Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.

Abstract

דג זברה מסוגלים להתחדש איברים שונים, כולל תוספות (סנפיר) לאחר קטיעה. פעולה זו כרוכה לרגנרציה של העצם, אשר מתחדש בערך שבועיים לאחר פציעה. יתר על כן, דג זברה מסוגלים לרפא עצם במהירות לאחר trepanation של הגולגולת, ותיקון שברים זה יכול להיות בקלות מוחדרים קרני גרמית סנפיר דג זברה. מבחני פציעה אלה מייצגים פרדיגמות ניסיוני האפשריים כדי לבחון את ההשפעה של תרופות מנוהלת על במהירות ויוצרים העצם. כאן נתאר את השימוש של מודלים אלה פציעה 3 ואת שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול מערכתי glucocorticoid, אשר מפעילה עצם מעכבות ואפקטים לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים זרימת עבודה כיצד להתכונן לטיפול לדיכוי המערכת החיסונית דג זברה למבוגרים, להמחיש כיצד לבצע קטיעה פין, trepanation של calvarial עצמות, שברים סנפיר, ולתאר כיצד השימוש glucocorticoids משפיעה על שני יוצרי העצם תאי העצם, תאי של שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג כחלק מולדת חסינות רקמת העצם.

Introduction

דג זברה מייצגים במודל בעלי חיים רב עוצמה ללמוד פיתוח חוליות ומחלות. זה בשל העובדה כי הם חיות קטנות זה מתרבים טוב מאוד, כי הגנום שלהם הוא מלא ברצף, לבצע מניפולציה1. יתרונות נוספים כוללים את האפשרות לבצע הדמיה חיה המשך בשלבים שונים, לרבות ויוו הדמיה של דג זברה בוגרת2והיכולת לבצע תפוקה גבוהה סמים מסכי דג זברה הזחלים3. בנוסף, דג זברה בעלי קיבולת גבוהה משובי במגוון של איברים ורקמות כולל העצם, ובכך לשמש מערכת שימושי כדי ללמוד מחלת השלד ותיקון4,5.

אוסטאופורוזיס glucocorticoid-induced (ג'יו) היא מחלה הנובעת טיפול לטווח ארוך עם glucocorticoids, למשל במהלך טיפול מחלות אוטואימוניות כגון אסטמה או דלקת מפרקים שגרונית. ג'יו מתפתח אצל כ- 30% מהחולים שטופלו glucocorticoid ומייצגת בעיה בריאות ור6; לכן, חשוב לחקור את ההשפעה של החיסוני על רקמת העצם בפירוט רב. בשנים האחרונות פותחו מגוון דגמים דג זברה העוסקים בפתוגנזה של ג'יו. איבוד העצם בתיווך glucocorticoid יש כבר המושרה בדג זברה הזחלים, לדוגמה, אשר הובילה הזיהוי של תרכובות counteractive הגדלת מסת העצם אצל סמים מסך7. יתר על כן, עצם המושרה glucocorticoid מעכבות ההשפעות יש כבר חיקה של דג זברה מאזני גם במבחנה וגם ויוו8,9. מבחני אלה הם מאוד משכנע גישות, במיוחד כשמדובר הזיהוי של הרומן סמים אנבוליים לדיכוי המערכת החיסונית ועצמות. עם זאת, הם רק בחלקו לקחת בחשבון את השלד, לא בוצעו בהקשר משובי. לפיכך, הם אינם מאפשרים את חקירת glucocorticoid בתיווך ההשפעות במהלך מהיר מצבים של היווצרות העצם למבוגרים, משובי.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקרים ללמוד glucocorticoid בתיווך ההשפעות על עצמות דג זברה מבוגרים שעברו התחדשות. פציעה מודלים כוללים קטיעה חלקית של סנפיר דג זברה סימטרית, trepanation של הגולגולת, כמו גם היצירה של פין ריי שברים (איור 1Aג-1), בשילוב עם חשיפה הדגירה ויה glucocorticoid (איור 1E ). השתמשנו לאחרונה חלק של פרוטוקול זה כדי לתאר את ההשלכות של חשיפה prednisolone, אחת התרופות הסטרואידים שנקבע בדרך כלל, על דג זברה בוגרת התחדשות העצם סנפיר והגולגולת10. דג זברה, מוביל מינהל prednisolone אוסטאובלסט ירד התפשטות, בידול אוסטאובלסט לא שלם של אינדוקציה מהירה של אפופטוזיס שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג10. ב פרוטוקול זה, גם נתאר כמה שברים יכול להיות מוחדרים יחידה פין גרמית ריי מקטעי11, כמו גישה זו עשויה להיות שימושית כאשר לומדים בתיווך glucocorticoid השפעות על עצם המתרחשים במהלך תיקון שבר. השיטות המובאות כאן יסייע לכתובת נוספות שבבסיס מנגנוני הפעולה glucocorticoid במהירות התחדשות העצם, עשוי גם להיות מועסק בהגדרות אחרות של ניהול סמים מערכתית בהקשר של התחדשות רקמות דג זברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי דרזדן Landesdirektion (היתר מספרים: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. הכנת חומרים ופתרונות

הערה: Prednisolone, כמו אחרים glucocorticoids, מוביל החיסוני. לפיכך, אמצעי זהירות חייב להילקח כדי למנוע זיהום אצל מטופלים בעלי חיים במהלך הניסוי. כדי הזה סוף, כלי זכוכית אוטוקלב "הדג, מים (דהיינו, המים המשמשים אחורי דג זברה בוגרת) לפני תחילת הניסוי.

  1. לחשב את המספר של דג זברה כדי לשמש את הניסוי. הקפד לכלול אנשים לשמש כפקדי.
  2. אוטוקלב 600 מ ל זכוכית מכוסים ברדיד אלומיניום עם קלטת אוטוקלב. לא נפגעתי דג זברה יטופלו בנפרד, ובכך כוס זכוכית 1 נדרש לכל דג זברה.
  3. לחשב את כמות המים דגים לצורך הניסוי. 300 מ ל נדרשים לכל יום לכל אדם. קח בחשבון את אורך הניסוי (למשל, שבוע 1/7 ימים).
  4. מילוי בקבוקי זכוכית עם מים, לסגור אותם ואת אוטוקלב את הבקבוקים עם קלטת אוטוקלב. באופן אידיאלי, להשתמש 2 L בקבוקים, אך בקבוקים אחרים כמו 1 L או 5 L יכול לשמש גם כן.
    הערה: אם הניסויים ארוכות (למשל, 4 שבועות/28 ימים) הסכום של בקבוקי זכוכית הוא מוגבל, הקפד להכין בקבוקים למשך תקופה מינימלית של מספר ימים בכל פעם, חזור על התהליך (1.3 ל 1.4) לאורך כל הניסוי.
  5. להכין פתרון prednisolone מניות של prednisolone סטרילי-מסוננים 100 מ מ ב- dimethylsulfoxide (דימתיל סולפוקסיד). להקפיא את המניה מ ל 1 או 2 מ"ל microcentrifuge רכבת תחתית aliquots.
    התראה: תמיד ללבוש ביגוד כאשר עובדים עם prednisolone (כפפות מגן, בטיחות משקפי מגן, חלוק המעבדה).
  6. ביום הראשון של הניסוי, להכין הדגירה פתרונות ועם prednisolone דימתיל סולפוקסיד, בהתאמה. לשם כך, להפשיר את הכמות הנדרשת של 100 מ מ prednisolone פתרון מניות ולהוסיף prednisolone בלוק דגים מים על ריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
    1. עבור הטיפולים שליטה, להוסיף נפח המתאימים של דימתיל סולפוקסיד בלוק דגים מים. לדוגמה, כדי לייצר 2 ל' prednisolone המכיל מים, להוסיף 1 מ"ל של מניות prednisolone 100 מ מ 2 ל' מים. עוד 2 ל' בקבוק מים, להוסיף 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד, בהתאמה.
    2. לעבוד במקום מתאים המיועד לביצוע טיפולים תרופות, ממוקם באופן אידיאלי בחדר ב- 27 ° C.

2. דור של פציעות סנפירים דג זברה

הערה: לפגוע עצם של דג זברה, וסנפירים, לבצע כריתה של הפרק (קטיעה, בדרך כלל על הפרק סימטרית) או שבר סנפיר גרמית בודדים קרני (מודל שבר). למטרה זו להרדים דג זברה בוגרת קודם.

