو. لتصيب الجمجمة، يقوم trepanation بحفر حفرة في فرونتال نظام التشغيل و/أو نظام التشغيل باريتالي (الشكل 1، ج 2) بمساعدة ميكرودريل11.
- تخدير الزرد وفقا للبند 2-1.
- عقد الزرد أنيسثيتيزيد تستقيم مع الملقط، حيث تكون العظام كالفاريال مرئية جيدا تحت مجهر تشريح من فوق (الشكل 1).
- حدد موقع ميكرودريل الدورية في وسط عظم جبهي (فرونتال Os) ولمس العظام. ثقب المنتجة حجم لدغ ميكرودريل (500 ميكرومتر،، من الشكل 2 الشكل 3).
ملاحظة: تأكد من عدم نقل ميكرودريل أفقياً بينما تنتج الإصابة. كما تتوقف على الفور عندما يسقط مقاومة العظم فجأة. لا حفر أي زيادة، وإلا سيكون الدماغ التالفة 15. - نقل الزرد المصابين إلى قفص مملوءة بالماء الأسماك حتى أنه يتعافى تماما من التخدير. مشاهدة بعناية.
- نقل الزرد المصابين إلى أسماك المياه بالإضافة إلى البردنيزولون أو [دمس] التي تحتوي على زجاج الكأس.
4-معاملة الزرد أثناء الحضانة
ملاحظة: أثناء تطبيق بريدنيسولون/[دمس]، المخدرات التي تحتوي على أسماك المياه يحتاج إلى تغيير يوميا، ويتم تغذيتها بانتظام الزرد.
- تغييرات الماء
- تبادل الماء الأسماك وذوبان الجليد 100 مم البردنيزولون المخزون وإعداد المبلغ المطلوب من 50 ميكرومتر البردنيزولون في الأسماك يعقم المياه الطازجة كل يوم من فترة العلاج. إعداد [دمس] التي تحتوي على مياه أسماك الزرد التحكم تبعاً لذلك.
- تأخذ كوب زجاج تحتوي على الزرد مساكن واحد في حضانة وحلها ونقل الحل بما في ذلك في الزرد إلى حاوية مناسبة، مثلاً قفص مساكن مؤقتة.
ملاحظة: دوماً استخدام حاويات المؤقتة منفصلة بريدنيسولون و [دمس] يعامل الزرد، على التوالي، للتأكد من عدم الحصول على تعرض [دمس] تحكم الزرد البردنيزولون والعكس بالعكس. - إعادة ملء كوب الزجاج مع المخدرات الطازجة التي تحتوي على أسماك المياه (300 مل).
- نقل في الزرد من الحاوية المؤقتة إلى الكأس الزجاجية التي تحتوي على الحل حضانة جديدة باستخدام سمكة صافي. إعادة وضع إحباط لتجنب هروب الزرد.
- إذا تجاوز الوقت للتجربة 2 أسابيع، تبادل قنينة الزجاج.
- تغذية
- خلال فترة العلاج قصيرة (لمدة تصل إلى يومين) لم آر الزرد. خلال تجارب أطول، تغذية الزرد. عناية خاصة لتجنب التلوث الحل الحضانة. وهكذا، تغذية مع موفر الارتيميا بدلاً من الطعام فليك، وفقط كل يوم الثاني.
ملاحظة: الارتيميا وتستخدم بانتظام لتغذية الصغار الزرد، وينبغي أن تكون متاحة في وحدة هالتيرينج الزرد.- تقريبا آر ح 2 قبل أن يتم تبادل المياه الأسماك، الزرد مع ssp الارتيميا في قنينة الزجاج بهم. للقيام بذلك، استخدم ماصة بلاستيكية وتغذية 0.5 إلى 1 مل من مظلل الارتيميا حل كل كوب الزجاج.
- انتظر ح 2 وتبادل الحل الحضانة مع المخدرات الطازجة التي تحتوي على أسماك المياه وفقا للفرع 4-1.
- خلال فترة العلاج قصيرة (لمدة تصل إلى يومين) لم آر الزرد. خلال تجارب أطول، تغذية الزرد. عناية خاصة لتجنب التلوث الحل الحضانة. وهكذا، تغذية مع موفر الارتيميا بدلاً من الطعام فليك، وفقط كل يوم الثاني.
5-تحليل العينات
ملاحظة: بعد حضانة الزرد المصابين في بريدنيسولون و [دمس] التي تحتوي على أسماك المياه، على التوالي، أما إجراء تحليلات التمعدن/تكلس العظام (5.1 إلى 5.3) أو القيام بتصوير مباشر من الزرد تحت مجهر تشريح (5.4) 1011،،16. استخدام التصوير الحي لتحديد طول الزعنفة تجديد والكشف عن الاختلافات في التعبير الجيني مراسل في الزرد المحورة وراثيا.
-
تثبيت أنسجة للفائدة
- للتثبيت من زعانف و/أو الجماجم إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني وتجميد في-20 درجة مئوية للتخزين. استخدام طازج 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني أو ذوبان الجليد المبلغ المطلوب قبل الاستخدام. 2 في المائة بدلاً من ذلك، يمكن استخدام منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني.
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة وينبغي التعامل معها بعناية تحت غطاء دخان. ارتداء الملابس الواقية. - لتثبيت زعانف تحضير طبق بيتري صغيرة (مثلاً 30 ملم) مع الباردة 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني، وتأكد من أن الجزء السفلي من الطبق مغطى تغطية كاملة. لتثبيت جماجم، وإعداد وعاء زجاجي قليلاً مع غطاء أو أنبوب مع الباردة 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني.
تنبيه: التعامل مع منهاج عمل بيجين الذي يحتوي على الحلول فقط تحت غطاء الدخان كما أنها سامة. ارتداء الملابس الواقية. - حصاد الأنسجة للفائدة.
- حصاد تجديد أنسجة زعنفة أو زعانف مع كسور تخدير الزرد وفقا للبند 2-1 أو euthanize الزرد وفقا المقطع 5.1.5.
- نقل الزرد أنايسثيتيزيد إلى غطاء طبق بيتري. باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة، حصاد تجديد fin. تأكد من أن تشمل الأنسجة السيجارة في تجديد زعانف تسهيل معالجة الأنسجة المقطوع.
- إصلاح زعانف شقة في منهاج عمل بيجين الذي يحتوي على طبق بيتري في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ويتجنب التثبيت مسطح الشباك أنسجة زعنفة أثناء التثبيت.
- لإصلاح مسطحة، انتزاع الأنسجة زعنفة مع الملقط غرامة واحدة عند الحافة الظهرية أو البطني من الجدعة وتزج أنه في تثبيت الحل. الاستيلاء على الحافة المقابلة من عقب السيجارة مع ملقط غرامة ثانية وخفض الأنسجة على الجزء السفلي من الطبق قليلاً.
- عقد 10 إلى 20 ثانية قبل إطلاق. لا ينبغي أن عقص أنسجة زعنفة بعد الآن. إذا حدث ذلك، كرر.
- Euthanize الزرد أجل حصاد الأنسجة الجمجمة المصابين. تعد قطر 100 ملم طبق بتري يحتوي على 0.1% مرض التصلب العصبي المتعدد-222 في أسماك المياه. نقل الزرد واحد في وقت واحد إلى طبق بتري تحتوي على مرض التصلب العصبي المتعدد-222 باستخدام شباك صيد. عند الوصول إلى مستوى 6 من التخدير (انهيار النخاع) الانتظار على الأقل 10 دقيقة أؤكد وفاة العينة12.
- استخدام مشرط قطع الرأس بالإضافة إلى أنسجة الجذع قليلاً عن باقي الجسم. تزج الأنسجة المقطوع في استعداد الحل منهاج العمل 4% في جرة زجاجية أو أنبوب بلاستيكي. إصلاح ح 24 في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.
- لتخزين عينات طويلة الأجل بعد التثبيت، غسلها ببرنامج تلفزيوني (3 × 20 دقيقة في RT) وعلاج الميثانول في سلسلة متزايدة ميثانول (1 × 30 ٪، 1 x 50%، 1 x 70%، 2 × 100 ٪ الميثانول في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في كل).
- تخزينها في 100 ٪ الميثانول عند-20 درجة مئوية. وبخلاف ذلك، مباشرة المضي قدما في تلطيخ العظام أو غيرها من التحليلات بعد الغسل ببرنامج تلفزيوني.
- للتثبيت من زعانف و/أو الجماجم إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني وتجميد في-20 درجة مئوية للتخزين. استخدام طازج 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني أو ذوبان الجليد المبلغ المطلوب قبل الاستخدام. 2 في المائة بدلاً من ذلك، يمكن استخدام منهاج عمل بيجين في برنامج تلفزيوني.
-
عظم تلطيخ تقنيات أنا (تلطيخ الأليزارين الأحمر)
ملاحظة: هذا تلطيخ فتتم وفقا ليدين van et al. 199617 و وكر & 2007 كيميل18 مع بعض التعديلات.- لتنفيذ الأليزارين الأحمر تلطيخ زعانف الكبار أو الجماجم، الحصاد وإصلاح النسيج كما هو موضح في المقاطع 5.1.
- إذا تم تخزين العينات في الميثانول في-20 درجة مئوية، ترطيب عينات عن طريق القيام سلسلة ميثانول معكوس (70%، 50% و 30% في برنامج تلفزيوني، كل دقيقة 1 × 20) وتغسل مرتين 20 دقيقة مع برنامج تلفزيوني. تغسل العينات لمدة 5 دقائق الحد الأدنى مع المياه.
- للقيام بتلوين الأليزارين الأحمر في الجماجم، معالجة العينات مع التربسين 50 ملغ/مل في 30% المشبعة Na2ب4س7 في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. عينات من الصخور خلال هذا الوقت. عينات شطف في 30% المشبعة الحل7 4س2ب نا. تغسل العينات مع المياه 2 مرات لمدة 5 دقائق. لا يتم إجراء هذه الخطوة لانسجة زعنفة.
- إضافة حل الأليزارين الأحمر (الجزء باء: 0.5% S الأليزارين الأحمر المسحوق، والغليسيرول 10% في المياه) والصخور العينات أثناء حضانة في الاختيار الرايت لتلطيخ بعد 1، 2، 4 ح أو بين عشية وضحاها.
- لمسح العينات تعاملهم مع سلسلة والغليسيرول: هيدروكسيد بوتاسيوم 1% متناقصة (بين عشية وضحاها 3:1، 1:1 بين عشية وضحاها، بين عشية وضحاها 1:3).
- تخزين العينات في حل هيدروكسيد البوتاسيوم 0.1% 1:1:80 % والغليسيرول وجبل لهم مع والغليسيرول 80% للتصوير.
ملاحظة: للجمع بين السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر تلطيخ عينات علاج مع السيان الأزرق تلطيخ الحل (الجزء ألف: النهائي 0.02 في المائة السيان الأزرق، 50 مم مجكل2، 70% إيثانول) بعد الإماهة (القسم 5.2.2) ح 2 في علاج الرايت زعانف مع سلسلة إيثانول تناقص في 50 مم مجكل2 (70%، 50%، 30%، كل 1 × 15 دقيقة)، والمياه والصرف الصحي للحد ني ح 1 (3 × 20 دقيقة) في منزوع الماء. المضي قدما في الأليزارين الأحمر تلطيخ (الفرع 5-2).
-
عظم تلطيخ تقنيات الثاني (صبغة كالسين)
ملاحظة: للكشف عن ترسب الكالسيوم في فنلندا كسور وإصابات الجمجمة، هي المحتضنة الأسماك الحية في كالسين التي تحتوي على الحل.- إعداد الكمية المطلوبة من كالسين 0.2% في المياه (درجة الحموضة 7.5). تأكد من الرقم الهيدروجيني المحايدة. استخدم 1 م هيدروكسيد الصوديوم لتعديل درجة الحموضة.
- احتضان حتى الزرد 3 في وقت واحد في 100 مل من محلول كالسين لمدة 20 دقيقة في كوب زجاج مغطاة برقائق الألومنيوم.
- نقل في الزرد إلى أخلطه مع الماء الأسماك. فلتسبح بإيجاز قبل نقلهم إلى أخلطه جديدة مع أسماك المياه. السماح لهم بالسباحة في هذا الكأس الجديدة لمدة 20 دقيقة لغسل. التقاط الصور (انظر الفرع 5-4).
-
يعيش التصوير من الزرد
- استخدم هذا الأسلوب للحصول على صور لتجديد أنسجة العظام كما هو الحال في فنلندا أو جمجمة طوال التجربة دون التضحية الزرد. تخدير الزرد وفقا للبند 2-1.
- للحصول على صور تجدد زعنفة، نقل الزرد أنايسثيتيزيد على [اغروس] المغلفة بيتري طبق (انظر الفرع 2.2.1 و الشكل 1B).
- للحصول على الصور من تجديد عظام الجمجمة، ضع الزرد تستقيم في الأسفنج (الشكل 1) أو وضعه في طبق [اغروس] المغلفة التي أعدت لعقد جذع الزرد.
- الحصول على الصور في التكبير المطلوب وقرار استخدام إعداد ستيريوميكروسكوبيك.
- العودة الزرد إلى حاوية مع الطازجة أو العقاقير التي تحتوي على أسماك المياه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم البروتوكول المعروضة هنا مرارا وتكرارا للحث على تكوين العظام السريع أثناء التجديد الزرد زعنفة والجمجمة10،،من1116. في تركيبة مع الأسلوب الذي عرضت الإدارة البردنيزولون، يمكن متابعة الدراسات المتعلقة بالآثار في البردنيزولون أثناء تجديد العظام. على سبيل المثال، يمكن إجراء دراسات بشأن تكوين العظام وتمعدن في تجديد. البردنيزولون، كسائر19،الكورتيزون20، يؤدي إلى تثبيط عموما زعنفة التجدد، بما في ذلك تكوين العظام، كما الكشف عنها بواسطة الأليزارين الأحمر تلطيخ على إصلاح أنسجة زعنفة والذيلية (الشكل 3A). وبالمثل، البردنيزولون أثر المماطلة بشأن إغلاق إصابة الجمجمة (كالفاريال)، الذي يمكن توضيحه الأليزارين الأحمر (الشكل 3B) أو في فيفو تلطيخ كالسين. وبالإضافة إلى ذلك، تمارس البردنيزولون أثر عميق للالتهابات في أنسجة زعنفة والجمجمة، بتحريك المبرمج في نسب الوحيدات/بلعم. بلعم انخفاض أرقام يمكن الكشف عنها بواسطة immunohistochemistry على الأنسجة المجمدة الفروع، مثلاً، باستخدام جسم مشري المضادة في محوره وراثيا mpeg1: مشري الزرد (الشكل 3)10،21 . وبالمثل، يمكن تحليل عدد وتوزيع، وانتشار والمبرمج من أنواع الخلايا الأخرى من الاهتمام سواء في أكسو-واندوسكيليتون (مثلاً، فقرات) مع مساعدة إيمونوهيستوتشيميستري.
الشكل 1 : إجراءات تنفذ في الزرد. (أ) استئصال زعنفة والذيلية (البتر) في فظاعتها الزرد بمساعدة مشرط. خط متقطع أحمر يشير إلى مستوى البتر. زعنفة (ب) رأي الكسر في الزرد فظاعتها نفذت مع إبرة حقن تحت ستيريوميكروسكوبي. هو وضع طبق بتري [اغروس] المغلفة الأسماك أثناء الإجراء. [اغروس] المغلفة أطباق بيتري تستخدم أيضا للحصول على صور زعانف الزرد أثناء تجديد أو إصلاح الكسر. (ج) Trepanation كالفاريا (إصابة الجمجمة) أداؤها في الزرد أنايستيتيزيد مع المساعدة من ميكرودريل تحت ستيريوميكروسكوبي. (د) صورة الحصول على تجديد عظم الجمجمة بعد الإصابة. يتم وضع الزرد أنايسثيتيزيد تستقيم في الأسفنج والصور يتم الحصول عليها بالمساعدة من ستيريوميكروسكوبي. طبق بيتري مليء بأسماك المياه التي تحتوي على 0.02% مرض التصلب العصبي المتعدد-222. (ﻫ) حضانة الزرد في البردنيزولون أو [دمس] التي تحتوي على أسماك المياه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مشاهدة حية مجهرية من الإصابات في ح 0 بعد إصابة hpi)- (أ) زعنفة والذيلية أمبوتاتيد. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) Fractured زعنفة رأي. يتم الإشارة إلى الكسر السهم الأحمر. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) تريباناتيد الجمجمة. تتم الإشارة إلى موقع الإصابة برأس السهم الأبيض. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الممثل نتائج العلاج البردنيزولون في الزرد الكبار- (أ) اليزارين زعنفة الملون الأحمر تجدد البتر بعد 14 يوما (إدارة الشؤون السياسية) وأيام للعلاج (dt). زعنفة المعالجة البردنيزولون إنشائها هي أقصر (غير معروضة)، ومجال أصغر الأليزارين الأحمر هو الكشف عن مصفوفة العظام إيجابية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) الأليزارين الأحمر الملون الجماجم في 7 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة) ودينارا. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن10. كريوسيكشن (ج) عرض ليصب الجمجمة والدماغ الأنسجة (البردنيزولون) المعالجة وغير المعالجة ([دمس]) تيراغرام (mpeg1: مشري) × تيراغرام (أستر: نجفب) الأسماك مراسل المحورة وراثيا، التي وصفت الضامة (خلايا المناعة الفطرية) باللون الأحمر 21 وتشكيل خلايا الاوستيوبلاستس العظام المسماة في الخضراء22. عدد الضامة قطرات كبيرة في الزرد البردنيزولون معاملة. وأجرى إيمونوهيستوتشيميستري كما هو موضح في جيورتزين et al. 10-تتم تسمية الأنوية باللون الأزرق (DAPI). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. فرنك بلجيكي: حقل مشرق، epid: البشرة، الجبهة الوطنية: العظام. وقد تم تعديل هذا الرقم مع إذن10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أثبتت الزرد مفيدة في الهيكل العظمى للبحث فيما يتعلق بالعديد. طفرات مختارة تحاكي جوانب أمراض البشرية مثل تكون العظم الناقص أو الفصال العظمى23،24،25،،من2627، واليرقات وكذلك جداول تستخدم تحديد المجمعات الابتنائية العظام في جزيء صغير شاشات7،،من2829. علاجات الزرد بالأدوية التي يتم تطبيقها في الممارسة السريرية هي علاوة على ذلك مناسبة بشكل مثالي لدراسة الآثار الضارة المفترضة، على سبيل المثال في أنسجة العظام. وفي هذا السياق، وجود سرعة تجديد العظام مفيد للتحقيق في الآليات الكامنة وراء أوجه القصور العظام التي يسببها الدواء. نقدم هنا، بروتوكول الذي يتم الجمع بين العلاج من تعاطي المخدرات مع البردنيزولون جلوكوكورتيكويد, دواء للالتهابات يشيع استخدامها مع الآثار السلبية في أنسجة العظام، ومع أنظمة التجدد العظام الكبار. هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح للحث على كآبته والعظام الآثار المثبطة في الأنسجة التجدد من الزرد، ويمكن تكييفها أيضا لإجراء دراسات عن تأثير البردنيزولون وغيرها من المخدرات في أنسجة البالغين مثل العمود الفقري. وينبغي مراعاة التفاصيل التالية عندما يتم تنفيذ العلاج بالعقاقير المثبطة للمناعة في زعنفة تمر الزرد أو تجديد الجمجمة.
إمكانية تكرار نتائج لفحوصات الإصابة
أثناء تجديد زعنفة، سرعة التجدد (أي إعادة نمو أنسجة زعنفة، بما في ذلك العظام، كل وحدة زمنية) يعتمد كثيرا على كمية الأنسجة fin التي يجري مستأصل13. تجنبا للتغيرات غير المرغوب فيها التجدد زعنفة، تأكد من الالتئام دائماً مبالغ مماثلة لانسجة زعنفة في جميع العينات.
الكسور العظمية الزعانف رأي هو الإعدام عن طريق دفع قليلاً إبرة حقن في وسط قطعة رأي زعنفة عظمى المختار. كما أشعة الزعنفة عظمى تتكون من 2 معارضة هيميرايس، تحدد مقدار الضغط المستخدمة إذا هي مكسور هيميرايس فقط أحدهما أو كلاهما. ونحن نفضل تطبيق الضغط المنخفض للكسر هيميراي واحدة فقط، لأن الكسر من كلا هيميرايس يميل إلى زعزعة استقرار رأي زعنفة، ونتيجة لذلك قد فصل خلال أيام التالية.
يجب أن تقوم كالفاريال إصابات الجمجمة بثقب ميكرو بحذر. إذا كان الضرر بالدماغ (أي، المخيخ) الوضعي ومرضوا ستصبح العجز الظاهر بسباحة خاطئ من العينة15. الزرد بسبب إصابة في الدماغ قد تظهر ردود الفعل السلبية للعلاج من تعاطي المخدرات، ولا ينبغي أن تستخدم لدراسة تجديد العظام.
اعتبارات تتعلق بالعلاج بالعقاقير
لإحداث أثر المثبطة للمناعة والمضادة التجدد متسقة في الزرد الكبار نوظف جرعة البردنيزولون ميكرومتر 50 في أسماك المياه. وقد حددنا هذه الجرعة خلال تجارب الاستجابة للجرعة الأولى في الزرد اليرقات والكبار. وهكذا، ينبغي أن تنفذ تجارب الجرعة والاستجابة لتحديد الجرعة المطلوبة من العوامل المثبطة للمناعة الأخرى التي يمكن تطبيقها. للبالغين، ونوصي بالجمع بين هذه التجارب الأولى مع نظام التجديد زعنفة، كما طول تجديد زعنفة قراءات حساسة للغاية وسهلة الكشف للتعديلات الأنسجة.
عند معالجة كآبته العينات المعالجة للعدوى الميكروبية. ولذلك، من المهم السكن واحدة في يعقم قنينة تحتوي على السمك يعقم الماء. على الرغم من أن هذه الظروف أكثر تعقيداً الاضطلاع وليست عقيمة، أنها تساعد على تقليل الإصابة في الزرد المعالجة. نحن لا بريتريت ('تعقيم') بيض الارتيميا. ومع ذلك، قد يكون هذا تدبيرا إضافيا لمنع العدوى في الزرد، إذا لزم الأمر. وعلاوة على ذلك، يمكن إضافة مواد مطهرة مثل الميثيلين الأزرق (1%) لصيد السمك في المياه قبل الاستخدام.
تجارب مع البردنيزولون، قصيرة وطويلة الأجل وتتطلب التغيرات اليومية من المياه الأسماك. ونحن قد تعامل الزرد الكبار لمدة 8 أسابيع. العلاج لعدد كبير من الأفراد لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى بعض تجريبية 'عبء'، وينبغي أن يخطط لها بعناية. أنه أمر حيوي للمبالغ المطلوبة من الأسماك يعقم المياه والزجاج وير جاهزة على الدوام. على الرغم من أن هذا لم يتم اختباره في الزرد (على حد علمنا)، غرس الكريات بطء الإفراج عن المخدرات لفائدة قد تمثل بديلاً قيماً للتعرض طويل الأجل للمخدرات في الزرد.
التحليلات في الزرد المحورة وراثيا
نقدم هنا، طرق 2 وصمة عار التمعدن/تكلس الأنسجة العظام الأليزارين الأحمر وتلطيخ كالسين. بالإضافة إلى ذلك، نعرض كيفية صورة تجديد زعنفة والجمجمة الأنسجة في فيفو بالمساعدة من ستيريوميكروسكوبي. الأسلوب الأخير مفيدة للغاية، إذا كان وراثيا الزرد الإبلاغ عن عدد أو نشاط للخلايا المحددة، مثل خلايا الاوستيوبلاستس أو الخلايا المناعية، التي يجري تصويرها. على سبيل المثال، قبل التضحية بجراح ويعامل البردنيزولون الزرد لأداء تلطيخ الأليزارين الأحمر، تجدد الزعانف أو الجماجم تريباناتيد قيد الإصلاح يمكن أن يتم تصويرها للبحث عن وجود وعدد ونشاط لتشكيل خلايا الاوستيوبلاستس في العظام السطر مراسل المعدلة وراثيا تيراغرام (أستر: نجفب)22. وبالمثل، يمكن تصور الإغلاق البشرة الجرح الذي يحدث خلال يوم واحد، في الأسماك المحورة وراثيا، والتي تعبر عن فلوروفوري في أنسجة البشرة. أيضا، يمكن رصد تراكم الخلايا المناعية في موقع الإصابة (أو غيابها في البردنيزولون معاملة الأفراد) بسهولة مع ستيريوميكروسكوبي مجهزة بمصدر الضوء المطلوبة والمرشحات.
وباختصار، يمكن استخدام البروتوكول المعروضة هنا لدراسة آثار العوامل المثبطة للمناعة والأدوية الأخرى بعد الإدارة النظامية في الزرد التي تشهد التجديد العظام أما في فنلندا أو في الجمجمة. سيكون هذا مفيداً لتحديد الآلية المرضية لجيو والتحقيق الآليات الكامنة وراء التجدد العظام ناجحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من مركز "درسدن العلاجات التجدد" ("الزرد كنموذج لكشف آليات فقدان العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد") وعلاوة على ذلك بمنحه قدرها الأوقيانوغرافية الألمانية (ترانسريجيو 67، المشروع 387653785) للمفتاح الخارجي. ونحن ممتنون جداً كاثلين يان وتشيكورو Avinash للتوجيه والمساعدة على أداء trepanation كالفاريا وكسور في أشعة الزعنفة عظمى. تجارب صممت، وتنفيذها وتحليلها من قبل كجم وكيه. FK كتب المخطوطة. كما نود أن نشكر لامبرت كاترين وكوداك نيكول، وأعضاء آخرين من مختبرات نوف والعلامة التجارية للمساعدة التقنية ومناقشة. كما يذهب شكرنا لماريكا فيشر ويتكا ميتشلينج لرعاية الأسماك الممتازة ونوف هنرييت وكوري جوش لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
