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Developmental Biology

Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

Nous décrivons ici 3 modèles de lésion de poisson-zèbre adulte et leur utilisation combinée avec un traitement immunosuppresseur. Nous fournissons des conseils sur l’imagerie de la régénération des tissus et sur la détection de la minéralisation des os qui y sont.

Abstract

Poisson zèbre sont capables de régénérer des divers organes, y compris les appendices (nageoires) suite à une amputation. Il s’agit de la régénération des os, ce qui repousse dans environ deux semaines après une blessure. En outre, poisson zèbre sont capables de guérir les os rapidement après trépanation du crâne et réparer les fractures qui peuvent être facilement introduits dans les rayons des nageoires osseuses poisson zèbre. Ces tests de blessures représentent des paradigmes expérimentaux faisables pour tester l’effet des médicaments administrés sur la formation rapide d’os. Nous décrivons ici l’utilisation de ces modèles de 3 lésions et leur utilisation combinée avec un traitement aux glucocorticoïdes systémiques, qui exerce des effets inhibiteurs et immunosuppressives osseuse. Nous fournissons un flux de travail sur la façon de préparer un traitement immunosuppresseur chez le poisson zèbre adulte, montrent comment effectuer la nageoire amputation, trépanation de substance OS et fractures de la nageoire et décrire comment l’utilisation des glucocorticoïdes affecte les deux os formant les ostéoblastes et les cellules de la lignée monocyte/macrophage dans le cadre de l’immunité innée dans le tissu osseux.

Introduction

Poisson zèbre représentent un puissant modèle animal pour étudier la maladie et du développement des vertébrés. Cela est dû au fait qu’ils sont des petits animaux qui se reproduisent très bien et que leur génome est entièrement séquencé et ouvert aux manipulations1. D’autres avantages incluent la possibilité d’effectuer une imagerie live continue à différentes étapes, y compris en vivo imagerie du poisson-zèbre adulte2et la capacité d’exécuter des écrans de drogues à haut débit dans les larves de poisson zèbre3. En outre, poisson zèbre possèdent une grande capacité régénératrice dans une variété d’organes et de tissus, y compris les os et donc constituer un système utile pour étudier les maladies squelettiques et réparer4,5.

L’ostéoporose induite par les glucocorticoïdes (GIO) est une maladie qui résulte d’un traitement à long terme avec des glucocorticoïdes, par exemple dans le cadre du traitement des maladies auto-immunes telles que de l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. GIO se développe chez environ 30 % des patients traités par glucocorticoïdes et représente une édition de santé majeur6; par conséquent, il est important d’étudier l’impact de l’immunosuppression sur tissu osseux dans les moindres détails. Ces dernières années une variété de modèles de poisson-zèbre traitant de la pathogenèse du SCAD ont été développés. La perte osseuse médiée par les glucocorticoïdes a été induite chez les larves de poisson zèbre, par exemple, qui a conduit à l’identification des composés avertissent augmente la masse osseuse chez un médicament écran7. En outre, les effets inhibiteurs osseuse induite par les glucocorticoïdes ont été imités en écailles de poisson-zèbre fois in vitro et in vivo,8,9. Ces tests sont très convaincants des approches, surtout quand il s’agit d’identifier de nouveaux médicaments anabolisants immunosuppresseurs et OS. Cependant, ils seulement partiellement tiennent compte de l’endosquelette et n’ont pas été effectuées dans un contexte régénératrice. Ainsi, ils ne permettent pas l’enquête des effets médiés par les glucocorticoïdes lors des modes rapides de la formation osseuse adulte, régénératrice.

Nous présentons ici un protocole permettant aux chercheurs d’étudier les effets médiés par les glucocorticoïdes sur OS de poisson-zèbre adulte en cours de régénération. Modèles de lésion incluent amputation partielle de la nageoire caudale du poisson-zèbre, trépanation du crâne, ainsi que la création des fractures de ray nageoire (Figure 1 a-1 C) et sont combinés avec des glucocorticoïdes exposition via l’incubation (Figure 1E ). Nous avons récemment utilisé une partie du présent protocole pour décrire les conséquences de l’exposition à la prednisolone, un des médicaments couramment prescrits corticostéroïde, le poisson-zèbre adulte régénérant nageoire et crâne OS10. Chez le poisson zèbre, administration de prednisolone entraîne la prolifération ostéoblastique une diminution, la différenciation ostéoblastique incomplète et rapide induction de l’apoptose dans la lignée de monocytes/macrophages10. Dans le présent protocole, on décrit aussi comment les fractures peuvent être introduits dans seul aileron osseuses ray segments11, que cette approche peut être utile lorsque l'on étudie les effets médiés par les glucocorticoïdes sur l’os qui se produisent au cours de la réparation de la fracture. Les méthodes présentées ici vont aidera à résoudre qui sous-tendent les mécanismes d’action des glucocorticoïdes dans la régénération osseuse de rapidement et peuvent également être employées dans d’autres contextes d’administration systémique de médicaments dans le cadre de la régénération tissulaire de poisson-zèbre.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par la Landesdirektion de Dresde (numéros de permis : AZ 24D-9168.11-1/2008-1, 24-9168.11-1/2011-52 AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. préparation des matériaux et des Solutions

NOTE : Prednisolone, comme autres glucocorticoïdes, mène à l’immunosuppression. Ainsi, la précaution doit être prise pour prévenir l’infection chez les animaux traités pendant l’expérience. À cette fin, autoclave le verre et « l’eau du poisson » (c.-à-d., l’eau qui sert à élever le poisson-zèbre adulte) avant de commencer l’expérience.

  1. Calculer le nombre de poisson-zèbre à être utilisées pour l’expérience. N’oubliez pas d’inclure les personnes qui servent de commandes.
  2. Autoclave 600 mL béchers en verre qui sont recouverts de papier d’aluminium avec ruban autoclave. Dards-perches seront traitées individuellement, carafe en 1 verre est donc requis par le poisson-zèbre.
  3. Calculer la quantité de poissons d’eau nécessaire pour l’expérience. 300 mL sont nécessaires par personne et par jour. Prendre en considération la durée de l’expérience (par exemple, 1 semaine/7 jours).
  4. Remplir des bouteilles en verre avec de l’eau de poissons, près d’eux et stériliser les bouteilles avec ruban autoclave. Idéalement, utiliser des bouteilles de 2 L, mais les autres bouteilles 1 L ou 5 L peuvent être utilisés aussi bien.
    Remarque : Si les expériences sont longues (p. ex., 4 semaines/28 jours) et la quantité de bouteilles en verre est limitée, veillez à préparer les bouteilles pendant au moins plusieurs jours à la fois et répétez le processus (de 1,3 à 1,4) tout au long de l’expérience.
  5. Préparer une solution mère de prednisolone de prednisolone stérile filtré 100 mM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Congeler le bouillon dans 1 mL ou parties aliquotes microcentrifuge de tube 2 mL.
    ATTENTION : Toujours porter de protection vêtements quand travailler avec prednisolone (gants, lunettes, blouse).
  6. Le premier jour de l’expérience, préparer les solutions d’incubation avec prednisolone et DMSO, respectivement. À cette fin, décongeler la quantité nécessaire de solution mère de prednisolone de 100 mM et ajouter prednisolone pour eau poissons stérilisés à l’autoclave à une concentration finale de 50 µM.
    1. Pour les traitements de contrôle, ajoutez le volume correspondant de DMSO pour eau poissons stérilisés à l’autoclave. À titre d’exemple, pour produire l’eau de poisson contenant 2 L prednisolone, ajouter 1 mL de stock de prednisolone de 100 mM à 2 L d’eau poisson. Dans une autre bouteille de 2 L d’eau de poisson, ajouter 1 mL de DMSO, proportionnellement.
    2. Travailler dans un lieu approprié qui est désigné pour exécuter des traitements médicamenteux, idéalement dans une pièce à 27 ° C.

2. génération des blessures dans les nageoires du poisson-zèbre

Remarque : Pour blesser osseuse dans les nageoires du poisson-zèbre, effectuer la résection de la nageoire (amputation, habituellement dans la nageoire caudale) ou fracture des rayons osseux individuels (modèle de fracture). Pour ce faire anesthésier poisson zèbre adulte tout d’abord.

  1. Amputation
    1. Pour anesthésier les poissons zèbres adultes, préparer un diamètre de 100 mm boîte de Pétri contenant 0,02 % MS-222 (-3-aminobenzoate d’éthyle méthanesulfonate) dans l’eau de poissons (cette eau n’a pas besoin d’être stérilisés à l’autoclave).
      1. Transférer un poisson zèbre à la fois à la boîte de Pétri contenant MS-222 à l’aide d’un filet de pêche et il incuber jusqu'à ce qu’il se trouve sur le côté sans mouvement et ne répond pas au toucher. Testez ce dernier en appuyant sur la nageoire anale avec une pince émoussée.
      2. Attendre jusqu'à atteindre le niveau 4 de l’anesthésie qui est le niveau approprié pour la nageoire résection12. À ce stade, l’intensité du mouvement operculaire est diminuée, tonus musculaire est perdu et le poisson ne bouge pas sur contact12.
    2. Prenez la pince émoussée et transférer le poisson-zèbre anesthésié avec soin au couvercle de la boîte de Pétri de 100 mm inversé. Placez le poisson-zèbre sur le côté latéral. Assurez-vous que le poisson-zèbre se trouvent toujours dans le même sens, par exemple sur leur côté corps droit. Avec un scalpel ou une lame de rasoir, résection 50 % de la nageoire (Figure 1 a, 2 a).
      Remarque : La vitesse de régénération de nageoire de poisson-zèbre dépend de la quantité de tissu réséqué nageoire, c'est-à-dire, le plus fin de tissu est réséqué, plus vite la nageoire régénère13. Ainsi, afin de minimiser les variations dans la régénération de la nageoire Assurez-vous de résection toujours l’aileron au même niveau chez le poisson zèbre tous.
    3. Transférer le poisson-zèbre blessé dans un bécher en verre stérilisé contenant 300 mL de prednisolone ou DMSO contenant de l’eau de poissons stérilisés à l’autoclave. Couvrir le bécher en verre avec du papier aluminium pour éviter le poisson-zèbre de s’échapper.
    4. Répétez les étapes 2.1.2 à 2.1.3 jusqu'à atteindre le nombre requis de poisson-zèbre pour l’expérience.
  2. Fracture de l’aileron
    1. Préparer un gel d’agarose-enduit 100 mm boîte de Pétri en chauffant une solution à 2 % d’agarose dans l’eau poissons ou E3 (milieux embryon 3, 50 mM chlorure de sodium, chlorure de potassium 0,17 mM, 0,33 mM chlorure de calcium, sulfate de magnésium de 0,33 mM). Verser délicatement environ 10 à 15 mL de la solution dans la boîte de Pétri. Le fond du plat doit être entièrement recouvert. Laissez l’agarose à se solidifier.
    2. Anesthésier les poissons zèbres comme décrit dans la section 2.1.
    3. Prenez la pince émoussée et transférer le poisson-zèbre anesthésié soigneusement à l’enduit de gel d’agarose 100 mm boîte de Pétri. Placez le poisson-zèbre sur le côté latéral. Sous le microscope à dissection, répandre la nageoire caudale complètement pour être capable d’identifier les différents rayons osseux et fin ray segments. Assurez-vous que le poisson-zèbre se trouvent toujours dans le même sens, par exemple sur leur côté corps droit.
    4. Avec une aiguille d’injection (0,3 mm x 13 mm) introduire une fracture dans le centre d’un segment de ray nageoires osseuses (Figure 1 b). Pour ce faire, l’aiguille est légèrement pressée sur le segment jusqu'à ce qu’une fissure apparaît (flèche dans la Figure 2 b). Tandis que pression douce mène à se pour fracturer seul d'entre les deux hemirays adverses plus fortes pression dirigera à la pour cassure des deux segments de hemiray.
      1. Ne pas introduire trop de fractures en nageoires, puisque ceci nuira grandement à la stabilité de la nageoire. À titre de suggestion, appliquer les fractures que dans 3 à 5 rayons de la nageoire.
      2. Toujours produire des fractures dans les segments correspondants à travers les différents rayons et poisson zèbre, par exemple dans les rayons de la nageoire dorsale 3, 7 (ou 8) et le rayon de la nageoire ventrale 3. Au niveau proximal distal de fracture est idéal à 3 segments proximaux pour bifurcation point 11 les rayons de la nageoire.
    5. Transférer le poisson-zèbre blessé dans un bécher en verre stérilisé contenant 300 mL de prednisolone ou DMSO contenant de l’eau de poissons stérilisés à l’autoclave. Couvrir le bécher en verre avec du papier aluminium pour éviter le poisson-zèbre de s’échapper.
    6. Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.5 jusqu'à atteindre le nombre requis de poisson-zèbre pour l’expérience.

3. production de substance crâne blessures (trépanation)

Remarque : Le cranienne chez le poisson zèbre sont homologues aux substance os chez les mammifères. Ainsi, ces os exosquelette14 représentent un tissu présentant un intérêt particulier lors de l’étude de la pathogenèse du SCAD. Pour blesser le crâne, la trépanation est effectuée en forant un trou dans l’Os frontale et/ou l' Os parietale (Figure 1, 2C) avec l’aide d’un microforages11.

  1. Anesthésier le poisson-zèbre conformément au point 2.1.
  2. Tenir le poisson-zèbre anesthésié verticale avec une pince, afin que les os calvarial sont bien visibles au microscope dissection par dessus (Figure 1).
  3. Localisez le microforages rotatif sur le centre de l’os frontal (Os frontale) et toucher l’OS. Le trou de produit est de la taille de la meule microforages (500 µm, Figure 2, Figure 3 b).
    Remarque : Assurez-vous de ne pas déplacer le microforages latéralement tout en produisant de la blessure. Également arrêter immédiatement lorsque la résistance de l’OS tombe soudainement. Ne percez pas plus, sinon le cerveau est endommagé 15.
  4. Transférer le poisson-zèbre blessé dans une cage remplie de poissons d’eau jusqu'à ce qu’il récupère complètement de l’anesthésie. Regardez-le attentivement.
  5. Transférer le poisson-zèbre blessé vers un poissons d’eau plus la prednisolone ou la carafe en verre contenant DMSO.

4. traitement du poisson-zèbre pendant l’Incubation

Remarque : Lors de l’application de prednisolone/DMSO, le médicament contenant des poissons d’eau doit être changée tous les jours, et poisson-zèbre ont besoin d’être nourri régulièrement.

  1. Changements d’eau
    1. Pour échanger l’eau poisson, décongeler le stock de prednisolone de 100 mM et préparer la quantité nécessaire de prednisolone µM 50 chez les poissons autoclavés eau fraîche tous les jours de la période de traitement. Préparer le DMSO contenant des poissons d’eau pour le poisson-zèbre de contrôle en conséquence.
    2. Prendre un gobelet de verre contenant un seul poisson-zèbre logé dans sa solution d’incubation et transvaser la solution dont le poisson-zèbre dans un contenant approprié, par exemple une cage de logement temporelle.
      NOTE : Toujours utiliser de récipients provisoires distinct pour la prednisolone et de DMSO traité zebrafish, respectivement, pour vous assurer que le poisson-zèbre de DMSO contrôle ne sont pas exposés en prednisolone et vice versa.
    3. Remplissez la carafe en verre avec frais médicament contenant de l’eau des poissons (300 mL).
    4. Transférer le poisson-zèbre du conteneur provisoire dans le bécher de verre contenant une solution fraîche d’incubation à l’aide d’un filet de pêche. Remettre en place la feuille afin d’éviter le poisson-zèbre de s’échapper.
    5. Si la durée de l’expérience dépasse 2 semaines, échanger les béchers en verre.
  2. Alimentation
    1. Lors de traitements courts (pendant 2 jours) ne pas nourrir les poissons zèbres. Au cours d’expériences plus longtemps, nourrir le poisson-zèbre. Prenez soin d’éviter la pollution de la solution d’incubation. Ainsi, se nourrissent avec Artemia SSP plutôt qu’avec de la nourriture de flocon et seulement tous les deux jours.
      NOTE : Artemia sont régulièrement utilisées pour nourrir le jeune poisson-zèbre et devrait être disponible dans l’unité haltering de poisson-zèbre.
      1. Environ 2 h avant que l’eau du poisson est échangé, nourrir le poisson-zèbre avec Artemia ssp dans leurs béchers en verre. Pour ce faire, utilisez une pipette en plastique et se nourrissent de 0,5 à 1 mL de solution d’Artemia éclose par carafe en verre.
      2. Attendez pendant 2 h et échanger la solution d’incubation dans la drogue douce contenant des poissons d’eau conformément à l’article 4.1.

5. les analyses des échantillons

Remarque : Après une incubation de poisson-zèbre blessé en prednisolone et DMSO contenant des poissons d’eau, respectivement, soit effectuer des analyses de minéralisation/calcification osseuse (5.1 à 5.3) ou effectuer imagerie direct du poisson-zèbre au microscope à dissection (5.4) 10,11,16. Utiliser direct imaging pour déterminer les régénérer longueur nageoire et de déceler des différences dans l’expression du gène rapporteur dans le zebrafish transgénique.

  1. Fixation des tissus d’intérêt
    1. Pour la fixation des nageoires ou des crânes préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS et congeler à-20 ° C pour le stockage. Utiliser fraîchement préparées 4 % PFA dans PBS ou de dégel la quantité nécessaire avant toute utilisation. Sinon, 2 % PFA dans du PBS peut être utilisé.
      ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin sous une hotte aspirante. Portez des vêtements protecteurs.
    2. Pour la fixation des nageoires, préparer un petit plat de Pétri (p. ex., 30 mm) avec froid 4 % PFA dans du PBS et assurez-vous que le fond du plat est entièrement recouvert. Pour la fixation des crânes, préparer un petit bocal en verre avec couvercle ou un tube froid 4 % PFA dans du PBS.
      ATTENTION : Poignée PFA contenant des solutions uniquement sous la hotte car elle est toxique. Portez des vêtements protecteurs.
    3. Récolter le tissu d’intérêt.
      1. Pour récolter en régénération tissu fin ou ailettes avec fractures anesthésier le poisson-zèbre conformément au point 2.1 ou euthanasier le poisson-zèbre conformément au point 5.1.5.
      2. Transférer le poisson-zèbre anesthésié au couvercle d’une boîte de Pétri. À l’aide d’un bistouri ou une lame de rasoir, récolter le régénérer de nageoire. Assurez-vous d’inclure tissus moignon dans la régénération de palmes pour faciliter la manipulation des tissus récoltés.
    4. Difficulté nageoires plat dans la PFA contenant Pétri à 4 ° C durant la nuit. Fixation plate évite de curling vers le haut du tissu fin durant la fixation.
      1. Pour corriger le plat, prenez le tissu fin avec une pince fine au bord dorsal ou ventral du moignon et plonger dans la solution de fixation. Prenez le bord opposé du moignon avec une deuxième pince fine et enfoncer légèrement le tissu sur le fond du plat.
      2. Maintenez pendant 10 à 20 s avant de relâcher. Le tissu fin devrait se recroquevillent pas plus. Si c’est le cas, répétez.
    5. Euthanasier zebrafish afin de récolter des tissus du crâne blessé. Préparer un diamètre de 100 mm boîte de Pétri contenant 0,1 % MS-222 dans l’eau du poisson. Transférer un poisson zèbre à la fois à la boîte de Pétri contenant MS-222 à l’aide d’un filet de pêche. Lorsque le niveau 6 de l’anesthésie (effondrement médullaire) est atteint, attendre au moins 10 min pour assurer la mort de l’échantillon de12.
    6. À l’aide d’un scalpel coupe la tête et des tissus de tronc un peu du reste du corps. Plongez le tissu récolté dans la solution préparée de PFA de 4 % dans le bocal en verre ou en plastique tube. Difficulté pendant 24 h à 4 ° C avec le doux balancement.
    7. Pour conserver les échantillons à long terme après la fixation, lavez-les avec du PBS (3 x 20 min à ta) et méthanol-régal dans une série croissante de méthanol (1 x 30 %, 1 x 50 %, 1 x 70 %, 2 x 100 % de méthanol dans du PBS de 20 min chacun).
      1. Rangez-les dans le méthanol 100 % à-20 ° C. Sinon, directement procéder à coloration des os ou autres analyses après avoir lavé avec du PBS.
  2. OS, techniques de coloration j’ai (coloration de la solution d’alizarine)
    Remarque : Cette coloration s’effectue selon van Eeden et coll. 199617 et Walker & Kimmel 200718 sous réserve de modifications.
    1. Pour effectuer l’alizarine coloration sur les nageoires adultes ou de crânes, récolter et Difficulté tissu tel que décrit dans les sections 5.1.
    2. Si les échantillons ont été conservés dans le méthanol à-20 ° C, réhydrater les échantillons en faisant une série de méthanol inverse (70 %, 50 % et 30 % dans du PBS, chaque 1 x 20 min) et laver deux fois 20 min avec du PBS. Laver les échantillons pendant 5 min minimum avec de l’eau désionisée.
    3. Faire d’alizarine coloration dans les crânes, traiter les échantillons avec la trypsine 50 mg/mL à 30 % saturés Na2B4O7 à température ambiante pendant la nuit. Échantillons de roche pendant cette période. Na2B4O7 solution saturée d’échantillons de rinçage à 30 %. Laver les échantillons d’eau déionisée 2 fois pendant 5 min chaque. Cette étape n’est pas effectuée pour les tissus fin.
    4. Ajouter la solution d’alizarine (partie B: 0,5 % solution d’alizarine S poudre, glycérol à 10 % dans l’eau désionisée) et les échantillons de roche durant l’incubation à l’arrivée de la RT. pour coloration après 1, 2, 4 h ou une nuit.
    5. Pour effacer les échantillons les traitent avec une série de hydroxyde : glycérol de potassium 1 % décroissant (3:1 nuit, 1:1 nuit, 1:3 nuitées).
    6. Stocker les échantillons dans une solution de 1:1 d’hydroxyde de potassium 0,1 % : 80 % de glycérol et fixez-les avec 80 % de glycérol pour l’imagerie.
      Remarque : Pour les combinés Alcian bleu/alizarine coloration des échantillons de régal avec Alcian bleu coloration solution (partie A: bleu Alcian final 0,02 %, de 50 mM MgCl2, éthanol à 70 %) après réhydratation (section 5.2.2) pendant 2 h à ailettes RT. Treat avec une série décroissante de l’éthanol dans 50 mM MgCl2 (70 %, 50 %, 30 %, chaque 1 x 15 min) et laver leur pendant au moins 1 h (3 x 20 min) dans l’eau désionisée. Aller de l’avant avec le rouge d’alizarine coloration (section 5.2).
  3. Techniques de coloration II (coloration de calcéine) des os
    Remarque : Pour détecter le dépôt de calcium dans les nageoires fractures et blessures du crâne, les poissons vivants sont incubés dans calcéine contenant une solution.
    1. Préparer la quantité nécessaire de calcéine de 0,2 % dans l’eau désionisée (pH 7.5). Assurez-vous que le pH est neutre. 1 NaOH M permet d’ajuster le pH.
    2. Incuber jusqu'à 3 poisson zèbre simultanément dans 100 mL de solution de calcéine pendant 20 min dans un bécher en verre recouvert de papier d’aluminium.
    3. Transférer le poisson-zèbre dans un bécher avec de l’eau de poissons. Qu’ils nagent brièvement avant de les transférer dans un bécher de nouveau avec de l’eau de poissons. Qu’ils nagent dans ce bécher de nouveau pendant 20 min à laver. Prendre des photos (voir la section 5.4).
  4. Vivre d’imagerie du poisson-zèbre
    1. Cette approche permet d’acquérir des images de régénérer des tissus osseux tels que dans la fin ou le crâne tout au long de l’expérience sans pour autant sacrifier le poisson-zèbre. Anesthésier le poisson-zèbre conformément au point 2.1.
    2. Pour acquérir des images de nageoire régénère, transférer le poisson-zèbre anesthésié sur un plat de Pétri d’agarose-enduit (voir la section 2.2.1 et Figure 1 b).
    3. Pour acquérir des images de la régénération des os du crâne, placez le poisson-zèbre debout dans une éponge (Figure 1) ou placez-le dans un plat recouvert d’agarose qui a été préparé pour tenir le tronc du poisson-zèbre.
    4. Acquisition d’images à l’agrandissement désiré et la résolution en utilisant une configuration des.
    5. Retourner le poisson-zèbre à un conteneur avec frais ou un médicament contenant de l’eau des poissons.

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Representative Results

Le protocole présenté ici a été utilisé à plusieurs reprises pour induire la formation osseuse rapide au cours de la régénération du poisson-zèbre nageoire et crâne10,11,16. En combinaison avec la méthode présentée de l’administration de prednisolone, études sur les effets de la prednisolone pendant la régénération osseuse peuvent être poursuivis. Par exemple, les études sur la formation osseuse et la minéralisation dans la régénération peuvent être effectuées. Prednisolone, comme autres glucocorticoïdes19,20, conduit à une inhibition globale de régénération de nageoire, y compris la formation osseuse, tel que détecté par alizarine coloration sur fixe tissu (Figure 3 a) de la nageoire caudale. De même, la prednisolone a un effet retardateur sur fermeture de blessure de crâne (substance), qui peut être illustré par alizarine (Figure 3 b) ou en vivo calcéine coloration. En outre, prednisolone exerce un profond effet anti-inflammatoire en tissu fin et le crâne, en déclenchant l’apoptose dans la lignée des monocytes/macrophages. Macrophage réduite numéros peuvent être détectées par immunohistochimie sur des tissus congelés des sections, par exemple, en utilisant un anticorps anti-mcherry dans transgénique mpeg1: mCherry poisson-zèbre (Figure 3)10,21 . De même, le nombre, la distribution, la prolifération et l’apoptose des autres types de cellules d’intérêt aussi bien dans l’exo - et l’endosquelette (par exemple, les vertèbres) peut être analysés à l’aide d’immunohistochimie.

Figure 1
Figure 1 : Procédures menées chez le poisson zèbre. (A) la résection de la nageoire caudale (amputation) chez le poisson zèbre anesthésié à l’aide d’un scalpel. La ligne pointillée rouge indique le niveau d’amputation. (B) Fin ray fracture chez le poisson zèbre anesthésié, réalisée avec une aiguille d’injection sous le stéréomicroscope. Le poisson est posé sur un plat de Pétri d’agarose-enduit au cours de la procédure. Plats de Pétri recouvertes d’agarose servent également d’acquérir des images des nageoires du poisson-zèbre pendant la régénération ou la réparation de la fracture. (C) trépanation de la cranienne (blessure du crâne) effectuée chez le poisson zèbre anaestetized à l’aide d’un microforages sous le stéréomicroscope. (D) Image acquisition de régénération osseuse du crâne après une blessure. Le poisson-zèbre anesthésié est placé verticalement dans une éponge, et les images sont acquises à l’aide d’un stéréomicroscope. La boîte de Pétri est rempli d’eau de poissons contenant 0,02 % MS-222. Incubation (E) de poisson-zèbre en prednisolone ou le DMSO contenant des poissons d’eau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visualisation en direct microscopique des lésions à 0 h post blessures hpi). (A) Amputated nageoire caudale. Echelle = 200 µm. (B) fracture de la nageoire. La rupture est indiquée par la flèche rouge. Echelle = 100 µm. (C) trephining crâne. Le site de la lésion est indiqué par la flèche blanche. Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les résultats représentatifs du traitement de la prednisolone chez le poisson zèbre adulte. (A) alizarine rouge nageoires colorées se régénère à 14 jours post amputation (dpa) et des jours de traitement (dt). Prednisolone nageoire traitée régénère sont plus court (non illustré) et un plus petit domaine de rouge d’alizarine matrice osseuse positive est détectée. Echelle = 500 µm. (B) d’alizarine teinté crânes à 7 jours après lésion (dpi) et dt. Echelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié avec la permission de10. (C) Cryosection Découvre du crâne blessé et tissu (prednisolone) traitée et non traitée (DMSO) Tg cérébral (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: vertu) poissons transgéniques journaliste, dans laquelle les macrophages (cellules immunitaires innées) sont marquées en rouge 21 et os formant les ostéoblastes sont marquées en vert22. Le nombre de macrophages diminue significativement chez le poisson zèbre prednisolone traité. L’immunohistochimie a été réalisée comme décrit dans Geurtzen et al. 10. les noyaux sont marquées en bleu (DAPI). Echelle = 20 µm. BF : champ lumineux, epid : épiderme, bn : OS. Ce chiffre a été modifié avec la permission de10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Poisson zèbre sont avérés utiles pour la recherche squelettique à bien des égards. Des mutants sélectionnés reproduisent les aspects des maladies humaines telles que l’ostéogenèse imparfaite ou arthrose23,24,25,26,27, et des larves ainsi que des échelles sont utilisées pour identifier les composés anabolisants osseux en petites molécules écrans7,28,29. Traitements du poisson-zèbre avec des médicaments qui sont appliquées dans la pratique clinique sont en outre idéales pour étudier les effets indésirables présumés, par exemple dans le tissu osseux. Dans ce contexte, la présence de régénérer rapidement des os est avantageuse pour étudier les mécanismes sous-jacents des carences osseuse induite par le médicament. Nous présentons ici un protocole dans lequel traitement de la toxicomanie avec le prednisolone glucocorticoïde, un anti-inflammatoire stéroïdien couramment utilisé avec des effets indésirables dans le tissu osseux, est combiné avec les régimes de régénération osseuse adulte. Ce protocole a été utilisé avec succès pour induire des immunosuppresseurs et os des effets inhibiteurs en tissus régénérables de poisson-zèbre et peut également être adapté pour les études sur l’impact de la prednisolone et d’autres drogues dans les tissus adultes comme la colonne vertébrale. Les détails suivants devraient être tenus compte, lorsque les traitements immunosuppresseur sont réalisés en poisson zèbre nageoire en cours ou régénération du crâne.

Reproductibilité des essais de blessures

Pendant la régénération de la nageoire, vitesse de régénération (c.-à-d., la repousse des tissus fin, y compris les os, par unité de temps) dépend fortement de la quantité de tissu fin qui est réséquée13. Afin d’éviter la variabilité non désirée de la régénération de la nageoire, veillez à toujours résection des quantités équivalentes de tissu fin de tous les spécimens.

Exécution des nageoires osseuses ray fractures s’effectue en poussant légèrement une aiguille d’injection vers le centre d’un segment de ray choisi nageoires osseuses. Comme les rayons osseux se composent de 2 s’opposer à hemirays, la quantité de pression utilisée détermine si seulement un ou deux hemirays sont fracturés. Nous préférons appliquer basse pression pour fracturer un seul hemiray, parce que la rupture de deux hemirays tend à déstabiliser la nageoire, qui par conséquent peut se détacher pendant les jours suivants.

Calvarial blessures du crâne par Micro perçage doivent être effectuées avec prudence. Si les dommages causés au cerveau (c'est-à-dire le cervelet) postural et de locomotion déficits seront apercevra Nage erratique de l’échantillon des15. Poisson zèbre avec Lésion cérébelleuse peut-être présenter des réactions indésirables aux traitements médicamenteux et ne doit pas être utilisé pour étudier la régénération osseuse.

Considérations concernant les traitements médicamenteux

Pour produire un effet immunosuppresseur et anti-régénératif constant chez le poisson zèbre adulte, nous employons une dose de 50 prednisolone µM dans l’eau du poisson. Nous avons identifié cette dose au cours d’expériences de la première dose-réponse chez le poisson zèbre larvaire et adulte. Ainsi, des expériences de relation dose-effet effectuer pour identifier la dose nécessaire d’autres agents immunosuppresseurs qui pourraient s’appliquer. Pour les adultes, nous vous recommandons combinant ces premières expériences avec le régime de régénération d’aileron, nageoire longueur régénérer est une lecture très sensible et facile à détecter des altérations tissulaires.

Un traitement immunosuppresseur prédispose les échantillons traités aux infections microbiennes. Par conséquent, seul boîtier en autoclave béchers contenant de l’eau de poissons stérilisés à l’autoclave est important. Bien que ces conditions sont plus difficiles à réaliser et ne sont pas stériles, ils aident à réduire l’infection chez le poisson zèbre traitée. Nous ne pas un prétraitement (« stériliser ») oeufs d’Artemia. Cependant, cela pourrait être une mesure supplémentaire visant à prévenir l’infection chez le poisson zèbre, si nécessaire. En outre, des substances antiseptiques comme le bleu de méthylène (1 %) peuvent être ajoutés pour pêcher l’eau avant utilisation.

Expériences avec prednisolone, tant à court et à long terme, nécessitent des variations quotidiennes de poissons d’eau. Nous avons traité le poisson-zèbre adulte jusqu'à 8 semaines. Traitement d’un grand nombre d’individus pour une si longue période peut conduire à une certaine expérimentation « charge » et devrait être planifiée avec soin. Il est crucial d’avoir toujours les montants requis de poissons autoclavés eau et verre ware prêt. Bien que cela n’a pas été testé chez le poisson zèbre (à notre connaissance), implantation de libération lente des granulés pour des médicaments d’intérêt peut représenter une alternative intéressante pour l’exposition au médicament à long terme chez le poisson zèbre.

Analyses chez le poisson zèbre transgénique

Nous présentons ici les 2 méthodes sur la tache pour la minéralisation/calcification des tissus osseux par alizarine et coloration de calcéine. En outre, nous montrons comment image régénérant nageoire et crâne tissu in vivo à l’aide d’un stéréomicroscope. Cette dernière technique est très utile, si zebrafish transgénique rapports le nombre ou l’activité des cellules sélectionnées, telles que les ostéoblastes ou des cellules immunitaires, est actuellement imagé. Par exemple, avant de sacrifier des blessés et imprégnées de prednisolone zebrafish pour effectuer la coloration de la solution d’alizarine, nageoire régénère ou trephining crânes en cours de réparation peuvent être photographiés pour chercher la présence, la nombre et l’activité des os formant des ostéoblastes en la ligne de journaliste transgénique Tg (osterix: vertu)22. De même, refermer les plaies épidermique, qui survient moins d’une journée, peut être visualisée dans des poissons transgéniques, qui expriment un fluorophore dans les tissus épidermiques. Aussi, accumulation de cellules immunitaires à l’endroit de la blessure (ou leur absence chez les personnes traitée de prednisolone) peut être contrôlée facilement avec un stéréomicroscope équipé de la source lumineuse requise et les filtres.

En somme, le protocole présenté ici peut être utilisé pour étudier les effets des agents immunosuppresseurs et d’autres drogues après administration systémique chez le poisson zèbre qui subissent la régénération osseuse dans la nageoire ou le crâne. Cela vous sera utile pour délimiter la pathogenèse du SCAD et d’étudier les mécanismes qui sous-tendent la régénération osseuse réussie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par une subvention de la centre de régénérative thérapies Dresde (« poisson-zèbre comme un modèle à élucider les mécanismes de la perte osseuse induite par les glucocorticoïdes ») et, en outre, grâce à une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projet 387653785) au FK. Nous sommes très reconnaissants à Jan Kaslin et Avinash Chekuru pour leurs conseils et leur aide sur l’exécution de trépanation du cranienne et fractures dans les rayons des nageoires osseuses. Des expériences ont été conçus, effectués et analysés par KG et FK. FK a écrit le manuscrit. Nous tenons également à remercier Katrin Lambert, Nicole Cudak et autres membres des laboratoires Knopf et marque pour une assistance technique et de la discussion. Notre gratitude va également Marika Fischer et Jitka Michling pour soins excellents poissons et Henriette Knopf et Josh Currie pour la relecture du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

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References

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Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux
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Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

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