Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

Здесь мы описываем 3 взрослых рыбок данио травмы модели и их совместное использование с лечение иммуносупрессивным препаратом. Мы предоставляем руководство по визуализации регенерации тканей и на нем обнаружения минерализации костей.

Abstract

Данио рерио способны регенерировать различных органов, включая придатков (плавники) после ампутации. Это включает в себя регенерации кости, которая отрастает в течение примерно двух недель после травмы. Кроме того возможность исцелить костей быстро после трепанации черепа и ремонта трещин, которые могут быть легко введены в костлявые плавник лучи данио рерио данио рерио. Эти анализы травмы представляют собой возможные экспериментальные парадигмы для проверки влияния управляемых наркотиков на быстро формирования кости. Здесь мы описываем, использование этих моделей 3 травмы и их совместное использование с лечения системных глюкокортикоидов, который оказывает тормозящее и иммуносупрессивные эффекты кости. Мы предоставляем рабочего процесса о том, как подготовиться к иммуносупрессивным лечения взрослых рыбок данио, показывают, как выполнять плавник ампутации, трепанация черепа костей и переломы плавник и описывают, как применение глюкокортикоидов влияет на обе кости формирования остеобласты и клетки линии моноцитов/макрофагов частью врожденного иммунитета в костной ткани.

Introduction

Данио рерио представляют собой мощный животных модель для изучения развития позвоночных и болезни. Это связано с тем, что они являются мелких животных, которые размножаются очень хорошо и что их геном полностью виртуализированного и поддаются манипуляции1. Другие преимущества включают возможность выполнения продолжение живых изображений на разных этапах, в том числе в vivo изображений взрослых рыбок данио2, и способности выполнять высокую пропускную способность препарата экраны в zebrafish личинки3. Кроме того данио рерио обладают высокой регенеративной способностью в различных органах и тканях, включая кости и таким образом служат полезной системы для изучения костных болезней и ремонт4,5.

Глюкокортикоидный индуцированного остеопороза (ГИО) является заболевание, которое приводит к от долгосрочного обращения с глюкокортикоидов, например в ходе лечения аутоиммунных заболеваний таких как астма или ревматоидного артрита. GIO в около 30% глюкокортикоидных лечение больных развивается и представляет основных медицинских выпуск6; Таким образом важно исследовать влияние иммуносупрессии на костной ткани в деталях. В последние годы были разработаны различные модели данио рерио, занимающихся патогенеза GIO. Глюкокортикоидный опосредованной костной потери побудило в данио рерио личинки, к примеру, которые привели к выявлению противодействующего соединений увеличения костной массы в наркотиков экран7. Кроме того, тормозящее действие глюкокортикоидов индуцированной кости были передразнил в zebrafish весы как in vitro и in vivo8,9. Эти анализы очень убедительны подходы, особенно когда дело доходит до выявления роман иммуносупрессивных и кости анаболических препаратов. Однако они лишь частично учитывать эндоскелет и не были выполнены в регенеративных контексте. Таким образом они не позволяют расследования глюкокортикоидных опосредованной эффекты во время быстрого режимов формирования взрослых, регенерации костей.

Здесь мы представляем протокол позволяет исследователям изучать глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости взрослых рыбок данио, прохождения регенерации. Травмы модели включают частичная ампутация данио рерио хвостового плавника, трепанация черепа, а также создание плавник Рэй переломов (рис. 1а-1 C) и в сочетании с глюкокортикоидных воздействия через инкубации (Рисунок 1E ). Недавно мы использовали часть настоящего протокола для описания последствий воздействия преднизолона, один из обычно предписываются кортикостероидных препаратов, на взрослых рыбок данио, регенерации костей черепа и плавник10. В данио рерио преднизолон администрация приводит к снижению остеобластов распространения, неполной остеобластов дифференциация и быстрой индукции апоптоза в моноцитов/макрофагов линии10. В этом протоколе мы также описывают как переломы могут быть введены в единый костлявые плавник Рэй сегментов11, как этот подход может оказаться полезным при изучении глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости происходя во время ремонта трещин. Представленные здесь методы поможет дальнейшего решения лежащих в основе механизмов действия глюкокортикоидов в быстро регенерации костной ткани и может также использоваться в других настройках системного лекарствами в контексте данио рерио регенерации тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были утверждены Landesdirektion Дрезден (разрешить чисел: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. Подготовка материалов и решений

Примечание: Преднизолон, как другие глюкокортикоидов, приводит к иммуносупрессии. Таким образом необходимо принимать меры предосторожности для предотвращения инфекции у животных, обработанных в ходе эксперимента. Этот конец, автоклав стеклянные изделия и «рыбные воды» (т.е., вода, которая используется для заднего взрослых данио рерио) перед началом эксперимента.

  1. Рассчитайте количество данио рерио для использования в эксперименте. Убедитесь в том включать лиц, которые служат в качестве элементов управления.
  2. Автоклав 600 мл стекла мензурки, которые покрыты алюминиевой фольги с лентой автоклава. Данио рерио, будут рассматриваться в отдельности, таким образом для каждого данио рерио необходим 1 стеклянный стакан.
  3. Рассчитайте количество рыбы воды, необходимой для проведения эксперимента. 300 мл требуются на человека в день. Принимать во внимание продолжительность эксперимента (например, 1 неделя/7 дней).
  4. Заполните стеклянные бутылки с водой рыбы, закрыть их и автоклав бутылок скотчем автоклава. В идеале, использование 2 Л бутылки, но также могут использоваться другие бутылки 1 Л и 5 Л.
    Примечание: Если эксперименты длинные (например, 4 недели/28 дней) и количество стеклянных бутылок ограничено, убедитесь, что для подготовки бутылки как минимум несколько дней в то время и повторить процесс (1.3-1.4) на протяжении всего эксперимента.
  5. Подготовьте преднизолон раствор стерильной фильтрации 100 мм преднизолона в диметилсульфоксид (ДМСО). Замораживание фонда в 1 мл или 2 мл аликвоты пробки microcentrifuge.
    Предупреждение: Всегда Одежда защитная одежда когда совместно с преднизолоном (защитные перчатки, защитные очки, лаборатории пальто).
  6. В первый день эксперимента готовить растворы инкубации с преднизолоном и ДМСО, соответственно. С этой целью разморозить необходимое количество 100 мм преднизолон раствор и добавить преднизолон газобетона рыбы воду в конечной концентрации 50 мкм.
    1. Для контроля лечения добавьте соответствующий объем ДМСО газобетона рыбы воды. В качестве примера производить 2 Л преднизолона содержащих рыбы воду, добавьте 1 mL акций преднизолон 100 мм в 2 Л воды рыбы. В другой бутылка 2 Л воды рыбы добавьте 1 мл ДМСО, соответственно.
    2. Работа в соответствующее место, предназначенный для выполнения медикаментозного лечения, в идеале в комнате в 27 ° C.

2. поколение травм в Zebrafish плавники

Примечание: Нанести кости плавники данио рерио, выполняют резекцию плавника (ампутация, обычно в хвостовой плавник) или перелом отдельных костных плавник лучи (перелом модель). С этой целью сначала обезболивают взрослых рыбок данио.

  1. Ампутация
    1. Подготовить обезболивают взрослых рыбок данио, диаметром 100 мм Петри, содержащий 0,02% MS-222 (этил-3-аминобензоат Метансульфонат) в воде рыбы (эта вода не нужно быть автоклавного твердения).
      1. В то время передать один данио рерио содержащие Петри MS-222 с помощью чистой рыбы и проинкубируйте его до тех пор, пока он лежит на его стороне без движения и не реагировать на прикосновения. Проверьте последний прикоснувшись анальный плавник с тупым щипцами.
      2. Подождите, пока не будет достигнут уровень 4 анестезии, которая является соответствующий уровень для плавника резекцией12. На данном этапе уменьшается скорость opercular движения, теряется тонус мышц и рыба не двигаться после касания12.
    2. Возьмите тупым щипцы и передачи анестезированные данио рерио тщательно перевернутой крышкой 100 мм Петри. Место у рыбок данио на его боковой стороне. Убедитесь, что у рыбок данио всегда лежат в ту же ориентацию, например на их стороне правой тела. С скальпелем или лезвием бритвы иссечения 50% плавника (рис. 1A, 2A).
      Примечание: Скорость регенерации плавник данио рерио зависит от объема резекции плавник ткани, т.е. больше ткани плавника резецируется, тем быстрее плавник восстанавливает13. Таким образом чтобы свести к минимуму различия в плавник регенерации убедитесь всегда иссечения плавника на том же уровне в всех данио рерио.
    3. Передать потерпевшего данио рерио газобетона стеклянный стакан, содержащие 300 мл преднизолона или ДМСО, содержащих воду из рыбы. Покрытие стекла стакан с алюминиевой фольгой во избежание побега у рыбок данио.
    4. Повторите шаги 2.1.2 для 2.1.3, пока не будет достигнуто требуемое количество данио рерио для эксперимента.
  2. Перелом ребра
    1. Подготовьте агарозы покрытием 100 мм Петри, Отопление агарозы 2% раствор в воде рыбы или E3 (эмбриона СМИ 3, хлорид натрия 50 мм, 0,17 мм хлорид калия, хлорид кальция 0,33 мм, сульфат магния 0,33 мм). Осторожно наливайте примерно 10 – 15 мл раствора в чашке Петри. В нижней части блюда должны быть полностью покрыты. Пусть агарозы затвердеть.
    2. Обезболивают данио рерио, как описано в разделе 2.1.
    3. Возьмите тупым щипцы и передачи анестезированные данио рерио тщательно агарозы покрытием 100 мм Петри. Место у рыбок данио на его боковой стороне. Под микроскопом рассечение распространение хвостовой плавник полностью, чтобы иметь возможность определить собственный костлявые плавник лучи и плавник Рэй сегментов. Убедитесь, что у рыбок данио всегда лежат в ту же ориентацию, например на их стороне правой тела.
    4. С укол иглы (0,3 мм х 13 мм) ввести перелом в центре костлявые плавник Рэй сегмента (рис. 1B). Для этого, иглы слегка на помещается сегмента до тех пор, пока трещины появляется (стрелка на рисунке 2B). В то время как мягкое давление приводит к перелом только один из двух противоположных hemirays сильнее давление приведет к перелом обеих hemiray сегментов.
      1. Не вводить слишком много трещин в плавники, так как это будет значительно нарушить стабильность плавника. Как предложение применить переломы только в 3-5 плавник лучи.
      2. Всегда производить переломов в соответствующих сегментах через различные плавник лучи и данио рерио, например в спинном плавнике лучи 3, 7 (или 8) и брюшной плавник Рэй 3. Проксимальный и дистальный уровень перелом идеально на 3 сегментов проксимальнее плавник лучи бифуркации пункт 11.
    5. Передать потерпевшего данио рерио газобетона стеклянный стакан, содержащие 300 мл преднизолона или ДМСО, содержащих воду из рыбы. Покрытие стекла стакан с алюминиевой фольгой во избежание побега у рыбок данио.
    6. Повторите шаги 2.2.2 для 2.2.5, пока не будет достигнуто требуемое количество данио рерио для эксперимента.

3. поколение травм черепа череп (трепанации)

Примечание: Calvariae в zebrafish гомологичных подвздошную костей млекопитающих. Таким образом эти экзоскелета кости14 представляют ткани особый интерес при изучении патогенеза GIO. Травмировать черепа, трепанация выполняется путем сверлить отверстие в Фронтале ОС или ОС parietale (рис. 1 c, 2 C) с помощью microdrill11.

  1. Обезболивают данио рерио согласно разделу 2.1.
  2. Держите наркотизированных данио рерио вертикально с щипцами, так что кости черепа хорошо видны под микроскопом рассечение сверху (рис. 1 c).
  3. Найдите вращающегося microdrill в центре лобная кость (Os Фронтале) и сенсорных кости. Производимых отверстие имеет размер microdrill Берр (500 мкм, Рисунок 2 c, рисунок 3B).
    Примечание: Обязательно не переместить microdrill с боков при производстве травмы. Также остановите немедленно, когда сопротивление костей внезапно падает. Не сверлить любого дальнейшего, иначе мозг будет поврежден 15.
  4. Передать потерпевшего данио рерио клетке, заполненный водой рыбы до тех пор, пока он полностью восстанавливается от анестезии. Смотрите его внимательно.
  5. Передавать потерпевшего данио рерио рыбы воды плюс преднизолона или ДМСО, содержащий стеклянный стакан.

4. Лечение рыбок данио во время инкубации

Примечание: При применении преднизолона/ДМСО, препарат, содержащий рыба должна быть изменена ежедневно, и данио рерио нужно кормить регулярно.

  1. Изменения воды
    1. Обмен воды рыба, оттепель фондовой преднизолон 100 мм и подготовить необходимое количество 50 мкм преднизолона в газобетона рыбы воды свежие каждый день периода лечения. Подготовьте ДМСО, содержащих воду рыбы для управления данио рерио соответственно.
    2. Возьмите стеклянный стакан, содержащие один размещены данио рерио в ее решении инкубации и передачи решения, включая данио рерио в соответствующий контейнер, например клетке временного жилья.
      Примечание: Всегда использовать отдельные промежуточные контейнеры для преднизолона и ДМСО лечение данио рерио, соответственно, чтобы убедиться, данио рерио управления ДМСО не получить воздействию преднизолона и наоборот.
    3. Стеклянный стакан залейте свежий препарат, содержащий рыба (300 мл).
    4. Трансфер данио рерио из промежуточного контейнера в стеклянный стакан, содержащий свежие инкубации решения с помощью чистой рыбы. Положите обратно фольги во избежание побега у рыбок данио.
    5. Если время эксперимента превышает 2 недели, Обмен стеклянные стаканы.
  2. Питание
    1. Во время короткого лечения (на срок до 2 дней) не кормить рыбок данио. Во время больше экспериментов кормите рыбок данио. Особая осторожность во избежание загрязнения инкубации решения. Таким образом кормить с ssp. Артемия , а не с хлопьеобразный корм и только на каждый второй день.
      Примечание: Артемий используются регулярно кормить молодых рыбок данио и должна быть доступна в блоке haltering данио рерио.
      1. Примерно 2 часа перед тем, как осуществляется обмен воды рыбу, кормить рыбок данио с ssp артемии в их стеклянные стаканы. Чтобы сделать это, используйте пластиковые пипетки и кормить 0,5 – 1 мл раствора насиженным артемии в стеклянный стакан.
      2. Подождите 2 h и обмена решение инкубации с свежие препарат, содержащий воды рыбы в соответствии со статьей 4.1.

5. Анализ образцов

Примечание: После инкубации раненых данио рерио преднизолона и ДМСО, содержащих рыбы воду, соответственно, либо анализ минерализации/кальцификации костей (5.1 5.3) или осуществлять живых изображений данио рерио под микроскопом диссекции (5.4) 1011,,16. Используйте живой изображений для определения длины плавника регенерации и для выявления различий в выражении гена репортера в трансгенных данио рерио.

  1. Фиксация тканей интереса
    1. Для фиксации плавники и/или черепа подготовить параформальдегида 4% (PFA) в PBS и замерзает при-20 ° C для хранения. Использовать свежеприготовленные 4% ПФА в оттепель необходимое перед использованием или PBS. Кроме того, 2% может использоваться ПФА в PBS.
      Предупреждение: PFA токсичных и должны тщательно обрабатываться под вытяжного шкафа. Носите защитную одежду.
    2. Для фиксации плавники подготовить небольшой Петри блюдо (например, 30 мм) с холодной 4% ПФА в PBS и убедитесь, что в нижней части блюдо полностью покрыта. Для фиксации черепа, подготовить немного стеклянную банку с крышкой или трубка с холодной 4% ПФА в PBS.
      Предупреждение: Ручка PFA содержащие решения только под зонт как он токсичен. Носите защитную одежду.
    3. Урожай ткани интерес.
      1. Урожай регенерации тканей плавника или плавники с переломами обезболивают данио рерио согласно разделу 2.1 или усыпить данио рерио согласно раздел 5.1.5.
      2. Передать анестезированные данио рерио крышку чашку Петри. С помощью скальпелем или лезвием бритвы, урожай плавник регенерации. Убедитесь, что включать ткани культи в регенерации плавники для облегчения обработки собранного ткани.
    4. Исправьте плавники квартиру в PFA, содержащие Петри на 4 ° C на ночь. Плоские фиксации избегает, свернувшись калачиком плавник ткани во время фиксации.
      1. Чтобы исправить плоский, захватить ткани плавника с одной тонкой щипцы на дорсальной и вентральной краю пень и погрузите его в растворе фиксации. Grab противоположного края пень с второй штраф щипцами и слегка отожмите ткани на нижней части блюдо.
      2. Держите на 10-20 s перед выпуском. Плавник ткани не должно свернуться калачиком больше. Если это так, повторите.
    5. Усыпить данио рерио, чтобы урожай тканей потерпевшего черепа. Подготовить диаметром 100 мм Петри, содержащих 0,1% MS-222 в воде рыбы. Перенести один данио рерио одновременно содержащих Петри MS-222 с помощью рыболовной сети. При достижении уровня 6 анестезии (медуллярного коллапс), ждать по крайней мере 10 мин для обеспечения смерти образца12.
    6. С помощью скальпеля отрезали головы плюс немного ствол ткани от остальной части тела. Погружайте заготовленной ткани в приготовленный раствор 4% ПФА в стеклянную банку или пластиковой трубки. Исправление для 24 ч при температуре 4 ° C с плавное покачивание.
    7. Для хранения образцов долгосрочные после фиксации, вымыть их с PBS (3 x 20 мин на RT) и метанол лечить все серии метанола (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% метанола в PBS для 20 мин).
      1. Хранить их в 100% метанола при-20 ° C. В противном случае непосредственно приступить к пятнать кости или другие анализы после мытья с PBS.
  2. Кость, пятная методы я (ализарин красный окрашивание)
    Примечание: Это окрашивание производится согласно ван Eeden et al. 199617 и18 Уокер и Киммел 2007 с изменениями.
    1. Чтобы выполнить ализарин красный окрашивания на взрослых плавники или черепа, урожай и исправить ткани, как описано в разделах 5.1.
    2. Если образцы были сохранены в метаноле при-20 ° C, увлажняет образцы, выполнив обратное метанола серии (70%, 50% и 30% в PBS, каждый 1 x 20 минут) и мыть дважды 20 мин с PBS. Вымойте образцы для 5 минут минимум деионизированной водой.
    3. Делать ализарин красный пятнать в черепа, лечить образцы с 50 мг/мл трипсина в 30% насыщенных Na2B4O7 при комнатной температуре на ночь. Образцы в это время. Промыть образцов в 30% насыщенных Na2B4O7 решение. Вымойте пробы дейонизированной водой 2 раза за 5 мин. Этот шаг не выполняется для ткани плавника.
    4. Добавить решение ализарин красный (часть B: 0.5% ализарин красный S порошок, 10% глицерина в деионизированной воде) и рок образцов во время инкубации на RT. Check для пятнать после 1, 2, 4 часов или на ночь.
    5. Чтобы удалить образцы относиться к ним с сокращением 1% калия гидроксид: глицерин серию (3:1 ночь, ночь 1:1, 1:3 ночи).
    6. Хранение образцов в растворе 1:1 0.1% калия гидроксид: 80% глицерина и смонтировать их с 80% глицерином для воображения.
      Примечание: Для комбинированных Альциановый синий/ализарин красный пятнать лечить образцы с Альциановый синий окрашивание раствора (часть A: окончательный 0,02% Альциановый синий, 50 мм MgCl2, 70% этиловом спирте) после регидратации (раздел 5.2.2) за 2 ч на RT. лечить плавники с серией снижение этанола в 50 мм MgCl2 (70%, 50%, 30%, каждый 1 x 15 мин.) и мыть их как минимум 1 час (3 x 20 минут) в деионизированной воде. Продолжите ализарин красный окрашивание (раздел 5.2).
  3. Кости методы окраски II (Флуорексон окрашивание)
    Примечание: Чтобы обнаружить отложение кальция в плавник переломы и травмы черепа, живой рыбы инкубируют в Флуорексон, содержащий решение.
    1. Подготовьте необходимое количество Флуорексон 0,2% в деионизированной воде (рН 7,5). Убедитесь, что рН нейтральным. Используйте 1 M NaOH для регулировки рН.
    2. Инкубируйте до 3 данио рерио одновременно в 100 мл раствора Флуорексон для 20 мин в стеклянный стакан, покрытые алюминиевой фольги.
    3. Данио рерио передать стакан с водой рыбы. Пусть они плавают кратко до их перевода в новый стакан с водой рыбы. Пусть они плавают в этой новой стакан на 20 минут, чтобы мыть. Возьмите фотографии (см. раздел 5.4).
  4. Жить, Визуализация данио рерио
    1. Используйте этот подход для получения изображения регенерации костной ткани, такие как в плавник или череп на протяжении всего эксперимента без ущерба для рыбок данио. Обезболивают данио рерио согласно разделу 2.1.
    2. Чтобы получить изображения плавник регенерирует, передачи анестезированные данио рерио на агарозы покрытием Петри (см. раздел 2.2.1 и Рисунок 1B).
    3. Чтобы получить изображения регенерации костей черепа, место данио рерио upright в губки (рис. 1 d) или поместить его в агарозном покрытием блюдо, который был подготовлен провести ствол данио рерио.
    4. Получение изображений на желаемого увеличения и разрешение с использованием stereomicroscopic установки.
    5. Данио рерио вернуть контейнер с пресной или препарат, содержащий воды рыбы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, представленные здесь неоднократно использовались для формирования быстрого костей в ходе регенерации данио рерио ребра и череп10,11,16. В сочетании с представленным методом преднизолона администрации может осуществляться исследования влияния преднизолона в ходе костной регенерации. Например можно выполнить исследования формирования костей и минерализации в регенерации. Преднизолон, как другие глюкокортикоидов19,20, приводит к общей ингибирование плавник регенерации, включая формирование костей, как определяется ализарин красный окрашивания на фиксированной хвостовой плавник ткани (рис. 3A). Аналогичным образом преднизолон проволочек влияет на закрытие травмы (черепа) череп, который может быть проиллюстрирована ализарин красный (рис. 3B) или в естественных условиях Флуорексон пятнать. Кроме того преднизолон оказывает глубокое противовоспалительный эффект в ребра и череп ткани, вызывая апоптоз в линии моноцитов/макрофагов. Снижение макрофагов, числа могут быть обнаружены иммуногистохимия на замороженные ткани разделы, например, с помощью антител анти mcherry в трансгенных mpeg1: mCherry данио рерио (рис. 3 c)10,21 . Аналогичным образом количество, распределение, распространение и апоптоз других типов клеток интерес как в экзо - и эндоскелет (например, позвонков) могут быть проанализированы с помощью иммуногистохимия.

Figure 1
Рисунок 1 : Проведены процедуры в данио рерио. (A) резекция хвостового плавника (ампутация) в анестезированные данио рерио с помощью скальпеля. Красная пунктирная линия показывает уровень ампутации. Fin (B) Рэй перелом в анестезированные данио рерио, осуществляемых с инъекционной иглы под стереомикроскопом. Рыба лежит на Петри агарозы покрытием во время процедуры. Покрытием агарозы Петри используются также приобрести изображений плавников данио рерио во время регенерации или перелом ремонта. (C) трепанации calvariae (травмы черепа) выполнено в zebrafish anaestetized с помощью microdrill под стереомикроскопом. (D) видеосъемка регенерации костей черепа после травмы. Анестезированные данио рерио размещается вертикально в губки и изображения полученные с помощью стереомикроскопом. Петри заполняется водой рыбы, содержащий 0,02% MS-222. (E) инкубации данио рерио преднизолона или ДМСО, содержащие воды рыбы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Микроскопические живой вид травмы на 0 h пост травмы hpi). (A) купированный хвостового плавника. Шкалы бар = 200 µm. (B) Fractured плавник Рэй. Перелом обозначается красной стрелкой. Шкалы бар = 100 µm. (C) Trepanated череп. На сайте травмы обозначается белые стрелки. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Представитель результаты лечения преднизолоном в взрослых рыбок данио. (A) ализарин, которую красный окрашенных плавник регенерируется на 14 дней поста ампутации (ДПВ) и дней лечения (dt). Преднизолон обработанной плавник регенерация являются короче (не показан) и меньше домена ализарин красный, который обнаруживается положительный кости матрица. Шкалы бар = 500 мкм. (B) ализарин красный окрашенные черепа в 7 дней поста травмы (dpi) и dt. Шкалы бар = 100 мкм. Эта цифра была изменена с разрешением10. (C) Cryosection посмотреть ранен черепа и мозга ткани обработанных (преднизолон) и без лечения (ДМСО) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) трансгенных репортер рыбы, в котором макрофагов (врожденные иммунные клетки) помечены красным цветом в зеленых22помечены 21 и кости, образуя остеобластов. Количество макрофаги значительно падает в лечение преднизолоном данио рерио. Иммуногистохимия была выполнена, как описано в Geurtzen и др. 10. ядер помечены синим цветом (DAPI). Шкалы бар = 20 мкм. BF: яркие области, эпид: эпидермис, bn: кости. Эта цифра была изменена с разрешением10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Данио рерио оказались полезными в скелетных исследований во многих отношениях. Выбранный мутантов имитировать аспекты заболеваний человека, таких как несовершенный Остеогенез или остеоартрита23,24,25,26,27, и личинки, а также весы используются для идентифицировать анаболические соединений костей в малые молекулы экраны7,,2829. Кроме того, лечения рыбки данио рерио с препаратов, которые применяются в клинической практике идеально подходят для изучения предполагаемого неблагоприятные последствия, например в костной ткани. В этом контексте присутствие быстро регенерирующее кости выгодно для изучения основных механизмов лекарства индуцированной кости недостатков. Здесь мы представляем протокол, в котором медикаментозное лечение с преднизолоном глюкокортикоидов, часто используемые противовоспалительный препарат с отрицательными последствиями в костной ткани, сочетается с Взрослый костной регенерации режимов. Этот протокол успешно был использован чтобы побудить иммуносупрессивных и кости тормозящее действие в регенеративных тканей данио рерио и также может быть адаптирована для исследования о влиянии преднизолона и других наркотиков в взрослых ткани, такие как позвоночника. Когда лечение иммуносупрессивным препаратом выполняются в zebrafish проходящих плавника или череп регенерации следует учитывать следующие сведения.

Воспроизводимость анализов травмы

Во время регенерации плавник скорость регенерации (то есть, отрастания плавник ткани, в том числе кости, за единицу времени) в значительной степени зависит от количества плавник ткани, которая в настоящее время резекции13. Чтобы избежать нежелательных колебаний плавник регенерации, убедитесь, что всегда иссечения эквивалентные суммы плавник ткани во всех образцах.

Выполнение костлявые плавник Рэй переломов осуществляется нажатием немного иглу на центр сегмента Рэй выбранной костлявые плавник. Как костлявые плавник лучи состоят из 2 противоположных hemirays, количество давления определяет ли только одна или обе hemirays перелом. Мы предпочитаем, чтобы применить низкого давления для разрушения только один hemiray, потому что перелом обеих hemirays стремится дестабилизировать луч плавника, которая в результате может отсоединить в течение следующих дней.

Подвздошную травмы черепа, микросверление следует выполнять осторожно. Если ущерб нанесен в мозг (т.е., мозжечка) осанки и опорно-двигательного дефицита станут очевидными вплавь неустойчивой образца15. Данио рерио с мозжечковой травмы может показать побочных реакций к медикаментозному лечению и не должны использоваться для изучения костной регенерации.

Соображения в отношении медикаментозного лечения

Производить последовательное иммуносупрессивных и анти регенеративный эффект в взрослых рыбок данио мы используем дозе 50 мкм преднизолона в воде рыбы. Мы определили эту дозу во время экспериментов первоначальный доза ответ в личинок и взрослых рыбок данио. Таким образом доза реакция эксперименты должны осуществляться определить необходимые дозы других иммуносупрессивных агентов, которые могут быть применены. Для взрослых мы рекомендуем совместить эти первоначальные эксперименты с режима регенерации плавник, как регенерации длина плавник очень чувствительны и легко обнаруживать индикация для изменения ткани.

Иммунодепрессивные лечения предрасполагает обработанных образцов микробной инфекции. Таким образом Одноместный жилья в газобетона мензурки, содержащие газобетона рыба имеет важное значение. Хотя эти условия являются более громоздким для выполнения и не стерильные, они помогают свести к минимуму инфекции лечение рыбок данио. Мы не сделали предварительной обработки («стерилизации») яйца артемии. Однако это может быть дополнительной мерой для предотвращения инфекции данио рерио, при необходимости. Кроме того антисептические вещества, такие как метиленовый синий (1%) могут добавляться к рыбы воды перед использованием.

Эксперименты с преднизолоном, кратко - и долгосрочные, требуют ежедневных изменений воды рыбы. Мы рассматривали взрослых рыбок данио до 8 недель. Лечение большого числа лиц, долгое время может привести к некоторых экспериментальных «бремя» и следует тщательно планировать. Это ключевой всегда иметь необходимое количество газобетона рыбы воды и стеклянные изделия готов. Хотя это не было протестировано в данио рерио (насколько нам известно), имплантация медленное высвобождение гранул на наркотики интерес может представлять ценную альтернативу для долгосрочного воздействия наркотиков в данио рерио.

Анализ в трансгенных данио рерио

Здесь мы представляем 2 методы пятно для минерализации/кальцификации костных тканей ализарин красный и Флуорексон окрашивания. Кроме того мы покажем как изображение восстанавливающий ребра и череп ткани в естественных условиях с помощью стереомикроскопом. Последний метод является очень полезным, если трансгенных данио рерио, отчетности количество или активности отдельных клеток, например остеобластов или иммунных клеток, отражаются. Например перед жертвуя ранения и лечение преднизолоном данио рерио выполнять ализарин красный окрашивание, плавник восстанавливает или trepanated черепа, претерпевает ремонта могут быть сфотографированы искать наличие, количество и активность кости, образуя остеобластов в Репортер трансгенные линии Tg (osterix: nGFP)22. Аналогичным образом эпидермальный рану закрытие, которое происходит в течение дня, могут быть визуализированы в трансгенной рыбы, которые выражают Флюорофор в эпидермальной ткани. Кроме того накопление иммунных клеток на месте травмы (или их отсутствие в лечение преднизолоном лиц) могут контролироваться легко с стереомикроскопом оснащены требуемый источник света и фильтры.

В целом для изучения последствий иммуносупрессивные агентов и других наркотиков после системного администрирования в данио рерио, проходят костной регенерации в плавник или череп может использоваться протокол, представленные здесь. Это будет полезно для разграничения патогенеза GIO и изучить механизмы, лежащие в основе успешного костной регенерации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Грант центр восстановительной терапии Дрезден («данио рерио как модель разгадать механизмов глюкокортикоидных индуцированной костной потери») и дополнительно грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, проект 387653785) к ФК. Мы очень благодарны Ян Kaslin и Авинаш Chekuru за их руководство и помощь на проведение трепанации calvariae и переломов в костлявые плавник лучи. Эксперименты были разработаны, выполняются и проанализированы кг и FK. FK написал рукопись. Мы также хотели бы поблагодарить Katrin Ламберт, Николь Cudak и другие члены Кнопф и бренд лабораторий для оказания технической помощи и обсуждения. Мы благодарим также Marika Фишер и Иткой Michling для ухода за отличные рыбные и Henriette Knopf и Джош карри для корректуры рукопись.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 140 данио рерио кости регенерации травмы Fin череп глюкокортикоидов преднизолон
Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult… More

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter