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Developmental Biology

वयस्क Zebrafish चोट मॉडल Prednisolone के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अस्थि ऊतक पुनः उत्पन्न करने में

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

यहां, हम 3 वयस्क zebrafish चोट मॉडल और immunosuppressive दवा उपचार के साथ उनके संयुक्त उपयोग का वर्णन । हम पुनः उत्पन्न होने वाले ऊतकों के इमेजिंग पर और अस्थि mineralization का पता लगाने पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं ।

Abstract

Zebrafish विच्छेदन के बाद उपांग (पंख) सहित विभिन्न अंगों, पुनर्जीवित करने में सक्षम हैं । यह हड्डी है, जो चोट के बाद लगभग दो सप्ताह के भीतर regenerations के उत्थान शामिल है । इसके अलावा, zebrafish खोपड़ी के trepanation के बाद तेजी से हड्डी को चंगा करने में सक्षम हैं, और मरंमत भंग कि आसानी से zebrafish बोनी फिन किरणों में पेश किया जा सकता है । इन चोट परख व्यावहारिक प्रयोगात्मक मानदंड का प्रतिनिधित्व करने के लिए तेजी से हड्डी बनाने पर प्रशासित दवाओं के प्रभाव का परीक्षण । यहां, हम इन 3 चोट मॉडल और प्रणालीगत glucocorticoid उपचार है, जो हड्डी निरोधात्मक और immunosuppressive प्रभाव डालती के साथ उनके संयुक्त उपयोग के उपयोग का वर्णन । हम कैसे वयस्क zebrafish में immunosuppressive उपचार के लिए तैयार करने के लिए पर एक कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं, समझाने कैसे फिन विच्छेदन, calvarial हड्डियों के trepanation, और पंख भंग करने के लिए, और वर्णन कैसे ग्लुकोकोर्तिकोइद के उपयोग दोनों हड्डी बनाने को प्रभावित करता है osteoblasts और monocyte/मैक्रोफेज वंश की कोशिकाओं अस्थि ऊतक में जन्मजात उन्मुक्ति के भाग के रूप में ।

Introduction

Zebrafish हड्डीवाला विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह तथ्य यह है कि वे छोटे जानवर है कि बहुत अच्छी तरह से नस्ल और है कि उनके जीनोम पूरी तरह से अनुक्रम है और1हेरफेर के लिए उत्तरदाई है की वजह से है । अन्य लाभों में विभिन्न चरणों में जारी लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए विकल्प शामिल हैं, जिसमें vivo इमेजिंग में वयस्क zebrafish2, और zebrafish लार्वा3में उच्च प्रवाह दवा स्क्रीन करने की क्षमता । इसके अतिरिक्त, zebrafish हड्डी सहित अंगों और ऊतकों की एक किस्म में एक उच्च अपक्षयी क्षमता के अधिकारी, और इस तरह एक उपयोगी प्रणाली कंकाल रोग और मरंमत के अध्ययन के रूप में सेवा4,5।

Glucocorticoid-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस (गियो) एक रोग है कि ग्लुकोकोर्तिकोइद के साथ दीर्घकालिक उपचार से परिणाम, इस तरह के अस्थमा या रुमेटी गठिया के रूप में स्व-प्रतिरक्षित रोग उपचार के दौरान उदाहरण के लिए । गियो glucocorticoid-इलाज रोगियों के बारे में 30% में विकसित और एक प्रमुख स्वास्थ्य6अंक का प्रतिनिधित्व करता है; इसलिए, यह महान विस्तार में अस्थि ऊतक पर प्रतिरक्षादमन के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में गियो के रोगजनन से निपटने zebrafish मॉडल की एक किस्म विकसित किया गया है । Glucocorticoid-मध्यस्थता हड्डी हानि zebrafish लार्वा में प्रेरित किया गया है, उदाहरण के लिए, जो एक दवा स्क्रीन7में बढ़ती हड्डी द्रव्यमान की पहचान के लिए प्रतिक्रियात्मक यौगिकों के नेतृत्व में. इसके अलावा, glucocorticoid-प्रेरित अस्थि निरोधात्मक प्रभाव zebrafish तराजू में दोनों विट्रो में और vivo8,9में नकल उतारा गया है । इन परख दृष्टिकोण बहुत कायल हैं, खासकर जब यह उपंयास immunosuppressive और हड्डी anabolic दवाओं की पहचान की बात आती है । हालांकि, वे केवल आंशिक रूप से खाते में ले endoskeleton और एक अपक्षयी संदर्भ में नहीं किया गया है । इस प्रकार, वे वयस्क, अपक्षयी अस्थि गठन के तेजी से मोड के दौरान glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव की जांच की अनुमति नहीं है ।

यहां, हम एक शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए अध्ययन करने के लिए glucocorticoid-मध्यस्थ प्रभाव वयस्क zebrafish उत्थान के दौर से गुजर हड्डियों पर । चोट मॉडल zebrafish caudal फिन के आंशिक विच्छेदन, खोपड़ी के trepanation, साथ ही फिन रे भंग (आंकड़ा 1a-1C) के निर्माण में शामिल हैं, और गर्मी के माध्यम से glucocorticoid जोखिम के साथ संयुक्त कर रहे हैं (चित्रा 1E ). हम हाल ही में इस प्रोटोकॉल के एक हिस्से का इस्तेमाल किया है prednisolone, आमतौर पर निर्धारित corticosteroid दवाओं में से एक के लिए जोखिम के परिणामों का वर्णन, वयस्क zebrafish पर फिन और खोपड़ी10अस्थि चूकने । zebrafish में, prednisolone प्रशासन में कमी osteoblast प्रसार, अपूर्ण osteoblast भेदभाव और apoptosis के monocyte/मैक्रोफेज वंश10में तेजी से प्रेरण की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम भी कैसे भंग एकल बोनी फिन रे खंडों11में पेश किया जा सकता का वर्णन है, के रूप में इस दृष्टिकोण फ्रैक्चर की मरंमत के दौरान होने वाली हड्डी पर glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव का अध्ययन करते समय उपयोगी हो सकता है । यहां प्रस्तुत तरीकों को आगे तेजी से पुनः उत्पन्न हड्डी में glucocorticoid कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र को संबोधित करने में मदद मिलेगी और भी zebrafish ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में प्रणालीगत दवा प्रशासन के अन्य सेटिंग्स में नियोजित किया जा सकता है.

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Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित Landesdirektion ड्रेसडेन द्वारा अनुमोदित किए गए थे (संख्या की अनुमति: az 24D-9168.11-1/2008-1, az 24-9168.11-1/2011-52, az 24-9168.11-1/2013-5, az 24-9168.11-1/2013-14, az डीडी 24.1-5131/354/87) ।

1. सामग्री और समाधान की तैयारी

नोट: Prednisolone, अंय ग्लुकोकोर्तिकोइद की तरह, प्रतिरक्षादमन की ओर जाता है । इस प्रकार, सावधानी प्रयोग के दौरान इलाज पशुओं में संक्रमण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए । इस अंत करने के लिए, आटोक्लेव ग्लास वेयर और ' मछली पानी ' (यानी, पानी कि रियर वयस्क zebrafish प्रयोग किया जाता है) प्रयोग शुरू करने से पहले ।

  1. प्रयोग में उपयोग की जाने zebrafish की संख्या की गणना करें । नियंत्रण के रूप में सेवा करने वाले व्यक्तियों को शामिल करना सुनिश्चित करें ।
  2. आटोक्लेव ६०० मिलीलीटर ग्लास यूरिन कि एल्यूमीनियम पंनी के साथ आटोक्लेव टेप के साथ कवर कर रहे हैं । Zebrafish व्यक्तिगत रूप से इलाज किया जाएगा, इस प्रकार 1 ग्लास चोंच Zebrafish प्रति आवश्यक है ।
  3. प्रयोग के लिए आवश्यक मछली पानी की मात्रा की गणना । ३०० मिलीलीटर प्रति व्यक्ति और दिन की आवश्यकता है । ध्यान में प्रयोग की लंबाई ले लो (जैसे, 1 सप्ताह/
  4. मछली के पानी के साथ कांच की बोतलें भरें, उंहें बंद करें और आटोक्लेव टेप के साथ बोतलों आटोक्लेव । आदर्श रूप में, 2 एल बोतलों का उपयोग करें, लेकिन 1 एल या 5 एल जैसे अंय बोतलों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: यदि प्रयोगों लंबे होते हैं (उदा., 4 सप्ताह/28 दिन) और कांच की बोतलों की मात्रा सीमित है, एक समय में कई दिनों की एक ंयूनतम के लिए बोतलें तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें और इस प्रक्रिया को दोहराने (१.३ से १.४) प्रयोग के दौरान ।
  5. dimethylsulfoxide (DMSO) में बाँझ-फ़िल्टर १०० mM prednisolone का एक prednisolone स्टॉक समाधान तैयार करें । 1 मिलीलीटर या 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब aliquots में शेयर फ्रीज ।
    चेतावनी: हमेशा सुरक्षात्मक कपड़े पहनते है जब prednisolone (सुरक्षात्मक दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, लैब कोट) के साथ काम कर रहे ।
  6. प्रयोग के पहले दिन, prednisolone और DMSO, क्रमशः के साथ गर्मी समाधान तैयार करते हैं । यह अंत करने के लिए, १०० mM prednisolone स्टॉक समाधान की आवश्यक राशि गल और ५० µ मीटर की अंतिम एकाग्रता में autoclaved मछली के पानी के लिए prednisolone जोड़ें ।
    1. नियंत्रण उपचार के लिए, autoclaved मछली के पानी के लिए DMSO की इसी मात्रा जोड़ें । एक उदाहरण के रूप में, 2 एल मछली पानी युक्त prednisolone का उत्पादन करने के लिए, 2 एल मछली पानी के लिए १०० mM prednisolone शेयर की 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक और 2 एल मछली पानी की बोतल में, 1 मिलीलीटर DMSO, तदनुसार जोड़ें ।
    2. एक उपयुक्त जगह है कि दवा उपचार करने के लिए नामित है में काम करते हैं, आदर्श रूप में 27 डिग्री सेल्सियस पर एक कमरे में ।

2. Zebrafish पंख में चोटों के उत्पादन

नोट: zebrafish पंख में हड्डी घायल करने के लिए, पंख (विच्छेदन, आमतौर पर caudal फिन में) या फ्रैक्चर व्यक्तिगत बोनी फिन किरणों (फ्रैक्चर मॉडल) के लकीर प्रदर्शन करते हैं । ते कधी अंत anaesthetize प्रौढ zebrafish प्रथम होते.

  1. विच्छेदन
    1. वयस्क zebrafish को anaesthetize करने के लिए, मछली के पानी में ०.०२% MS-२२२ (एथिल-3-aminobenzoate methanesulfonate) वाले १०० mm व्यास पेट्री डिश तैयार करें (इस पानी को autoclaved होने की जरूरत नहीं है) ।
      1. एक समय में एक zebrafish स्थानांतरण MS-२२२ एक मछली नेट का उपयोग करके पेट्री डिश युक्त और यह जब तक यह आंदोलन के बिना अपने पक्ष में है और जवाब नहीं छूने के लिए । कुंद संदंश के साथ गुदा पंख छू द्वारा बाद का परीक्षण ।
      2. संज्ञाहरण के स्तर 4 तक प्रतीक्षा करें जो फिन12लकीर के लिए उचित स्तर पर पहुंच गया है । इस स्तर पर, opercular आंदोलन की दर में कमी आई है, मांसपेशी टोन खो दिया है और मछली12स्पर्श पर कदम नहीं है ।
    2. कुंद संदंश ले लो और १०० mm पेट्री डिश के व्युत्क्रम ढक्कन को ध्यान से anaesthetized zebrafish हस्तांतरण । zebrafish को उसके पार्श्व की ओर रखें । सुनिश्चित करें कि zebrafish हमेशा एक ही अभिविंयास में झूठ, उदाहरण के लिए उनके सही शरीर की ओर । एक स्केलपेल या एक उस्तरा ब्लेड के साथ, पंख (आंकड़ा 1a, 2a) के ५०% कीट ।
      नोट: zebrafish फिन पुनर्जनन की गति प्रतिच्छेदित पंख ऊतक, यानी, अधिक पंख ऊतक की राशि पर निर्भर करता है, तेजी से फिन13पुनर्जीवित करती है । इस प्रकार, पंख पुनर्जनन में बदलाव को कम करने के लिए हमेशा सभी zebrafish में एक ही स्तर पर फिन संप्रदाय सुनिश्चित करें ।
    3. घायल zebrafish को एक autoclaved ग्लास यूरिन से prednisolone या DMSO युक्त autoclaved मछली के पानी की ३०० मिलीलीटर में ट्रांसफर करें । zebrafish के भागने से बचने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कांच चोंच कवर ।
    4. प्रयोग के लिए zebrafish की आवश्यक संख्या तक पहुँच गया है जब तक 2.1.3 करने के लिए 2.1.2 चरणों को दोहराएँ.
  2. पंख फ्रैक्चर
    1. मछली के पानी या E3 (भ्रूण मीडिया 3, ५० mm सोडियम क्लोराइड, ०.१७ mm पोटेशियम क्लोराइड, ०.३३ mm कैल्शियम क्लोराइड, ०.३३ mm मैग्नीशियम सल्फेट) में एक 2% agarose समाधान हीटिंग द्वारा एक agarose-लेपित १०० mm पेट्री डिश तैयार करें । ध्यान से लगभग 10-पेट्री डिश में समाधान के 15 मिलीलीटर डालना । पकवान के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए । चलो agarose जमना ।
    2. धारा २.१ में बताए अनुसार Anaesthetize zebrafish ।
    3. कुंद संदंश ले लो और agarose-लेपित १०० mm पेट्री डिश को ध्यान से anaesthetized zebrafish हस्तांतरण । zebrafish को उसके पार्श्व की ओर रखें । विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, caudal फिन फैल पूरी तरह से अलग बोनी फिन किरणों और फिन रे क्षेत्रों की पहचान करने में सक्षम हो । सुनिश्चित करें कि zebrafish हमेशा एक ही अभिविंयास में झूठ, उदाहरण के लिए उनके सही शरीर की ओर ।
    4. एक इंजेक्शन सुई (०.३ मिमी x 13 मिमी) के साथ एक बोनी फिन रे खंड (आंकड़ा 1b) के केंद्र में एक फ्रैक्चर परिचय । ऐसा करने के लिए, सुई थोड़ा खंड पर धकेल दिया है जब तक एक दरार दिखाई देता है ( चित्रा बीमें तीर). जबकि कोमल दबाव दो का विरोध hemirays मजबूत दबाव दोनों hemiray क्षेत्रों के फ्रैक्चर का नेतृत्व करेंगे में से केवल एक के फ्रैक्चर की ओर जाता है ।
      1. पंख में भी कई भंग परिचय नहीं है, क्योंकि यह बहुत फिन की स्थिरता ख़राब होगा । एक सुझाव के रूप में, केवल 3 से 5 फिन किरणों में फ्रैक्चर लागू होते हैं ।
      2. हमेशा अलग पंख किरणों और zebrafish भर में इसी सेगमेंट में फ्रैक्चर का उत्पादन, पृष्ठीय फिन किरणों में उदाहरण के लिए 3, 7 (या 8) और ventral फिन रे 3. फ्रैक्चर के समीपस्थ-बाहर स्तर फिन किरणों ' विभाजन बिंदु 11के लिए समीपस्थ 3 खंडों में आदर्श है ।
    5. घायल zebrafish को एक autoclaved ग्लास यूरिन से prednisolone या DMSO युक्त autoclaved मछली के पानी की ३०० मिलीलीटर में ट्रांसफर करें । zebrafish के भागने से बचने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कांच चोंच कवर ।
    6. प्रयोग के लिए zebrafish की आवश्यक संख्या तक पहुंच गया है जब तक 2.2.5 के लिए -8 चरणों को दोहराएँ ।

3. Calvarial खोपड़ी चोटों के उत्पादन (Trepanation)

नोट: zebrafish में calvariae स्तनधारियों में calvarial हड्डियों को मुताबिक़ हैं. इस प्रकार, इन exoskeletal हड्डियों14 गियो के रोगजनन का अध्ययन करते समय विशेष रुचि के एक ऊतक का प्रतिनिधित्व करते हैं । खोपड़ी घायल करने के लिए, trepanation एक microdrill11की मदद से ओएस frontale और/या ओएस parietale (चित्रा 1C, 2c) में एक छेद ड्रिलिंग द्वारा किया जाता है ।

  1. Anaesthetize को धारा २.१ के अनुसार zebrafish ।
  2. संदंश के साथ anesthetized zebrafish ईमानदार पकड़ो, ताकि calvarial हड्डियों के ऊपर से एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे अच्छी तरह से दिखाई दे रहे है (चित्रा 1C) ।
  3. ललाट हड्डी (Os frontale) के केंद्र पर घूर्णन microdrill की स्थिति जानें और हड्डी को छूने । उत्पादित छेद microdrill गड़गड़ाहट के आकार का है (५०० µm, चित्रा 2c, चित्र बी2).
    नोट: चोट का उत्पादन करते समय microdrill बाद में कदम नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें । हड्डी का प्रतिरोध अचानक गिरता है जब भी तुरंत बंद करो । आगे कोई ड्रिल न करें, अन्यथा मस्तिष्क 15क्षतिग्रस्त हो जाएगा ।
  4. एक मछली के पानी से भरा पिंजरे में घायल zebrafish स्थानांतरण जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने । इसे ध्यान से देखो ।
  5. घायल zebrafish को एक फिश वॉटर प्लस prednisolone या DMSO युक्त ग् यूरिन ट्रांसफर करें ।

4. Zebrafish की मशीन के दौरान उपचार

नोट: prednisolone/DMSO के आवेदन के दौरान, मछली पानी युक्त दवा दैनिक बदलने की जरूरत है, और zebrafish नियमित रूप से खिलाया जाना चाहिए ।

  1. जल परिवर्तन
    1. मछली के पानी का आदान-प्रदान करने के लिए, गल १०० mM prednisolone शेयर और autoclaved मछली के पानी में ५० µ मीटर prednisolone की आवश्यक मात्रा तैयार कर उपचार की अवधि के हर दिन ताजा । तदनुसार नियंत्रण zebrafish के लिए मछली पानी युक्त DMSO तैयार करें ।
    2. एक गिलास अपनी मशीन समाधान में एक ही ईमारत zebrafish युक्त चोंच ले लो और एक उपयुक्त कंटेनर में zebrafish सहित समाधान हस्तांतरण, उदाहरण के लिए एक लौकिक आवास पिंजरे ।
      नोट: हमेशा prednisolone और DMSO इलाज zebrafish के लिए अलग अंतरिम कंटेनरों का उपयोग करें, क्रमशः, सुनिश्चित करने के लिए DMSO नियंत्रण zebrafish prednisolone और इसके विपरीत करने के लिए उजागर नहीं मिलता है ।
    3. मछली के पानी युक्त ताजा दवा (३०० मिलीलीटर) के साथ कांच चोंच फिर से भरना ।
    4. zebrafish अंतरिम कंटेनर से कांच चोंच ताजा गर्मी एक मछली नेट का उपयोग कर समाधान युक्त करने के लिए स्थानांतरण । zebrafish के भागने से बचने के लिए पन्ना वापस रखो ।
    5. यदि प्रयोग का समय 2 सप्ताह से अधिक हो, तो ग् यूरिन का आदान-प्रदान करें ।
  2. खिला
    1. कम उपचार के दौरान (2 दिनों तक) zebrafish फ़ीड नहीं है । अब प्रयोगों के दौरान, zebrafish फ़ीड । गर्मी के समाधान के प्रदूषण से बचने के लिए विशेष ध्यान रखें । इस प्रकार, Artemia एसएसपी के साथ फ़ीड । बल्कि गुच्छा भोजन के साथ, और हर दूसरे दिन पर ही ।
      नोट: Artemia नियमित रूप से युवा zebrafish फ़ीड करने के लिए उपयोग किया जाता है, और zebrafish haltering इकाई में उपलब्ध होना चाहिए ।
      1. मोटे तौर पर 2 ज से पहले मछली पानी का आदान-प्रदान होता है, Artemia ssp के साथ उनके ग् यूरिन में zebrafish खिलाओ । ऐसा करने के लिए, एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें और प्रति गिलास चोंच Artemia हल की 1 मिलीलीटर ०.५ फ़ीड ।
      2. 2 एच के लिए रुको और ताजा मछली पानी युक्त दवा के साथ मशीन समाधान विनिमय धारा ४.१ के अनुसार ।

5. नमूनों का विश्लेषण

नोट: prednisolone और मछली पानी युक्त DMSO में घायल zebrafish की मशीन के बाद, क्रमशः, या तो हड्डी mineralization प्रदर्शन/पत्थराना विश्लेषण (५.१ से ५.३) या विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत zebrafish के लाइव इमेजिंग बाहर ले (५.४) 10,11,16. का प्रयोग करें लाइव इमेजिंग फिन लंबाई पुनर्जंम निर्धारित करने के लिए और रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति में मतभेद ट्रांसजेनिक zebrafish में पता लगाने के लिए ।

  1. ब्याज के ऊतकों का निर्धारण
    1. पंख और/या खोपड़ी के निर्धारण के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करने और भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज । पंजाब में नए सिरे से तैयार 4% पीएफए का उपयोग करें या प्रयोग से पहले आवश्यक राशि गल जाए । वैकल्पिक रूप से, पंजाब में 2% पीएफए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और एक धुएं हुड के तहत ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए । सुरक्षात्मक वस्त्र पहनें ।
    2. पंख के निर्धारण के लिए पंजाब में ठंड 4% पीएफए के साथ एक छोटे से पेट्री डिश (जैसे, 30 मिमी) तैयार है और सुनिश्चित करें कि पकवान के नीचे पूरी तरह से कवर किया जाता है । खोपड़ी के निर्धारण के लिए, पंजाब में ठंड 4% पीएफए के साथ ढक्कन या एक ट्यूब के साथ एक छोटे से ग्लास जार तैयार करते हैं ।
      चेतावनी: केवल धुएं हुड के तहत समाधान युक्त पीएफए संभाल के रूप में यह विषाक्त है । सुरक्षात्मक वस्त्र पहनें ।
    3. ब्याज के ऊतक फसल ।
      1. धारा २.१ या euthanize धारा 5.1.5 के अनुसार zebrafish के अनुसार zebrafish anaesthetize भंग के साथ पंख ऊतक या पंख चूकने फसल के लिए ।
      2. anaesthetized zebrafish को एक पेट्री डिश के ढक्कन पर ट्रांसफर करें । एक स्केलपेल या उस्तरा ब्लेड का उपयोग करके, फसल फिन पुनर्जंम । कटाई ऊतक की हैंडलिंग की सुविधा के लिए पंख पुनः उत्पन्न करने में स्टंप ऊतक शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. ठीक 4 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश युक्त पीएफए में फ्लैट पंख रातोंरात । फ्लैट निर्धारण को निर्धारण के दौरान फिन ऊतक के कर्लिंग से बचा जाता है ।
      1. फ्लैट को ठीक करने के लिए, पंख के ऊतकों को संदंश के पृष्ठीय या ventral किनारे पर एक महीन के साथ पकड़ो और इसे निर्धारण समाधान में विसर्जित करें । एक दूसरे ठीक संदंश के साथ स्टंप के विपरीत किनारे ले लो और थोड़ा पकवान के तल पर ऊतक दबाना ।
      2. जारी करने से पहले 10 से 20 एस के लिए पकड़ो । पंख ऊतक अब और कर्ल नहीं करना चाहिए । यदि यह करता है, दोहराएं ।
    5. Euthanize zebrafish के क्रम में घायल खोपड़ी ऊतक फसल के लिए । एक १०० मिमी व्यास पेट्री डिश ०.१% MS-२२२ मछली के पानी में युक्त तैयार करें । एक समय में एक zebrafish स्थानांतरण एमएस-२२२ युक्त पेट्री डिश के लिए एक मछली पकड़ने के जाल का उपयोग करके । जब संज्ञाहरण के स्तर 6 (दिमाग़ी पतन) तक पहुंच गया है कम से 10 नमूना12की मौत का आश्वासन देने के लिए मिनट रुको ।
    6. एक स्केलपेल का उपयोग कर सिर से अधिक शरीर के बाकी हिस्सों से थोड़ा ट्रंक ऊतक काट । गिलास जार या प्लास्टिक ट्यूब में तैयार 4% पीएफए समाधान में काटा ऊतक विसर्जित कर दिया । कोमल कमाल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए फिक्स ।
    7. नमूनों की दुकान लंबी अवधि के निर्धारण के बाद, उंहें पंजाबियों के साथ धोने (आरटी में 3 x 20 मिनट) और मेथनॉल-एक बढ़ती मेथनॉल श्रृंखला में इलाज (1x 30%, 1x ५०%, 1x ७०%, 2x १००% मेथनॉल पंजाब में 20 मिनट के लिए एक) ।
      1. उंहें १००% मेथनॉल में-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । अंयथा, सीधे पंजाबियों के साथ धोने के बाद हड्डी धुंधला या अंय विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना ।
  2. हड्डी धुंधला तकनीक मैं (alizarin लाल दाग)
    नोट: इस दाग वान Eeden एट अल के अनुसार किया जाता है. १९९६17 और वाकर & Kimmel २००७18 संशोधनों के साथ ।
    1. ५.१ वर्गों में वर्णित के रूप में वयस्क पंख या खोपड़ी, फसल और ठीक ऊतक पर alizarin लाल दाग प्रदर्शन करने के लिए ।
    2. यदि नमूने मेथनॉल में 20 डिग्री सेल्सियस, एक व्युत्क्रम मेथनॉल श्रृंखला (७०%, ५०% और पंजाब में 30%, प्रत्येक 1x20 मिनट) और पंजाबियों के साथ दो बार 20 मिनट धोने के द्वारा rehydrat नमूनों में संग्रहीत किया गया । पानी के साथ 5 ंयूनतम न्यूनतम के लिए नमूनों को धो लें ।
    3. खोपड़ी में alizarin लाल दाग करने के लिए, ५० मिलीग्राम/एमएल trypsin के साथ नमूनों का इलाज 30% संतृप्त ना2B4O7 में कमरे के तापमान पर रात भर । इस समय के दौरान रॉक नमूने । कुल्ला नमूनों में 30% संतृप्त ना2B4हे7 समाधान. 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार पानी के साथ नमूने धो लो । यह चरण फिन ऊतक के लिए नहीं किया जाता है ।
    4. alizarin लाल समाधान जोड़ें (भाग बी: ०.५% alizarin लाल एस पाउडर, 10% ग्लिसरॉल पानी में) और आरटी में मशीन के दौरान नमूने रॉक 1, 2, 4 ज या रात के बाद धुंधला के लिए जांच करें ।
    5. स्पष्ट नमूनों उंहें एक कम 1% पोटेशियम हीड्राकसीड के साथ इलाज: ग्लिसरॉल श्रृंखला (3:1 रातोंरात, 1:1 रात, 1:3 रातोंरात) ।
    6. नमूनों की एक 1:1 समाधान में स्टोर ०.१% पोटेशियम हीड्राकसीड: ८०% ग्लिसरॉल और उन्हें इमेजिंग के लिए ८०% ग्लिसरॉल के साथ माउंट.
      नोट: के लिए संयुक्त Alcian नीले/alizarin लाल दाग Alcian नीले धुंधला समाधान (भाग एक: अंतिम ०.०२% Alcian नीला, ५० mM MgCl2, ७०% इथेनॉल) निर्जलीकरण के बाद (धारा 5.2.2) के लिए 2 ज के साथ इलाज के नमूने के लिए RT. एक कम इथेनॉल श्रृंखला के साथ पंख समझो में ५० mM MgCl2 (७०%, ५०%, 30%, प्रत्येक 1x 15 मिनट) और उंहें 1 की एक ंयूनतम के लिए धो (3x 20 मिनट) में जल । alizarin लाल दाग (धारा ५.२) के साथ आगे बढ़ें ।
  3. हड्डी धुंधला तकनीक द्वितीय (calcein धुंधला)
    नोट: फिन भंग और खोपड़ी चोटों में कैल्शियम जमाव का पता लगाने के लिए, लाइव मछली समाधान युक्त calcein में मशीन हैं ।
    1. calcein जल (pH ७.५) में ०.२% की अपेक्षित मात्रा तैयार करें । सुनिश्चित करें कि पीएच तटस्थ है । पीएच को एडजस्ट करने के लिए 1 मीटर NaOH का प्रयोग करें ।
    2. एक ग्लास चोंच एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर में 20 मिनट के लिए calcein समाधान के १०० मिलीलीटर में एक साथ 3 zebrafish करने के लिए मशीन ।
    3. मछली के पानी से zebrafish को चोंच में ट्रांसफर करें । उंहें मछली के पानी के साथ एक नया चोंच को स्थानांतरित करने से पहले उंहें संक्षेप में तैरना । उन्हें धोने के लिए 20 मिनट के लिए इस नए चोंच में तैरने दें । चित्र लें (५.४ अनुभाग देखें) ।
  4. zebrafish की लाइव इमेजिंग
    1. इस दृष्टिकोण का प्रयोग करें zebrafish त्याग के बिना प्रयोग भर में फिन या खोपड़ी में जैसे अस्थि ऊतक पुनः उत्पन्न करने की छवियों को प्राप्त करने के लिए । Anaesthetize को धारा २.१ के अनुसार zebrafish ।
    2. पंख पुनर्जीवित की छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक agarose लेपित पेट्री डिश पर anaesthetized zebrafish हस्तांतरण (खंड 2.2.1 और आंकड़ा 1bदेखें) ।
    3. खोपड़ी हड्डियों को पुनः प्राप्त करने की छवियों के अधिग्रहण के लिए, एक स्पंज (चित्रा 1 डी) में zebrafish ईमानदार जगह या यह एक agarose-लेपित पकवान है कि zebrafish के ट्रंक पकड़ तैयार किया गया है में जगह है ।
    4. एक stereomicroscopic सेटअप का उपयोग कर वांछित इज़ाफ़ा और संकल्प पर छवियों का अधिग्रहण ।
    5. ताजा या मछली पानी युक्त दवा के साथ एक कंटेनर के लिए zebrafish लौटें ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बार प्रयोग किया गया है zebrafish फिन और खोपड़ी10,11,16के उत्थान के पाठ्यक्रम में तेजी से हड्डी गठन प्रेरित करने के लिए । prednisolone प्रशासन की प्रस्तुत विधि के साथ संयोजन में, अस्थि पुनर्जनन के दौरान prednisolone के प्रभाव पर अध्ययन आगे बढ़ाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, अस्थि गठन और पुनर्जंम में mineralization पर अध्ययन किया जा सकता है । Prednisolone, अंय ग्लुकोकोर्तिकोइद19,20के रूप में, पंख पुनर्जनन के समग्र निषेध की ओर जाता है, अस्थि गठन सहित, के रूप में alizarin लाल फिक्स्ड caudal फिन ऊतक (3 ए आंकड़ा) पर दाग से पता चला । इसी तरह, prednisolone (calvarial) खोपड़ी चोट बंद करने पर एक देरी प्रभाव है, जो alizarin लाल (चित्रा बी) से या vivo calcein धुंधला में सचित्र किया जा सकता है । इसके अलावा, prednisolone दोनों फिन और खोपड़ी ऊतक में एक गहरा विरोधी भड़काऊ प्रभाव डालती है, monocyte/मैक्रोफेज वंश में apoptosis ट्रिगर द्वारा । कम मैक्रोफेज संख्या जमे हुए ऊतक वर्गों पर immunohistochemistry द्वारा पता लगाया जा सकता है, जैसे, ट्रांसजेनिक mpeg1 में एक विरोधी mcherry एंटीबॉडी का उपयोग करके: mcherry zebrafish (चित्रा 3सी)10,21 . इसी प्रकार exo-और endoskeleton (उदा., कशेरुकाओं) में दोनों की संख्या, वितरण, प्रसार और apoptosis के अन्य कोशिका प्रकारों के हित का विश्लेषण immunohistochemistry की सहायता से किया जा सकता है.

Figure 1
चित्रा 1 : zebrafish में किए गए प्रक्रियाओं । (एक) anaesthetized zebrafish में caudal फिन (विच्छेदन) के एक स्केलपेल की मदद से लकीर । लाल डैश्ड रेखा विच्छेदन स्तर को इंगित करती है । (ख) anaesthetized zebrafish में पंख रे फ्रैक्चर stereomicroscope के तहत एक इंजेक्शन सुई के साथ किया जाता है । मछली प्रक्रिया के दौरान एक agarose-लेपित पेट्री डिश पर बिछाने है । Agarose-लेपित पेट्री व्यंजन भी पुनर्जनन या फ्रैक्चर मरंमत के दौरान zebrafish पंख की छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । (ग) Trepanation की calvariae (खोपड़ी की चोट) के microdrill के अंतर्गत एक stereomicroscope की सहायता से anaestetized zebrafish में प्रदर्शन किया. (घ) चोट के बाद खोपड़ी की हड्डी को पुनः उत्पन्न करने की छवि अधिग्रहण. anaesthetized zebrafish एक स्पंज में ईमानदार रखा जाता है और छवियों को एक stereomicroscope की मदद से प्राप्त कर रहे हैं । पेट्री पकवान ०.०२% MS-२२२ युक्त मछली पानी से भरा है । (ङ) prednisolone या DMSO युक्त मछली के पानी में zebrafish की मशीन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : 0 एच पोस्ट चोट hpi पर चोटों के सूक्ष्म लाइव देखें). (क) विच्छेदित caudal फिन. स्केल बार = २०० µm. (B) खंडित फिन रे. फ्रैक्चर लाल तीर से संकेत दिया है । स्केल बार = १०० µm. (C) Trepanated खोपड़ी । चोट साइट सफेद arrowhead द्वारा संकेत दिया है । स्केल बार = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : वयस्क zebrafish में prednisolone उपचार के प्रतिनिधि परिणाम । (एक) Alizarin लाल दाग फिन 14 दिनों के बाद विच्छेदन (dpa) और उपचार के दिनों (डीटी) पर पुनर्जीवित करता है । Prednisolone इलाज फिन पुनर्जीवित कम कर रहे है (नहीं दिखाया गया है), और alizarin लाल सकारात्मक हड्डी मैट्रिक्स का एक छोटा डोमेन का पता चला है । स्केल बार = ५०० µm । (ख) Alizarin लाल दाग खोपड़ी पर 7 दिन बाद चोट (डीपीआई) और डीटी । स्केल बार = १०० µm । यह आंकड़ा10अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । (ग) घायल खोपड़ी और इलाज के मस्तिष्क ऊतक (prednisolone) और अनुपचारित (DMSO) टीजी (mpeg1: mCherry) एक्स टीजी (osterix: nGFP) ट्रांसजेनिक रिपोर्टर मछली, जिसमें मैक्रोफेज (जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं) में लेबल रहे है के Cryosection दृश्य लाल 21 और अस्थि बनाने osteoblasts हरा22में लेबल कर रहे हैं । मैक्रोफेज की संख्या काफी prednisolone इलाज zebrafish में गिरता है । Immunohistochemistry Geurtzen एट अल में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया । 10. नाभिक नीले (DAPI) में लेबल कर रहे हैं । स्केल बार = 20 µm. BF: उज्ज्वल क्षेत्र, epid: एपिडर्मिस, बीएन: हड्डी । यह आंकड़ा10अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Zebrafish कई संबंध में कंकाल अनुसंधान में उपयोगी साबित कर दिया है । चयनित म्यूटेंट ऐसे आस्टियोजेनेसिस imperfecta या पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रूप में मानव रोग के पहलुओं की नकल23,24,25,26,27, और लार्वा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तराजू का इस्तेमाल किया जा रहा है छोटे अणु स्क्रीन7,28,29में हड्डी anabolic यौगिकों की पहचान करें । दवाओं है कि नैदानिक अभ्यास में लागू कर रहे हैं के साथ zebrafish के उपचार इसके अलावा आदर्श ख्यात प्रतिकूल प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं, अस्थि ऊतक में उदाहरण के लिए. इस संदर्भ में, तेजी से पुनः उत्पन्न हड्डी की उपस्थिति दवा प्रेरित अस्थि की कमी के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए लाभप्रद है । यहां, हम glucocorticoid prednisolone, अस्थि ऊतक में प्रतिकूल प्रभाव के साथ एक आम तौर पर इस्तेमाल विरोधी भड़काऊ दवा के साथ जो दवा उपचार में एक प्रोटोकॉल मौजूद, वयस्क हड्डी पुनर्जनन सरकारों के साथ संयुक्त है. इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक zebrafish के अपक्षयी ऊतकों में immunosuppressive और हड्डी निरोधात्मक प्रभाव पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह भी रीढ़ की हड्डी के रूप में वयस्क ऊतकों में prednisolone और अंय दवाओं के प्रभाव पर अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । निंनलिखित विवरण ध्यान में रखा जाना चाहिए जब immunosuppressive दवा उपचार फिन या खोपड़ी पुनर्जनन के दौर से गुजर zebrafish में प्रदर्शन कर रहे हैं ।

चोट की Reproducibility परख

फिन पुनर्जनन के दौरान, पुनर्जनन गति (यानी, पंख ऊतक की वृद्धि, अस्थि सहित, प्रति समय इकाई) फिन ऊतक है कि13के लिए किया जा रहा है की राशि पर बहुत ज्यादा निर्भर करता है । आदेश में फिन पुनर्जनन की अवांछित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, हमेशा सभी नमूनों में पंख ऊतक के बराबर मात्रा में कीट सुनिश्चित करें ।

बोनी फिन रे भंग का निष्पादन थोड़ा एक चुना बोनी फिन रे खंड के केंद्र पर एक इंजेक्शन सुई धक्का द्वारा किया जाता है । के रूप में बोनी फिन किरणों 2 का विरोध hemirays से मिलकर बनता है, इस्तेमाल किया दबाव की राशि निर्धारित करता है कि क्या केवल एक या दोनों hemirays खंडित कर रहे हैं । हम कम दबाव लागू करने के लिए केवल एक hemiray फ्रैक्चर पसंद करते हैं, क्योंकि दोनों hemirays के फ्रैक्चर पंख रे, जो एक परिणाम के रूप में अगले दिन (ओं) के दौरान अलग हो सकता है अस्थिर करने के लिए जाता है ।

microdrilling द्वारा खोपड़ी के Calvarial चोटों सावधानी से किया जाना चाहिए । यदि क्षति मस्तिष्क के लिए किया जाता है (यानी, सेरिबैलम) रुख और locomotory घाटे15नमूना के अनिश्चित तैराकी द्वारा स्पष्ट हो जाएगा । अनुमस्तिष्क चोट के साथ Zebrafish दवा उपचार के लिए प्रतिकूल प्रतिक्रिया दिखा सकते हैं और अस्थि पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।

औषध उपचार के संबंध में विचार

वयस्क zebrafish में एक सुसंगत immunosuppressive और विरोधी अपक्षयी प्रभाव का उत्पादन करने के लिए हम मछली के पानी में ५० µ m prednisolone की एक खुराक रोजगार । हम लार्वा और वयस्क zebrafish में प्रारंभिक खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों के दौरान इस खुराक की पहचान की. इस प्रकार, खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोगों को लागू किया जा सकता है कि अन्य immunosuppressive एजेंटों की आवश्यक खुराक की पहचान करने के लिए किया जाना चाहिए. वयस्कों के लिए, हम फिन पुनर्जनन शासन के साथ इन प्रारंभिक प्रयोगों के संयोजन की सिफारिश के रूप में फिन पुनर्जंम लंबाई एक अत्यधिक संवेदनशील और आसान करने के लिए पता लगाने readout ऊतक परिवर्तन के लिए है ।

Immunosuppressive उपचार माइक्रोबियल संक्रमण के लिए नमूनों का इलाज किया । इसलिए autoclaved मछली के पानी से युक्त autoclaved यूरिन में सिंगल हाउसिंग जरूरी है । हालांकि इन शर्तों और बाहर ले जाने के लिए बोझिल है और बाँझ नहीं हैं, वे इलाज zebrafish में संक्रमण को कम करने में मदद । हम (' बंध्याकरण ') Artemia अंडे का इलाज नहीं किया । हालांकि, यदि आवश्यक हो, तो यह zebrafish में संक्रमण को रोकने के लिए एक अतिरिक्त उपाय हो सकता है । इसके अलावा, methylene नीला जैसे एंटीसेप्टिक पदार्थ (1%) उपयोग करने से पहले मछली के पानी में जोड़ा जा सकता है ।

prednisolone के साथ प्रयोग, दोनों छोटी और लंबी अवधि, मछली के पानी के दैनिक परिवर्तन की आवश्यकता है । हमने एडल्ट zebrafish का इलाज 8 हफ्तों तक किया है । इस तरह के एक लंबे समय के लिए व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या का उपचार एक निश्चित प्रयोगात्मक ' बोझ ' के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और ध्यान से नियोजित किया जाना चाहिए । यह हमेशा के लिए आवश्यक मात्रा में autoclaved मछली के पानी और कांच के बर्तन तैयार है निर्णायक है । हालांकि इस zebrafish में परीक्षण नहीं किया गया है (हमारे ज्ञान के लिए), ब्याज की दवाओं के लिए धीमी गति से जारी छर्रों के आरोपण zebrafish में दीर्घकालिक दवा जोखिम के लिए एक मूल्यवान विकल्प का प्रतिनिधित्व हो सकता है ।

िरा मे ट्रांसजेनिक zebrafish

यहां, हम alizarin लाल और calcein धुंधला द्वारा हड्डी के ऊतकों के mineralization/पत्थराना के लिए दाग के लिए 2 तरीके पेश करते हैं । इसके अतिरिक्त, हम कैसे एक stereomicroscope की मदद से vivo में फिन और खोपड़ी ऊतक regenerating छवि को दिखाने के लिए । उत्तरार्द्ध तकनीक बहुत उपयोगी है, यदि ट्रांसजेनिक zebrafish संख्या या osteoblasts या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में चयनित कोशिकाओं की गतिविधि रिपोर्टिंग, imaged किया जा रहा है । उदाहरण के लिए, घायल और prednisolone-इलाज zebrafish त्यागने से पहले alizarin लाल दाग प्रदर्शन करने के लिए, फिन पुनर्जीवित या trepanated की मरंमत के दौर से गुजर खोपड़ी की उपस्थिति, संख्या और हड्डी के osteoblasts में बनाने की गतिविधि के लिए देखने के लिए फोटो खिंचवाने जा सकता है ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन टीजी (osterix: nGFP)22. इसी तरह, एपिडर्मल घाव बंद है, जो एक दिन के भीतर होता है, ट्रांसजेनिक मछली में visualized किया जा सकता है, जो एपिडर्मल ऊतक में एक fluorophore व्यक्त करते हैं । इसके अलावा, चोट के स्थल पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संचय (या prednisolone इलाज व्यक्तियों में उनकी अनुपस्थिति) एक आवश्यक प्रकाश स्रोत और फिल्टर से सुसज्जित stereomicroscope के साथ आसानी से निगरानी की जा सकती है ।

संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल zebrafish में प्रणालीगत प्रशासन के बाद immunosuppressive एजेंटों और अन्य दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि या तो फिन या खोपड़ी में हड्डी पुनर्जनन के दौर से गुजर रहे हैं । इस गियो के रोगजनन चित्रित और सफल अस्थि पुनर्जनन अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था अपक्षयी चिकित्सा ड्रेसडेन के केंद्र ("Zebrafish के रूप में एक मॉडल के तंत्र को जानने के लिए glucocorticoid-प्रेरित हड्डी हानि") और इसके अलावा ड्यूश Forschungsgemeinschaft के अनुदान से (Transregio ६७, परियोजना ३८७६५३७८५) ते FK. हम बोनी फिन किरणों में calvariae और फ्रैक्चर के trepanation प्रदर्शन पर उनके मार्गदर्शन और सहायता के लिए जन Kaslin और अविनाश Chekuru के लिए बहुत आभारी हैं । प्रयोगों डिजाइन, प्रदर्शन किया और किलो और FK द्वारा विश्लेषण किया गया । FK ने पांडुलिपि लिखी । हम भी Katrin Lambert, निकोल Cudak, और तकनीकी सहायता और चर्चा के लिए Knopf और ब्रांड लैब्स के अंय सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । हमारा धंयवाद भी उत्कृष्ट मछली की देखभाल के लिए मैरिका फिशर और जितका Michling को जाता है और पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Henriette Knopf और जोश क्यूरी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

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References

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Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

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