  1. קטיעה
    1. כדי להרדים דג זברה למבוגרים, להכין קוטר 100 מ מ פטרי המכילות 0.02% MS-222 (אתיל-3-aminobenzoate methanesulfonate) במים דגים (המים לא צריך להיות בלוק).
      1. העברת דג זברה אחת בכל פעם כדי MS-222 המכיל הפטרי באמצעות דג נטו, דגירה זה עד שוכב על צידו ללא תנועה אינו מגיב למגע. מבחן האחרון על-ידי נגיעה הפרק אנאלי עם מלקחיים בוטה.
      2. המתן עד 4 של הרדמה לרמת וזו הרמה המתאימה עבור פין כריתה12. בשלב זה, הקצב של התנועה opercular הוא ירד, טונוס שרירים אובד, הדגים לא זזה על מגע12.
    2. לקחת מלקחיים בוטה ולהעביר את דג זברה anaesthetized בזהירות מכסה נראה 100 מ מ פטרי. מקם את דג זברה על הצד הלטראלי. ודא את דג זברה נעוץ תמיד באותו הכיוון, כך למשל בצד הגוף הנכון שלהם. עם איזמל או סכין גילוח, נכרות 50% של הפרק (איור 1A, 2A).
      הערה: המהירות של חידוש פין דג זברה תלוי בכמות רקמת סנפיר resected, קרי, הרקמה פין נוסף הוא resected, מהר יותר הסנפיר מחדש את13. לפיכך, כדי לצמצם בווריאציות חידוש פין הקפד תמיד נכרות את הסנפיר באותה רמה של כל דג זברה.
    3. להעביר את הפצועים דג זברה כוס זכוכית בלוק המכיל 300 מיליליטר prednisolone או דימתיל סולפוקסיד המכיל מים דגים בלוק. מכסים את כוס זכוכית ברדיד אלומיניום, כדי למנוע בריחה של דג זברה.
    4. חזור על שלבים 2.1.2 כדי 2.1.3 עד המספר הנדרש של דג זברה לניסוי.
  2. שבר פין
    1. הכן של מצופים agarose 100 מ מ פטרי באמצעות חימום פתרון agarose 2% דגים במים או E3 (העובר מדיה 3, 50 מ מ נתרן כלורי 0.17 מ מ אשלגן כלורי, 0.33 מ מ סידן כלורי, 0.33 מ מ מגנזיום גופרתי). שופכים בזהירות בערך 10-15 מ של הפתרון לתוך הפטרי. החלק התחתון של המנה שאמור להיות מכוסה לגמרי. תן את agarose לחזק.
    2. להרדים דג זברה כמתואר בסעיף 2.1.
    3. לקחת מלקחיים בוטה ולהעביר את דג זברה anaesthetized בקפידה מצופים agarose 100 מ מ פטרי. מקם את דג זברה על הצד הלטראלי. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, מורחים את הסנפיר סימטרית לחלוטין כדי להיות מסוגל לזהות קרני ברורים סנפיר הגרמי, פין ריי מקטעים. ודא את דג זברה נעוץ תמיד באותו הכיוון, כך למשל בצד הגוף הנכון שלהם.
    4. עם זריקה המחט (0.3 מ"מ x 13 מ"מ) להציג שבר במרכז של מקטע ריי הרזה פין (איור 1B). כדי לעשות זאת, המחט הוא נדחף מעט אל המקטע להופעת סדק (חץ ב איור 2B). בזמן לחץ עדין שמוביל שבר של אחת בלבד של שני hemirays נגדית חזקה יותר לחץ יוביל שבר של שני המקטעים hemiray.
      1. לא להציג שברים רבים מדי וסנפירים, מאז זה במידה רבה יפגום ביציבות של הסנפיר. כהצעה, להחיל שברים רק ב 3 עד 5 פין קרני.
      2. תמיד לייצר שברים בקטעים המתאימים מעבר קרני שונים סנפיר, דג זברה, לדוגמה ב קרני לסנפיר 3, 7 (או 8) וריי סנפיר הגחוני / 3. הרמה proximal דיסטלי של שבר אידיאלי-proximal נקודת נגע הסתעפות של קרני פין 113 קטעים.
    5. להעביר את הפצועים דג זברה כוס זכוכית בלוק המכיל 300 מיליליטר prednisolone או דימתיל סולפוקסיד המכיל מים דגים בלוק. מכסים את כוס זכוכית ברדיד אלומיניום, כדי למנוע בריחה של דג זברה.
    6. חזור על שלבים 2.2.2 כדי 2.2.5 עד המספר הנדרש של דג זברה לניסוי.

3. הדור של פציעות הגולגולת Calvarial (Trepanation)

הערה: calvariae של דג זברה הם הומולוגיים לעצמות calvarial אצל יונקים. לכן, אלה עצמות התקן חיצוני14 מייצגים רקמת עניין מיוחד כשלמדתי בפתוגנזה של ג'יו. לפצוע את הגולגולת, trepanation מתבצע על ידי קידוח חור Os frontale ו/או מערכת ההפעלה parietale (איור 1C, 2 C) עם עזרה microdrill11.

  1. להרדים את דג זברה לפי סעיף 2.1.
  2. החזק את דג זברה anesthetized זקופה עם מלקחיים, כך העצמות calvarial גלויים טוב תחת מיקרוסקופ לנתיחה מלמעלה (איור 1C).
  3. לאתר את microdrill סיבוב ב ממרכז העצם הקדמית (Os frontale) וגע העצם. החור המיוצר הוא בגודל של בר microdrill (500 מיקרומטר, איור 2C, דמות 3B).
    הערה: הקפד לא להעביר את microdrill רוחבית תוך הפקת הפגיעה. גם להפסיק מיד כאשר טיפות לפתע ההתנגדות של העצם. לא קודח כל עוד יותר, אחרת במוח יהיה פגום 15.
  4. להעביר את הפצועים דג זברה כלוב מלא דגים מים עד זה יחלים לגמרי מן ההרדמה. התבוננו בו בתשומת לב.
  5. להעביר את הפצועים דג זברה דגים מים בתוספת prednisolone או כוס זכוכית המכיל דימתיל סולפוקסיד.

4. טיפול של דג זברה במהלך הדגירה

הערה: במהלך היישום של prednisolone/דימתיל סולפוקסיד, הסם המכיל דגים מים צריך להשתנות מדי יום, דג זברה צריך להיות מוזן באופן קבוע.

  1. שינויים מים
    1. כדי להחליף את המים דגים, הפשרת 100 מ מ prednisolone במלאי ולהכין הכמות הנדרשת של 50 מיקרומטר prednisolone בדגים בלוק מים טריים מדי יום של תקופת הטיפול. להכין דימתיל סולפוקסיד המכיל מים דגים דג זברה שליטה בהתאם.
    2. לקחת גביע זכוכית המכיל דג housed יחיד בפתרון הדגירה שלו ולהעביר את הפתרון כולל את דג זברה לתוך מיכל מתאים, למשל כלוב דיור זמני.
      הערה: שימוש מיכלי ביניים נפרד prednisolone, דימתיל סולפוקסיד התנהגו דג זברה, בהתאמה, כדי לוודא דימתיל סולפוקסיד שליטה דג זברה אינם נחשפים prednisolone ולהיפך.
    3. למלא את כוס זכוכית עם סמים טריים המכילים דגים מים (300 מ ל).
    4. העבר את דג זברה מהגורם ביניים כשהספל זכוכית המכיל הדגירה טריים הפתרון באמצעות דג נטו. . להחזיר את רדיד האלומיניום כדי למנוע בריחה של דג זברה
    5. אם תקופת הניסוי עולה 2 שבועות, להחליף את ספלים מזכוכית.
  2. האכלה
    1. במהלך טיפולי קצר (עבור עד 2 ימים) לא להאכיל דג זברה. במהלך הניסויים יותר, להאכיל דג זברה. לקחת טיפול מיוחד כדי למנוע זיהום של הפתרון הדגירה. לפיכך, להאכיל עם ssp. Artemia באוכל בשבב אבן, ולא רק ביום השני בכל.
      הערה: Artemia נעשה באופן קבוע כדי להאכיל דג זברה צעיר, צריך להיות זמין בתוך היחידה haltering דג זברה.
      1. בערך שעתיים לפני החלפת המים דגים, להאכיל דג זברה עם Artemia ssp ב שלהם ספלים מזכוכית. לשם כך, השתמש פיפטה פלסטיק ולהאכיל 0.5-1 מ ל המקווקו Artemia פתרון לכל כוס זכוכית.
      2. לחכות 2 h ולהחליף את הפתרון הדגירה בתרופה טריים המכילים דגים מים לפי סעיף 4.1.

5. ניתוח של דגימות

הערה: לאחר דגירה של דג זברה פצוע prednisolone, דימתיל סולפוקסיד המכיל דגים מים, בהתאמה, או לבצע ניתוח מינרליזציה/הסתיידות עצם (5.1 כדי 5.3) או לבצע הדמיה חיה של דג זברה תחת המיקרוסקופ לנתיחה (5.4) 10,11,16. להשתמש הדמיה חיה כדי לקבוע את אורך צור סנפיר וכדי לזהות הבדלים בביטוי הגנים כתב דג זברה מהונדס.

  1. קיבוע של רקמות עניין
    1. עבור קיבעון של סנפירים ו/או גולגלות להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS, להקפיא ב-20 ° C עבור אחסון. שימוש להתמחויות 4% PFA PBS או להפשיר הכמות הנדרשת לפני השימוש. לחלופין, 2% מחברים ב- PBS יכול לשמש.
      התראה: PFA רעיל ויש לטפל בזהירות תחת ברדס fume. ללבוש ביגוד מגן.
    2. עבור קיבעון של סנפירים להכין צלחת פטרי קטן (למשל, 30 מ מ) עם 4% קר מחברים ב- PBS לוודא כי בתחתית קערה מכוסה במלואה. עבור קיבעון של גולגלות, להכין צנצנת זכוכית קטנה עם מכסה או צינור עם 4% קר מחברים ב- PBS.
      התראה: ידית PFA המכיל פתרונות רק מתחת למכסה המנוע fume כפי שהוא רעיל. ללבוש ביגוד מגן.
    3. הקציר הרקמה של ריבית.
      1. למסוק התחדשות רקמות פין או הסנפירים עם שברים להרדים את דג זברה לפי סעיף 2.1 או המתת חסד של דג זברה לפי סעיף 5.1.5.
      2. להעביר את דג זברה anaesthetized המכסה של צלחת פטרי. באמצעות אזמל או גילוח, קציר את פין להתחדש. הקפד לכלול הגדם רקמות רגנרציה סנפירים כדי להקל על הטיפול של הרקמה שנקטפו.
    4. לתקן סנפירים שטוח כדורגלן המכיל פטרי ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קיבוע שטוח מונע התכרבלות של הרקמה סנפיר במהלך קיבעון.
      1. כדי לתקן שטוח, לתפוס את הרקמה סנפיר עם מלקחיים בסדר אחד בקצה הגבי או הגחון של הגדם, לטבול אותו בפתרון קיבעון. לתפוס את הקצה השני של הגדם עם מלקחיים בסדר השני ומדכאים מעט את הרקמה אל החלק התחתון של המנה.
      2. המתן 10 עד 20 s לפני שחרור. הרקמה סנפיר צריך לא להתכרבל יותר. אם כן, חזור.
    5. המתת חסד דג זברה כדי למסוק רקמות הגולגולת פצועים. להכין צלחת פטרי המכילות 0.1% קוטר 100 מ מ MS-222 במים דגים. העברה דג זברה אחת בכל פעם MS-222 המכיל הפטרי באמצעות רשת דיג. כאשר מגיעים לרמה 6 של הרדמה (כווץ מדולרי) לחכות לפחות 10 דקות כדי להבטיח מוות הדגימה12.
    6. באמצעות אזמל לחתוך את הראש פלוס הרקמה תא המטען קטן משאר חלקי הגוף. לטבול את הרקמה שנקטפו בפתרון PFA 4% מוכן צנצנת זכוכית או צינור פלסטיק. תיקון עבור 24 שעות ב 4 ° C עם נדנדה עדין.
    7. לאחסון לטווח ארוך לאחר קיבוע דגימות, לשטוף אותם עם PBS (3 x 20 דקות ב RT) ולהתייחס מתנול-בסדרת הגוברת מתנול (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, מתנול 2 x 100% ב- PBS למשך 20 דקות כל אחד).
      1. לאחסן אותם 100% מתנול ב-20 ° C. אחרת, ישירות להמשיך עם עצם להכתים או ניתוחים אחרים אחרי כביסה עם PBS.
  2. עצם מכתים טכניקות אני (צביעת alizarin אדום)
    הערה: זה מכתים מתבצע על פי ואן Eeden. ואח 199617 ו ווקר & 2007 קימל18 עם שינויים.
    1. כדי לבצע alizarin אדום מכתים סנפירים למבוגרים או גולגלות, לקצור ולתקן רקמות כמתואר בסעיפים 5.1.
    2. אם הדגימות אוחסנו מתנול ב-20 ° C, נתרענן דגימות בעשותם סדרות מתנול ההופכי (70%, 50% ו- 30% ב- PBS, כל 1 x 20 דקות), לשטוף פעמיים 20 דקות עם PBS. רחץ הדוגמאות עבור 5 דקות מינימום עם מים יונים.
    3. לעשות alizarin אדום מכתים ב גולגלות, מתייחסים דגימות עם 50 מ"ג/מ"ל טריפסין ב 30% רווי נה2B4O7 בטמפרטורת החדר למשך הלילה. דגימות רוק במהלך תקופה זו. שטיפה דגימות ב 30% רווי נה2B4O7 פתרון. רחץ דגימות עם יונים מים פי 2 עבור 5 דקות כל אחד. שלב זה מבוצע לא עבור פין רקמות.
    4. להוסיף פתרון alizarin אדום (חלק ב': 0.5% alizarin אדום S אבקת, 10% גליצרול במים יונים), אבן הדגימות במהלך הדגירה הצ'ק RT. מכתים לאחר 1, 2, 4 שעות או לילה.
    5. כדי לנקות את דגימות להתייחס אליהם עם הפחתת 1% אשלגן הידרוקסידי: גליצרול סדרה (3:1 בין לילה, 1:1 בין לילה, לילה 1:3).
    6. לאחסן את הדגימות פתרון 1:1 של 0.1% אשלגן הידרוקסידי: 80% גליצרול והר אותם עם 80% גליצרול עבור הדמיה.
      הערה: עבור בשילוב Alcian כחול/alizarin אדום מכתים דגימות פינוק עם Alcian כחול מכתים פתרון (חלק א: הסופי 0.02% Alcian כחול, 50 מ מ MgCl2, 70% אתנול) לאחר התייבשות (סעיף 5.2.2) עבור 2 h-סנפירים RT. פינוק עם סדרה יורדת אתנול 50 מ מ MgCl2 (70%, 50%, 30%, כל מין 1 x 15), לשטוף אותם למשך תקופה מינימלית של 1 ש ח (3 x 20 דקות) בחודש יונים מים. להמשיך עם אדום alizarin מכתים (סעיף 5.2).
  3. עצם טכניקות צביעת II (צביעת calcein)
    הערה: לזהות סידן התצהיר סנפיר שברים ופגיעות הגולגולת, חי דג מודגרת ב calcein המכיל פתרון.
    1. להכין את הכמות הנדרשת של 0.2% calcein במים יונים (pH 7.5). ודא כי ה-pH הוא נייטרלי. השתמש 1 M NaOH כדי להתאים את ה-pH.
    2. דגירה עד 3 דג זברה בו-זמנית ב- 100 מ של calcein פתרון עבור 20 דקות בתוך זכוכית מכוסה ברדיד אלומיניום.
    3. להעביר את דג זברה גביע עם דגים מים. לתת להם לשחות בקצרה לפני העברת אותם גביע חדש עם דגים מים. לתת להם לשחות בתוך זה חדש עבור 20 דקות לשטוף. צלם תמונות (ראו סעיף 5.4).
  4. חיים הדמיה של דג זברה
    1. השתמש בגישה זו כדי לרכוש תמונות של רגנרציה רקמת העצם כמו פין או הגולגולת לאורך כל הניסוי מבלי להקריב את דג זברה. להרדים את דג זברה לפי סעיף 2.1.
    2. כדי לרכוש תמונות של התחדשות סנפיר, להעביר את דג זברה anaesthetized על גבי צלחת פטרי מצופים agarose (ראו סעיף 2.2.1, איור 1B).
    3. לרכוש תמונות של רגנרציה עצמות הגולגולת, למקם את דג זברה זקוף ב ספוג (איור 1D) או מניחים אותה צלחת מצופים agarose זה הוכן להחזיק את המטען של דג זברה.
    4. לרכוש תמונות-ההגדלה הרצויה ואת הרזולוציה באמצעות מלכודת stereomicroscopic.
    5. להחזיר את דג זברה מיכל טריים או תרופות המכילות דגים מים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול המובאת כאן שימש שוב ושוב כדי לעודד היווצרות העצם מהיר במהלך התחדשות של ה דג זברה סנפיר והגולגולת10,11,16. בשילוב עם שיטת הציג prednisolone המינהל, מחקרים על ההשפעות של prednisolone במהלך התחדשות העצם יכול להיות נרדף. לדוגמה, ניתן לבצע מחקרים על היווצרות העצם ואת מינרליזציה ב להתחדש. נגד, כמו אחרים19,glucocorticoids20, מוביל עיכוב הכוללת של חידוש פין, כולל עצם היווצרות, כפי שזוהו על-ידי alizarin אדום מכתים על קבוע סנפיר סימטרית רקמות (איור 3 א). באופן דומה, prednisolone השפעה עיכוב על הסגר פציעה בגולגולת (calvarial), אשר ניתן לתיאור על ידי alizarin אדום (איור 3B) או ויוו calcein מכתים. בנוסף, prednisolone מפעילה בעלת השפעה אנטי דלקתית ברקמה פין וגם הגולגולת, על ידי אפופטוזיס בשושלת מונוציט/מקרופאג מפעילה. מקרופאג מופחתת מספרים ניתן להבחין אימונוהיסטוכימיה על רקמות קפוא סעיפים, למשל, באמצעות נוגדן anti-mcherry ב הטרנסגניים mpeg1: mCherry דג זברה (איור 3C)10,21 . באופן דומה, המספר, הפצה, הפצה ואת אפופטוזיס של סוגי תאים אחרים עניין גם ב ה exo - ולא את השלד (למשל, חוליות) יכול להיות מנותח בעזרת אימונוהיסטוכימיה.

Figure 1
איור 1 : נהלים, שנעשית תוך דג זברה. (א) כריתה של הסנפיר סימטרית (קטיעה) בדג זברה מרדימים בעזרת אזמל. קו מקווקו אדום מציין את רמת קטיעה. (B) סנפיר ריי שבר בדג זברה מרדימים מתבצעת עם מחט הזרקה תחת stereomicroscope. הדג הוא הנחת צלחת פטרי מצופים agarose במהלך ההליך. מצופים Agarose פטרי משמשים גם כדי לרכוש תמונות של דג זברה, וסנפירים במהלך התחדשות או תיקון שבר. (ג) Trepanation של calvariae (פציעה בגולגולת) הופיעה anaestetized דג זברה עם העזרה של microdrill תחת stereomicroscope. (ד) תמונה רכישה של התחדשות העצם הגולגולת לאחר פציעה. דג זברה anaesthetized ממוקמת זקוף, ספוג, תמונות נרכש בסיוע stereomicroscope. הפטרי מלא במים דגים המכיל 0.02% MS-222. (E) דגירה של דג זברה prednisolone או דימתיל סולפוקסיד המכיל מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תצוגת live מיקרוסקופיים של פציעות-פגיעה מדד מחירי הבתים של 0 h פוסט)- (א) סנפיר סימטרית Amputated. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) Fractured פין ריי. השבר מציינים את החץ האדום. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) Trepanated הגולגולת. אתר הפציעה מציינים את ראש החץ הלבן. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : נציג תוצאות הטיפול prednisolone דג זברה בוגרת. Alizarin (א) אדום סנפיר מוכתם מחדש ב 14 ימים פוסט קטיעה (dpa) ו ימי טיפול (dt). סנפיר שטופלו prednisolone מחדש קצר יותר (לא מוצג), הינם תחום קטן יותר של אדום alizarin מטריצה חיובית עצם מזוהה. סרגל קנה מידה = 500 Alizarin אדום צבעונית גולגלות מיקרומטר. (B) ב 7 ימים שלאחר פגיעה (dpi) ו dt. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. איור זה השתנה עם הרשאה10. (ג) Cryosection תצוגה של הגולגולת שציווית ודימום במוח רקמות של המטופל (נגד), לא מטופל (דימתיל סולפוקסיד) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) כתב מהונדס דגים, שבו מקרופאגים (תאי חיסון מולדת) מסומנים באדום 21 ועצם יצירת תאי העצם מסומנות ירוק22. המספר של מקרופאגים טיפות באופן משמעותי בדג זברה prednisolone מטופלים. אימונוהיסטוכימיה בוצע כמתואר ב- geurtzen ב. et al. 10. הגרעינים מסומנות בכחול (דאפי). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. BF: שדה בהיר, epid: אפידרמיס, בסון: עצם. איור זה השתנה עם הרשאה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דג זברה הוכיחו מועיל במחקר שלד לגבי רבים. מוטציות שנבחר לחקות היבטים של מחלות אנושיות כגון פרכת או דלקת מפרקים ניוונית23,24,25,26,27, הזחלים, כמו גם סולמות משמשות כדי לזהות העצם תרכובות סטרואידים אנבוליים מולקולה קטנה מסכי7,28,29. הטיפולים של דג זברה עם סמים המוחלות הקלינית יתר על כן מתאימים באופן אידיאלי כדי לחקור תופעות לוואי בשם, לדוגמה ברקמת העצם. בהקשר זה, הנוכחות של במהירות התחדשות העצם יש יתרון לחקור את המנגנונים המשמשת כבסיס של עצם תרופות-induced ליקויים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו הטיפול בתרופה עם prednisolone glucocorticoid, תרופה אנטי דלקתית נפוץ עם תופעות לוואי רקמת העצם, בשילוב עם משטרים התחדשות העצם למבוגרים. פרוטוקול זה בהצלחה שימש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית ועצמות מעכבות ההשפעות ברקמות הרגנרציה של דג זברה, ניתן להתאים גם במחקרים על השפעת prednisolone וסמים אחרים ברקמת למבוגרים כגון עמוד השדרה. הפרטים הבאים צריכים להילקח בחשבון כאשר טיפולים תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מתבצעות הסנפיר עוברת דג זברה או התחדשות הגולגולת.

הפארמצבטית של מבחני פציעה

במהלך חידוש פין, התחדשות מהירות (קרי, לצמיחה מחודשת של רקמות סנפיר, כולל העצם, ליחידת זמן) תלויה מאוד כמות רקמת סנפיר שהייתה resected13. כדי להימנע השתנות בלתי רצויות של חידוש פין, הקפד תמיד נכרות כמויות שוות ערך של רקמות פין כל דגימות.

ביצוע של שברים ריי הרזה סנפיר מבוצע על ידי מעט לדחוף מחט הזריקה במרכז קטע ריי סנפיר גרמית שבחרת. כמו פין גרמית קרני מורכבת של 2 מתנגדים hemirays, מידת לחץ קובע אם רק אחת או את שתיהן hemirays שבורות. אנו מעדיפים ליישם לחץ נמוך להישבר hemiray אחד בלבד, בגלל שבר של שני hemirays נוטה לערער את ריי סנפיר, אשר כתוצאה מכך עלול לנתק במהלך ימים הבאים.

פציעות calvarial של הגולגולת מאת microdrilling צריכה להתבצע בזהירות. אם נזק זה אל המוח (קרי, המוח הקטן) וחוסר locomotory גירעונות תהפוך לכאורה על ידי שחייה יציב של הדגימה15. דג זברה עם פציעה אסטרוציטומה עשוי להציג תגובות שליליות הטיפול בתרופה, צריך לשמש כדי לחקור התחדשות העצם.

שיקולים לגבי טיפולים תרופות

כדי לייצר אפקט לדיכוי המערכת החיסונית ואת אנטי-ההתחדשות עקבי בדג זברה למבוגרים אנו מעסיקים מינון של 50 מיקרומטר prednisolone במים דגים. זיהינו מנה זו במהלך ניסויים מנה-תגובה ראשונית דג זברה זחל ומבוגרים. לפיכך, מנה-תגובה ניסויים צריכה להתבצע כדי לזהות את המינון הנדרש של סוכנים לדיכוי המערכת החיסונית אחרים זה יכול להיות מיושם. למבוגרים, מומלץ שילוב של הניסויים הראשונית עם המשטר חידוש פין, פין אורך צור הוא הבדיקה מאוד רגיש, קל לזהות בשביל לרקמות שינויים.

טיפול לדיכוי המערכת החיסונית predisposes דגימות שטופלו זיהומים חיידקים. לכן, דיור אחת בתוך בלוק בקבוקונים המכילים מים בלוק הוא חשוב. למרות תנאים אלה הם יותר מסורבלת לבצע ואינם סטרילי, הם עוזרים כדי למזער את הזיהום בדג זברה שטופלו. אנחנו לא pretreat ('לחטא") Artemia ביצים. עם זאת, זו יכולה להיות אמצעי נוסף כדי למנוע הידבקות ב דג זברה, במידת הצורך. יתר על כן, ניתן להוסיף חומרים חיטוי כגון מתילן כחול (1%) לדוג במים לפני השימוש.

ניסויים עם prednisolone, הקצר והן בטווח הארוך, דורשים משתנה מדי יום של דג מים. יש לנו מטופלים מבוגרים דג זברה עבור עד 8 שבועות. טיפול של מספר רב של אנשים כל כך הרבה זמן יכול להוביל מסוימים ניסיוני "נטל", צריך להיות מתוכנן בקפידה. . זה מכריע תמיד יש את הנדרש כמויות של דגים בלוק זכוכית ומים וואר מוכן. אמנם זה לא נבדק בדג זברה (לידע שלנו), השרשה של שחרור איטי כדורי סמים עניין עשוי לייצג חלופה יקר לטווח ארוך חשיפה לסמים בדג זברה.

ניתוחים בדג זברה מהונדס

כאן, אנו מציגים 2 שיטות כתם על מינרליזציה/הסתיידות רקמות העצם על ידי alizarin אדום calcein מכתים. בנוסף, נראה כיצד תמונה ההתחדשות סנפיר והגולגולת רקמות ויוו בסיוע stereomicroscope. השיטה השנייה היא מאוד שימושי, אם דג זברה מהונדס, מדווח המספר או פעילות של תאים נבחרים, כגון תאי העצם או תאים חיסוניים, הם להיות עם תמונה. לדוגמה, לפני הקרבת נפגע, שטופלו prednisolone דג זברה לבצע צביעת alizarin אדום, סנפיר מחדש או גולגלות trepanated שעברו תיקון יכול לצלמה לחפש את נוכחות, מספר ואת הפעילות של עצם יצירת תאי העצם ב הקו כתב מהונדס Tg (osterix: nGFP)22. כמו כן, ניתן לאבחן סגירת הפצע באפידרמיס, אשר מתרחשת תוך יום, בדגים מהונדס, המבטאות את fluorophore ברקמת אפידרמיס. כמו כן, הצטברות של תאים חיסוניים באתר של פגיעה (או שהיעדרותם אצל אנשים prednisolone מטופלים) ניתן לנטר בקלות עם stereomicroscope מצויד את מקור האור הנדרשת ומסננים.

לסיכום, פרוטוקול המובאת כאן יכול לשמש בו השפעות של תרופות אחרות וסוכנים לדיכוי המערכת החיסונית לאחר הממשל מערכתית דג זברה כי הם עוברים תהליך התחדשות העצם או פין או הגולגולת. זה יהיה שימושי כדי ניסחו בפתוגנזה של ג'יו וכדי לחקור את המנגנונים התחדשות העצם מוצלחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז של משובי טיפולים דרזדן ("דג זברה כמודל לפענח את המנגנונים של אובדן עצם המושרה glucocorticoid"), בנוסף על ידי מענק של פתוח (Transregio 67, פרויקט 387653785) כדי FK. אנחנו מאוד אסירי תודה. Jan Kaslin, Chekuru אווינאש עבור שלהם הדרכה וסיוע על ביצוע trepanation של calvariae, שברים סנפיר גרמית קרני הניסויים היו תוכנן, שבוצעה, נותחו על ידי ק ג, FK. FK כתב היד. כן נרצה להודות Katrin למברט, ניקול Cudak וחברים אחרים של מעבדות קנופף וברנד לקבלת סיוע טכני ודיון. תודתנו גם הולך אל פישר מריקה, Jitka Michling לטיפול דגים מעולה, הנרייטה קנופף, ג'וש קורי להגהת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 140 דג זברה עצם התחדשות פציעה פין הגולגולת Glucocorticoids Prednisolone
דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult… More

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter