Summary
Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.
Abstract
Zebravis kunnen verschillende organen, met inbegrip van de aanhangsels (vinnen) regenereren na amputatie. Het gaat hierbij om de regeneratie van bot, die binnen ongeveer twee weken na verwonding verrot. Bovendien, zebravis kunnen genezen been snel na Schedeltrepanatie van de schedel, en repareren van fracturen die gemakkelijk kunnen worden ingevoerd in zebrafish bony fin rays. Deze schade assays vertegenwoordigen haalbaar experimentele paradigma's voor het testen van het effect van door de overheid gereguleerde drugs over de snelle vorming van bot. Hier beschrijven we het gebruik van deze 3 letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met systemische glucocorticoide behandeling, die bot remmende en immunosuppressieve effecten oefent. Wij bieden een workflow op hoe te bereiden voor immunosuppressieve behandeling in volwassen zebrafish, het uitvoeren van fin amputatie, Schedeltrepanatie van calvarial beenderen en fracturen van de fin, illustreren en beschrijven hoe het gebruik van glucocorticoïden is van invloed op de vorming van zowel bot Botcellen en cellen van de monocyt/macrofaag afkomst als onderdeel van aangeboren immuniteit in botweefsel.
Introduction
Zebravis vertegenwoordigen een krachtige diermodel gewervelde ontwikkeling en ziekte te studeren. Dit is de wijten aan het feit dat ze zijn kleine dieren die zeer goed fokken en dat hun genoom volledig gesequenceerd en vatbaar voor manipulatie-1 is. Andere voordelen zijn de optie voor het uitvoeren van verdere levende imaging in verschillende stadia, met inbegrip van in vivo imaging van volwassen zebrafish2, en de mogelijkheid voor het uitvoeren van hoge-doorvoer drug schermen in zebrafish larven3. Bovendien, zebravis bezitten een hoge regeneratief vermogen in een verscheidenheid van organen en weefsels, waaronder bot, en dus dienen als een nuttig systeem te bestuderen skelet ziekte en repareren van4,5.
Glucocorticoide-geïnduceerde osteoporose (GIO) is een ziekte die het gevolg is van langdurige behandeling met glucocorticoïden, bijvoorbeeld in het kader van behandeling van het auto-immune ziekten zoals reumatoïde artritis of astma. GIO ontwikkelt zich in ongeveer 30% van de glucocorticoide-behandelde patiënten en vertegenwoordigt een belangrijke gezondheid kwestie6; Daarom is het belangrijk om te onderzoeken de impact bij immuunsuppressie op botweefsel in groot detail. In de afgelopen jaren een scala aan zebrafish modellen die zich bezighouden met de pathogenese van GIO zijn ontwikkeld. Glucocorticoide-gemedieerde botverlies heeft zijn geïnduceerd in zebrafish larven, bijvoorbeeld, die hebben geleid tot de identificatie van achteraf verbindingen verhoging van de botmassa in een drug scherm7. Bovendien glucocorticoide-geïnduceerde bot remmende effecten hebben is geïmiteerd zebrafish schalen zowel in vitro als in vivo8,9. Deze testen zijn erg overtuigend benaderingen, met name als het gaat om de identificatie van nieuwe immunosuppressieve en bot anabole drugs. Echter zij slechts gedeeltelijk rekening wordt gehouden met de endoskeleton en niet zijn uitgevoerd in een regeneratieve context. Dus, laat ze niet het onderzoek van glucocorticoide-gemedieerde effecten tijdens snelle modi van volwassen, regeneratieve biomineralisatie.
Hier presenteren we een protocol waarmee onderzoekers glucocorticoide-gemedieerde effecten op volwassen zebrafish botten regeneratie ondergaan te bestuderen. Letsel modellen omvatten gedeeltelijke amputatie van de zebravis caudal fin, Schedeltrepanatie van de schedel, alsmede de oprichting van fin ray fracturen (figuur 1A-1 C), en worden gecombineerd met glucocorticoide blootstelling via incubatie (figuur 1E ). Onlangs hebben we een deel van dit protocol gebruikt om te beschrijven de gevolgen van blootstelling aan de prednisolon, één van de algemeen voorgeschreven corticosteroïd drugs, op volwassen zebrafish fin en schedel bot10regenereren. In zebrafish leidt prednisolon administratie tot verminderde osteoblast proliferatie, onvolledige osteoblast differentiatie en snelle inductie van apoptosis in de monocyt/macrofaag afkomst10. In dit protocol, ook beschrijven we hoe fracturen kunnen worden ingevoerd in één bony fin ray segmenten11, zoals deze aanpak nuttig zijn kan bij de studie van glucocorticoide-gemedieerde effecten op bot die zich kunnen voordoen tijdens de reparatie van de breuk. De methoden die hier gepresenteerd zal bijdragen tot verdere adres onderliggende mechanismen van glucocorticoide actie in snel herstel van bot en kunnen ook worden gebruikt in andere instellingen van systemische drug administration in de context van zebravis weefselregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden (toestaan van getallen: AZ 24D-9168.11-1/2008-1 met AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. bereiding van materialen en oplossingen
Opmerking: Prednisolon, zoals andere glucocorticoïden, leidt tot immunosuppressie. Aldus, moeten voorzorgsmaatregelen worden getroffen om te voorkomen dat infectie in behandelde dieren tijdens het experiment. Daartoe, autoclaaf glas ware en 'vissen water' (dat wil zeggen, het water dat wordt gebruikt voor de achterkant volwassen zebravis) voordat het experiment.
- Bereken het aantal zebrafish moet worden gebruikt in het experiment. Zorg ervoor dat de personen die als controles dienen te omvatten.
- Autoclaaf 600 mL glazen bekers die zijn bedekt met aluminiumfolie met autoclaaf tape. Zebravis afzonderlijk zal worden behandeld, dus 1 glas bekerglas is vereist per zebrafish.
- Bereken de hoeveelheid vis water die nodig zijn voor het experiment. 300 mL zijn nodig per persoon en dag. Rekening houden met de lengte van het experiment (bijvoorbeeld 1 week/7 dagen).
- Glazen flessen vullen met vis water, sluit ze en autoclaaf de flessen met autoclaaf tape. Idealiter gebruik 2 L flessen, maar andere flessen als 1 L of 5 L kan ook worden gebruikt.
Opmerking: Als experimenten lange zijn (bijvoorbeeld 4 weken/28 dagen) en de hoeveelheid glazen flessen is beperkt, zorg ervoor dat flessen voorbereiden op een minimum van enkele dagen tegelijk en herhaal het proces (1.3 tot en met 1.4) gedurende het gehele experiment. - Bereiden een prednisolon stockoplossing van steriele gefiltreerd 100 mM prednisolon in dimethylsulfoxide (DMSO). Het bevriezen van de voorraad in 1 mL of 2 mL microcentrifuge buis aliquots.
Let op: Altijd Draag beschermende kleding bij werken met prednisolon (beschermende handschoenen, veiligheidsbril, laboratoriumjas). - Op de eerste dag van het experiment, incubatie oplossingen met prednisolon en DMSO, respectievelijk te bereiden. Te dien einde het normbedrag van 100 mM prednisolon stockoplossing ontdooien en prednisolon toevoegen aan gesteriliseerde met autoclaaf vis water met een eindconcentratie van 50 µM.
- Voor de behandelingen van de controle, de overeenkomstige hoeveelheid DMSO aan gesteriliseerde met autoclaaf vis water te toevoegen. Als voorbeeld, 2 L prednisolon met vis water, voegt toe 100 mM prednisolon voorraad 1 mL tot 2 L vissen water. In een ander 2 L fles vis water, voeg 1 mL DMSO, dienovereenkomstig.
- Werken in een geschikte plaats die is aangewezen voor het uitvoeren van de drug behandelingen, ideaal in een kamer bij 27 ° C.
2. productie van verwondingen in Zebrafish vinnen
Opmerking: Om te verwonden bot in zebrafish vinnen, resectie van de fin (amputatie, meestal in de caudal fin) uitvoeren of breuk van de individuele bony fin rays (fractuur model). Te dien einde anaesthetize volwassen zebrafish eerst.
- Amputatie
- Om anaesthetize volwassen zebrafish, bereiden een diameter van 100 mm petrischaal met 0,02% MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoaat methanesulfonate) in water van de vis (dit water hoeft niet te worden gesteriliseerde met autoclaaf).
- Overbrengen in een zebravis op een moment de MS-222 met petrischaal met behulp van een net vis en Incubeer het totdat het ligt aan de kant zonder verkeer en niet reageert te raken. De laatste testen door het aanraken van de anaalvin met een botte Tang.
- Wacht tot niveau 4 van de verdoving wordt bereikt die het adequate niveau voor fin resectie12is. In dit stadium, het tempo van de operculaire beweging wordt verlaagd, spierspanning is verloren en de vis niet beweegt op touch12.
- Botte pincet te nemen en de verdoofde zebrafish zorgvuldig overbrengen in het omgekeerde deksel van de 100 mm petrischaal. Plaats de zebravis aan de laterale kant. Zorg ervoor dat de zebravis altijd liggen in dezelfde richting, bijvoorbeeld aan hun kant van de juiste instantie. Resect met een scalpel of een scheermesje, 50% van de fin (figuur 1A, 2A).
Opmerking: De snelheid van de zebravis fin regeneratie hangt af van de hoeveelheid gereseceerd fin weefsel, dat wil zeggen, het meer fin weefsel is gereseceerd, des te sneller de fin13regenereert. Dus, om te minimaliseren van variaties in fin regeneratie zorg ervoor dat altijd resect de fin op hetzelfde niveau in alle zebrafish. - De gewonde zebrafish overbrengen in een gesteriliseerde met autoclaaf glas bekerglas van 300 mL van prednisolon of DMSO met gesteriliseerde met autoclaaf vissen water. Dek het bekerglas glas af met aluminiumfolie om ontsnappen van de zebravis.
- Herhaal stap 2.1.2 naar 2.1.3 totdat het vereiste aantal zebrafish voor het experiment wordt bereikt.
- Om anaesthetize volwassen zebrafish, bereiden een diameter van 100 mm petrischaal met 0,02% MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoaat methanesulfonate) in water van de vis (dit water hoeft niet te worden gesteriliseerde met autoclaaf).
- Fin fractuur
- Bereiden van een agarose beklede 100 mm petrischaal door verwarming van een 2% agarose oplossing in water van de vis of E3 (embryo media 3, 50 mM natriumchloride, kaliumchloride van 0,17 mM, 0.33 mM calciumchloride, 0.33 mM magnesium-sulfaat). Giet zorgvuldig ongeveer 10-15 mL van de oplossing in de petrischaal. De onderkant van de schotel moet volledig worden gedekt. Laat de agarose stollen.
- Anaesthetize zebravis als beschreven in punt 2.1.
- Botte pincet te nemen en de verdoofde zebrafish zorgvuldig overbrengen in de agarose beklede 100 mm petrischaal. Plaats de zebravis aan de laterale kant. Onder de Microscoop dissectie, verspreid de caudal fin volledig om te kunnen identificeren van de verschillende bony fin rays en fin ray segmenten. Zorg ervoor dat de zebravis altijd liggen in dezelfde richting, bijvoorbeeld aan hun kant van de juiste instantie.
- Invoering van een breuk in het midden van een beenderige fin ray segment (figuur 1B) met een injectie naald (0.3 mm x 13 mm). Om dit te doen, wordt de naald geduwd lichtjes op het segment tot een barst wordt weergegeven (pijl in figuur 2B). Terwijl zachte druk leidt tot breuk door slechts één van de twee tegengestelde hemirays sterkere zal druk leiden tot breuk van beide segmenten van de hemiray.
- Niet voeren teveel fracturen bij vinnen, aangezien dit zal aanzienlijk afbreuk doen aan stabiliteit van de fin. Als een suggestie, fracturen alleen in 3 tot 5 fin stralen van toepassing.
- Altijd tot breuken in de overeenkomende segmenten over verschillende fin rays en zebrafish, bijvoorbeeld in de rugvin stralen 3, 7 (of 8) en ventrale fin ray 3. De proximale-distale niveau van breuk is ideaal op 3 segmenten proximale tot en met de fin rays bifurcatie punt 11.
- De gewonde zebrafish overbrengen in een gesteriliseerde met autoclaaf glas bekerglas van 300 mL van prednisolon of DMSO met gesteriliseerde met autoclaaf vissen water. Dek het bekerglas glas af met aluminiumfolie om ontsnappen van de zebravis.
- Herhaal stap 2.2.2 tot en met 2.2.5 totdat het vereiste aantal zebrafish voor het experiment wordt bereikt.
3. generatie van Calvarial schedel verwondingen (Schedeltrepanatie)
Opmerking: De calvariae in zebrafish zijn homoloog aan calvarial botten in zoogdieren. Dus, deze exoskeletal botten14 vertegenwoordigen een weefsel van bijzonder belang bij de studie van de pathogenese van GIO. Om te verwonden de schedel, wordt Schedeltrepanatie uitgevoerd door het boren van een gat in de Os frontale en/of Os parietale (Figuur 1 c, 2 C) met behulp van een microdrill11.
- Anaesthetize de zebravis overeenkomstig punt 2.1.
- Houd de narcose zebrafish rechtop met een tang, zodat de calvarial beenderen goed zichtbaar onder een Microscoop dissectie above (Figuur 1 c zijn).
- Zoek de roterende microdrill in het midden van de voorhoofdsbeen (Os frontale) en raken het bot. De geproduceerde hole is van de grootte van de microdrill burr (500 µm, figuur 2C, , figuur 3B).
Opmerking: Zorg dat de microdrill niet zijdelings te bewegen terwijl de productie van de schade. Ook stopt onmiddellijk wanneer de weerstand van het bot plotseling daalt. Boor een niet verder, anders zullen de hersenen beschadigd 15. - De gewonde zebrafish overbrengen in een kooi gevuld met vis water totdat het volledig van anesthesie herstelt. Het scherp in de gaten.
- De gewonde zebrafish overbrengen in een vis water plus prednisolon of DMSO met glas bekerglas.
4. behandeling van zebravis tijdens de incubatie
Opmerking: Tijdens de toepassing van prednisolon/DMSO, de drug met vis water moet worden dagelijks verschoond, en zebrafish moeten regelmatig worden gevoed.
- Wijzigingen van de water
- Om te wisselen van het vis-water, 100 mM prednisolon voorraad ontdooien en bereiden het normbedrag van 50 µM prednisolon in gesteriliseerde met autoclaaf vis water vers dagelijks van de behandelingsperiode. DMSO met vis water voor het besturingselement zebrafish dienovereenkomstig voor te bereiden.
- Neem een glas bekerglas van een zebravis één gehuisvest in het incubatie-oplossing en breng de oplossing met inbegrip van de zebravis in een geschikte container, bijvoorbeeld een tijdelijke huisvesting kooi.
Opmerking: Altijd gebruik aparte tussentijdse containers voor Prednisolon en DMSO behandeld zebrafish, respectievelijk, om ervoor te zorgen dat DMSO controle zebravis niet doen krijgen blootgesteld aan Prednisolon en vice versa. - Het bekerglas van het glas bijvullen met verse drug met vis water (300 mL).
- De zebravis van de tussentijdse container overbrengen aan de glazen bekerglas verse incubatie oplossing met behulp van een vis netto. Zet terug de folie om te ontsnappen van de zebravis voorkomen.
- Als de tijd van het experiment groter is dan 2 weken, wisselen de glazen bekers.
- Voeding
- Tijdens korte behandelingen (voor maximaal 2 dagen) Don't feed zebrafish. Voeden tijdens langere experimenten, zebravis. Neem speciale zorg om verontreiniging van de incubatie-oplossing. Zo voeden met Artemia ssp. in plaats van met de Vlok voedsel, en alleen op elke tweede dag.
Opmerking: Artemia worden regelmatig gebruikt om te voeden jonge zebravis en moet beschikbaar zijn in de zebravis haltering eenheid.- Ongeveer feed 2 uur voordat het water vis is uitgewisseld, zebrafish met Artemia ssp in hun glazen bekers. Om dit te doen, gebruik van een plastic pipet en voeden van 0,5 tot 1 mL gearceerde Artemia oplossing per glas bekerglas.
- Wacht 2 h en uitwisselen van de incubatie-oplossing met verse drug met vis water volgens paragraaf 4.1.
- Tijdens korte behandelingen (voor maximaal 2 dagen) Don't feed zebrafish. Voeden tijdens langere experimenten, zebravis. Neem speciale zorg om verontreiniging van de incubatie-oplossing. Zo voeden met Artemia ssp. in plaats van met de Vlok voedsel, en alleen op elke tweede dag.
5. de analyses van de monsters
Opmerking: Na een incubatieperiode van gewonde zebrafish in Prednisolon en DMSO met vis water, respectievelijk bot mineralisatie/verkalking analyses (5.1-5.3) uitvoeren of verrichten live beeldvorming van zebravis onder de Microscoop dissectie (5.4) 10,11,16. Levende imaging gebruiken om fin toevoegen lengte te bepalen en te detecteren van de verschillen in genuitdrukking verslaggever in transgene zebrafish.
-
Fixatie van weefsels van belang
- Voor fixatie van vinnen en/of schedels bereiden van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en bevriezen bij-20 ° C voor opslag. Gebruik vers bereide 4% PFA in PBS of dooi het normbedrag vóór gebruik. U kunt ook 2% PFA in PBS kan worden gebruikt.
Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan, onder een zuurkast. Draag beschermende kleding. - Voor fixatie van vinnen bereiden een kleine petrischaal (bijvoorbeeld 30 mm) met koude 4% PFA in PBS en ervoor te zorgen dat de bodem van de schotel is volledig bedekt. Voor fixatie van schedels, het voorbereiden van een kleine glazen pot met deksel of een buis met koude 4% PFA in PBS.
Let op: Ingang PFA met oplossingen alleen onder de zuurkast want het is giftig. Draag beschermende kleding. - Oogst van het weefsel van belang.
- Om te oogsten regenereren fin weefsel of vinnen bij fracturen anaesthetize de zebravis overeenkomstig punt 2.1 of de zebravis overeenkomstig punt 5.1.5 euthanaseren.
- Het verdoofde zebrafish overbrengen in het deksel van een petrischaal. Met behulp van een scalpel of scheermesje, oogsten de fin regenereren. Zorg ervoor dat stomp weefsel in het regenereren van vinnen ter vergemakkelijking van de behandeling van het geoogste weefsel.
- Corrigeer vinnen plat in de PFA met petrischaal bij 4 ° C's nachts. Platte fixatie vermijdt curling tijdens fixatie van de fin weefsel.
- To fix plat, grijpen de fin weefsel met een fijne pincet aan de rand van het dorsale of ventrale van de stronk en dompel het in de fixatie-oplossing. Pak de tegenoverliggende rand van de stomp met een tweede fijne pincet en iets druk op het weefsel op de bodem van de schotel.
- Houd gedurende 10 tot 20 s vóór het vrijgeven. De fin weefsel moet niet meer omhoog krullen. Als dat zo is, herhaal.
- Euthanaseren zebrafish om te oogsten van de schedel van de gewonde weefsel. Bereiden van een diameter van 100 mm petrischaal met 0,1% MS-222 in vis water. Overbrengen in een zebravis op een moment de MS-222 met petrischaal met behulp van een visnet. Wanneer niveau 6 van de verdoving (Wallenberg ineenstorting) wordt bereikt wacht minstens 10 min te verzekeren van de dood van de model12.
- Met behulp van een scalpel, is afgesneden van het hoofd plus een kleine kofferbak weefsel van de rest van het lichaam. Dompel de geoogste weefsel in de bereide 4% PFA oplossing in de glazen pot of plastic buis. Fix voor 24 uur bij 4 ° C met zachte rockende.
- Voor het opslaan van monsters op lange termijn na fixatie, ze wassen met PBS (3 x 20 min op RT) en methanol-traktatie in een toenemende methanol-serie (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% methanol in PBS gedurende 20 minuten elk).
- Bewaar ze in 100% methanol bij-20 ° C. Anders direct doorgaan met bot kleuring of andere analyses na het wassen met PBS.
- Voor fixatie van vinnen en/of schedels bereiden van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS en bevriezen bij-20 ° C voor opslag. Gebruik vers bereide 4% PFA in PBS of dooi het normbedrag vóór gebruik. U kunt ook 2% PFA in PBS kan worden gebruikt.
-
Bot kleuring technieken ik (Alizarine rode kleuring)
Opmerking: Deze kleuring wordt uitgevoerd is afhankelijk van Eeden et al. 199617 en Walker & Kimmel 200718 met wijzigingen.- Standaardinteracties Alizarine rode kleuring op volwassen vinnen of schedels, oogst en monteren van weefsel, zoals beschreven in paragrafen 5.1.
- Als monsters werden opgeslagen in methanol bij-20 ° C, hydrateren monsters door het doen van een reeks van de inverse methanol (70%, 50% en 30% in PBS, elke 1 x 20 min) en spoel tweemaal 20 min met PBS. Wassen monsters voor 5 min minimum met gedeïoniseerd water.
- Te doen Alizarine rode vlekken in schedels, behandelen van monsters met 50 mg/mL trypsine in 30% verzadigd Na2B4O7 bij kamertemperatuur 's nachts. Rock monsters gedurende deze tijd. Spoelen monsters in 30% verzadigd Na2B4O7 oplossing. Wassen monsters met gedeïoniseerd water 2 keer voor elke 5 min. Deze stap wordt niet uitgevoerd voor de fin weefsel.
- Alizarine rode oplossing (deel B: 0,5% Alizarine rood S poeder, 10% glycerol in gedeïoniseerd water) toevoegen en rock van de monsters tijdens de incubatie bij RT. Check voor kleuring na 1, 2, 4 h of overnachting.
- Wissen monsters behandel hen met een afnemende 1% kalium hydroxide: glycerol serie (3:1 overnachting, 1:1 overnachting, 1:3 overnachtingen).
- Opslaan van de monsters in een 1:1 oplossing van 0,1% kaliumhydroxide: 80% glycerol en monteer ze met 80% glycerol voor imaging.
Opmerking: Voor gecombineerd Alcian blauw/Alizarine rode kleuring traktatie monsters met Alcian blauwe kleurstofoplossing (deel A: definitieve 0,02% Alcian blauw, 50 mM MgCl2, 70% ethanol) na rehydratie (punt 5.2.2) voor 2 h op RT. traktatie vinnen met een afnemende ethanol-reeks in 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, elke 1 x 15 min) en wastafel hen voor een minimum van 1 h (3 x 20 min) in gedeïoniseerd water. Doorgaan met Alizarine rode vlekken (punt 5.2).
-
Bot kleuring technieken II (calceïne kleuring)
Opmerking: U wilt opsporen afzetting van calcium in de fin fracturen en schedel verwondingen, levende vis worden geïncubeerd in calceïne met oplossing.- Het normbedrag van 0,2% calceïne in gedeïoniseerd water (pH 7.5) voor te bereiden. Zorg ervoor dat de pH is neutraal. Gebruik 1 M NaOH aan te passen van de pH.
- Incubeer tot 3 zebrafish gelijktijdig in 100 mL calceïne oplossing voor 20 min in een bekerglas van glas, bedekt met aluminiumfolie.
- De zebravis overbrengen in een bekerglas met water van de vis. Laat ze kort voor het overbrengen van hen naar een nieuw bekerglas met water van de vissen zwemmen. Laat ze zwemmen in deze nieuwe bekerglas voor 20 min te wassen. Neem foto's (zie punt 5.4).
-
Live imaging van zebravis
- Gebruiken deze aanpak voor het verkrijgen van beelden van het botweefsel, zoals in de fin of schedel gedurende het gehele experiment zonder in te boeten de zebravis regenereren. Anaesthetize de zebravis overeenkomstig punt 2.1.
- Beelden van fin regeneraat verwerven, overdracht van de verdoofde zebravis op een petrischaal agarose beklede (zie punt 2.2.1 en figuur 1B).
- Verwerven van beelden van het regenereren van de botten van de schedel, plaats de zebravis rechtop in een spons (Figuur 1 d) of plaats het in een agarose beklede schotel die is opgesteld om te houden van de romp van de zebravis.
- Afbeeldingen op de gewenste vergroting en de resolutie met behulp van een stereomicroscopic setup te verwerven.
- De zebravis terugkomen met een container met verse of drug met vis water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier gepresenteerd is herhaaldelijk gebruikt voor het opwekken van snelle biomineralisatie in de loop van de regeneratie van de zebravis fin en schedel10,11,16. In combinatie met de onderhavige methode van toediening van prednisolon, kunnen studies over de prednisolon effecten tijdens bot regeneratie worden nagestreefd. Bijvoorbeeld, kunnen studies over biomineralisatie en mineralisatie in de regenereren worden uitgevoerd. Prednisolon, leidt als andere glucocorticoïden19,20, tot algemene remming van fin regeneratie, met inbegrip van biomineralisatie, zoals gedetecteerd door Alizarine rode kleuring op vaste caudal fin weefsel (figuur 3A). Op dezelfde manier, prednisolon heeft een opschortende werking op (calvarial) schedel letsel sluiting, die kan worden geïllustreerd door Alizarine rood (figuur 3B) of in vivo calceïne kleuring. Daarnaast oefent prednisolon een diepgaand anti-inflammatoire effect in zowel de fin en de schedel weefsel, door triggering apoptosis in de monocyt/macrofaag bloedlijn. Verminderde macrofaag getallen kan worden gedetecteerd door immunohistochemistry op bevroren weefsel secties, bijvoorbeeld met behulp van een anti-mcherry antistof in transgene mpeg1: mCherry zebrafish (Figuur 3 c)10,21 . Ook kan het aantal, de distributie, de verspreiding en de apoptosis van andere celtypes belangstelling voor zowel de exo- en de endoskeleton (bijvoorbeeld wervels) worden geanalyseerd met behulp van immunohistochemie.
Figuur 1 : Procedures uitgevoerd in zebrafish. (A) resectie van de caudal fin (amputatie) in verdoofde zebrafish met behulp van een scalpel. De rode onderbroken lijn geeft het niveau van de amputatie. (B) Fin ray fractuur in verdoofde zebrafish uitgevoerd met een injectie naald onder de stereomicroscoop. De vis is een petrischaal agarose beklede opleggen tijdens de procedure. Petrischalen agarose beklede worden ook gebruikt voor het verwerven van beelden van de zebravis vinnen tijdens regeneratie of fractuur reparatie. (C) Schedeltrepanatie van de calvariae (de verwonding van de schedel) uitgevoerd in anaestetized zebrafish met behulp van een microdrill onder de stereomicroscoop. (D) beeld van de verwerving van het bot van de schedel te regenereren na blessure. Het verdoofde zebrafish staat rechtop in een spons en afbeeldingen zijn verworven met behulp van een stereomicroscoop. De petrischaal is gevuld met vis water bevattende 0,02% MS-222. (E) incubatie van zebrafish in prednisolon of DMSO met vis water. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Microscopische actuele weergave van de verwondingen bij 0 h post letsel hpi). (A) Amputated caudal fin. Schaal bar = 200 µm. (B) Fractured fin ray. De breuk wordt aangegeven door de rode pijl. Schaal bar = 100 µm. (C) Trepanated-schedel. De site van de schade wordt aangegeven door de witte pijlpunt. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatieve resultaten van prednisolon behandeling in volwassen zebrafish. (A) Alizarine rood gekleurd fin op 14 dagen bericht amputatie (dpa) en dagen van behandeling (dt regenereert). Prednisolon behandelde fin regenereert zijn korter (niet afgebeeld) en een kleinere domein Alizarine rood positieve bot matrix wordt gedetecteerd. Schaal bar = 500 µm. (B) Alizarine rood gekleurd schedels op 7 dagen post letsel (dpi) en dt. Schaal bar = 100 µm. Dit cijfer is aangepast met toestemming10. (C) Cryosection bekijken van ongedeerd schedel en hersenen weefsel van behandelde (prednisolon) en onbehandelde (DMSO) GS (mpeg1: mCherry) x GS (osterix: nGFP) verslaggever transgene vis, waarin macrofagen (aangeboren immuun cellen) worden aangeduid in het rood 21 en been vorming van botcellen worden aangeduid in groen22. Het aantal macrofagen daalt aanzienlijk in prednisolon behandeld zebrafish. Immunohistochemistry werd uitgevoerd zoals beschreven in Geurtzen et al. 10. kernen worden aangeduid in blauw (DAPI). Schaal bar = 20 µm. BF: helder veld, epid: epidermis, bn: bot. Dit cijfer is aangepast met toestemming10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis hebben bewezen nuttig in skelet onderzoek in vele opzichten. Geselecteerde mutanten nabootsen aspecten van menselijke ziekten zoals osteogenesis imperfecta of artrose23,24,25,26,27, en zowel de larven als de schalen worden gebruikt om bot anabole stoffen in kleine molecuul schermen7,28,29te identificeren. Behandelingen van zebravis met geneesmiddelen die worden toegepast in de klinische praktijk zijn bovendien bij uitstek geschikt om te bestuderen van de vermeende schadelijke effecten, bijvoorbeeld in het botweefsel. In dit verband is de aanwezigheid van een snel herstel van bot voordelig voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen van medicatie-geïnduceerde bot tekortkomingen. Hier presenteren we een protocol waarin medicamenteuze behandeling met de glucocorticoide prednisolon, een gebruikte anti-inflammatoire drug met bijwerkingen in botweefsel, wordt gecombineerd met volwassen bot regeneratie regimes. Dit protocol heeft met succes gebruikt om induceren immunosuppressieve en bot remmende effecten in regeneratieve weefsels van zebravis, en kan ook worden aangepast voor studies over de invloed van Prednisolon en andere drugs in volwassen weefsel zoals de wervelkolom. De volgende gegevens moeten rekening worden gehouden wanneer immunosuppressieve drug behandelingen worden uitgevoerd in zebrafish ondergaan fin of schedel regeneratie.
Reproduceerbaarheid van letsel tests
Tijdens de fin regeneratie, regeneratie snelheid (dat wil zeggen, de hergroei van fin weefsel, met inbegrip van bot, per tijdseenheid) hangt sterk af van het bedrag van de fin weefsel dat gereseceerd13 wordt. Om te voorkomen dat ongewenste variabiliteit van fin regeneratie, zorg ervoor dat altijd resect gelijkwaardige hoeveelheden fin weefsel in alle exemplaren.
Uitvoering van bony fin ray fracturen is uitgevoerd door het lichtjes duwen een injectie naald in het midden van een gekozen bony fin ray segment. Zoals bony fin rays bestaan uit 2 tegen hemirays, bepaalt de hoeveelheid druk gebruikt of slechts één of beide hemirays zijn gebroken. Wij verkiezen te passen lagedruk breuk slechts één hemiray, omdat fractuur van de beide hemirays de neiging te destabiliseren de fin ray, die als gevolg daarvan tijdens de volgende dag(en) loskoppelen kan.
Calvarial verwondingen van de schedel door microdrilling moeten voorzichtig worden uitgevoerd. Als schade wordt toegebracht aan de hersenen (dat wil zeggen, het cerebellum) posturale en motorische zal tekorten blijken door grillige zwemmen van het specimen15. Zebravis met cerebellaire blessure bijwerkingen van medicamenteuze behandeling kan tonen en niet moet worden gebruikt voor het bestuderen van bot regeneratie.
Overwegingen met betrekking tot drugs behandelingen
Zodat een consistente immunosuppressieve en anti-regeneratieve effect in volwassen zebrafish hanteren wij een dosis van 50 µM prednisolon in vis water. We vastgesteld deze dosis tijdens de initiële dosis / respons-experimenten in de larven en de volwassen zebrafish. Dus moeten dosis / respons-proeven worden verricht om te bepalen van de vereiste dosis van andere immunosuppressieve middelen die kunnen worden toegepast. Voor volwassenen raden wij het combineren van deze eerste experimenten met de fin regeneratie regime, zoals fin toevoegen lengte een zeer gevoelig en gemakkelijk-aan-detect uitlezing voor weefsel wijzigingen is.
Immunosuppressieve behandeling predisposes behandelde exemplaren voor microbiële infecties. Enkele woningen in gesteriliseerde met autoclaaf Bekerglazen met gesteriliseerde met autoclaaf vis water is daarom belangrijk. Hoewel deze voorwaarden zijn meer omslachtig om uit te voeren en niet steriel, bijdragen ze tot het minimaliseren van de infectie in behandelde zebrafish. We hebben geen voorbehandeling ('steriliseren') Artemia eieren. Nochtans, zou dit een extra maatregel om te voorkomen dat infectie in zebrafish, indien nodig. Bovendien kunnen de antiseptische stoffen zoals methyleenblauw (1%) vissen water vóór gebruik worden toegevoegd.
Experimenten met prednisolon, zowel korte- als lange, vereist dagelijkse wijzigingen van vis water. We hebben volwassen zebrafish behandeld voor maximaal 8 weken. Behandeling van een groot aantal personen voor zo'n lange tijd kan leiden tot een bepaalde experimentele 'last', en moet zorgvuldig worden gepland. Het is cruciaal om altijd de vereiste hoeveelheid vis gesteriliseerde met autoclaaf water en glazen aardewerk klaar. Hoewel dit niet is getest in zebrafish (aan onze kennis), kan implantatie langzaamwerkend pellets voor drugs van belang vormen een waardevol alternatief voor langdurige blootstelling van de drug in zebrafish.
Analyses in transgene zebravis
Hier presenteren we 2 methoden om vlek voor mineralisatie/verkalking van bot weefsels door Alizarine rode en calceïne kleuring. Bovendien laten we zien hoe beeld regeneratie fin en schedel weefsel in vivo met behulp van een stereomicroscoop. De laatste techniek is zeer nuttig, als transgene zebrafish rapportage van het aantal of de activiteit van de geselecteerde cellen, zoals botcellen of immune cellen, zijn image wordt gemaakt. Bijvoorbeeld voor opofferen gewond en prednisolon behandeld zebrafish uitvoeren Alizarine rode kleuring, fin regenereert of trepanated schedels ondergaan reparatie kunnen gefotografeerd worden om te zoeken naar de aanwezigheid, het nummer en de activiteit van bone vormen botcellen in de transgene verslaggever lijn GS (osterix: nGFP)22. Epidermale wond sluiting, die binnen een dag optreedt, kan ook worden gevisualiseerd in transgene vis, die een fluorophore in de epidermale weefsel uitdrukken. Accumulatie van immune cellen op de site van letsel (of hun afwezigheid in prednisolon behandeld personen) kan ook gemakkelijk worden bewaakt met een stereomicroscoop uitgerust met de vereiste lichtbron en filters.
Kortom, kan het protocol hier gepresenteerde effecten te bestuderen van immunosuppressieve agenten en andere drugs na systemische toediening in zebrafish die doormaken bot regeneratie in de fin of schedel worden gebruikt. Zulks zal zitten nuttig om af te bakenen de pathogenese van GIO en te onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan succesvolle bot regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een subsidie van het centrum van regeneratieve therapieën Dresden ("zebravis als model te ontrafelen van de mechanismen van glucocorticoide-geïnduceerde botverlies"), en daarnaast door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, project 387653785) naar de FK. We zijn zeer dankbaar aan Jan Kaslin en Avinash Chekuru voor hun advies en assistentie bij het uitvoeren van Schedeltrepanatie van de calvariae en fracturen in benige fin rays. Experimenten werden ontworpen, uitgevoerd en geanalyseerd door KG en FK. FK schreef het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Katrin Lambert, Nicole Cudak, en andere leden van de Knopf en merk labs voor technische bijstand en discussie. Onze dank gaat ook uit aan Marika Fischer en Jitka Michling voor uitstekende vis zorg en Henriette Knopf en Josh Currie voor proeflezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
