Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Voksen sebrafisk skade modeller for å studere virkningene av prednisolon i å regenerere benvev

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

Her beskriver vi 3 voksne sebrafisk skader modeller og kombinert bruk med suppressive behandling. Vi gir veiledning på bildebehandling av regenererende vev og oppdage bein mineralisering der.

Abstract

Sebrafisk kan generere ulike organer, inkludert vedheng (svømmeføtter) etter amputasjon. Dette innebærer fornyelse av bein, som regrows omtrent to uker etter skader. Videre sebrafisk kan helbrede bein raskt etter trepanation av skallen, og reparere sprekker som lett kan bli introdusert i sebrafisk benete fin stråler. Disse skade analyser representerer mulig eksperimentelle paradigmer å teste effekten av administrert medikamenter på raskt danner bein. Her beskriver vi bruk av disse 3 skader modeller og deres kombinert bruk med systemisk glukokortikoid behandling, som utøver bein hemmende og suppressive effekter. Vi gir en arbeidsflyt på hvordan å forberede suppressive behandling i voksen sebrafisk, illustrerer utføre fin amputasjon, trepanation calvarial bein og fin frakturer, og beskriver hvordan bruk av glukokortikoider påvirker begge Ben danner osteoblasts og cellene i monocytt/macrophage linjen som en del av medfødt immunitet i benvev.

Introduction

Sebrafisk representerer en kraftig dyremodell virveldyrenes utvikling og sykdom. Dette er på grunn av at de er små dyr som rase svært godt og at deres genom er fullt sekvensert og mottakelig for manipulasjon-1. Andre fordeler inkluderer muligheten til å utføre fortsatt live bildebehandling på ulike stadier, inkludert i vivo avbilding av voksen sebrafisk2og utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer i sebrafisk Larvene3. I tillegg sebrafisk har regenerativ bæreevne på en rekke organer og vev inkludert bein, og dermed tjene som en nyttig måte å studere skjelettlidelser sykdom og reparere4,5.

Glukokortikoid-indusert osteoporose (GIO) er en sykdom som resultat av langsiktig behandling med glukokortikoider, for eksempel i løpet av autoimmune sykdommer behandling som astma eller revmatoid artritt. GIO utvikler ca 30% av glukokortikoid-behandlede pasienter og representerer en store helsemessige problemet6; Derfor er det viktig å undersøke virkningen av immunsuppresjon på benvev i stor detalj. De siste årene en rekke sebrafisk modeller håndtere patogenesen av GIO er utviklet. Glukokortikoid-mediert bentap har blitt indusert i sebrafisk larver, for eksempel som førte til identifisering av counteractive forbindelser økt benmasse i en narkotika-skjermen7. Videre glukokortikoid-indusert bein hemmende effekten har blitt etterlignet i sebrafisk skaleres både i vitro og vivo8,9. Disse analyser er veldig overbevisende tilnærminger, spesielt når det gjelder identifisering av romanen suppressive og bein anabole stoffer. Men de bare delvis hensyn endoskeleton og utført ikke i en regenererende sammenheng. Derfor tillater de ikke etterforskningen av glukokortikoid-mediert effekter under rask moduser av voksen, regenererende bein formasjon.

Her presenterer vi en protokoll slik at forskere til å studere glukokortikoid-mediert effekter på voksen sebrafisk bein under gjenfødelse. Skade modeller inkluderer delvis amputasjon av sebrafisk halefinnen, trepanation av skallen og etableringen av fin ray sprekker (figur 1A-1 C), og kombineres med glukokortikoid eksponering via inkubering (figur 1E ). Vi har nylig brukt en del av denne protokollen til å beskrive konsekvensene av eksponering for prednisolon, en av foreskrevne kortikosteroid narkotika, voksen sebrafisk regenererende fin og skallen Ben10. I sebrafisk fører prednisolon administrasjon til redusert osteoblast spredning, ufullstendig osteoblast differensiering og raske induksjon av apoptose i monocytt/macrophage avstamning10. I denne protokollen, også beskriver vi hvordan brudd kan bli introdusert i enkelt benete fin ray segmenter11, som denne tilnærmingen kan være nyttig når studere glukokortikoid-mediert effekter på bein som oppstår under brudd reparasjon. Metodene presenteres her vil bidra til ytterligere adresse underliggende virkningsmekanismer glukokortikoid i raskt regenererende bein og kan også brukes i andre innstillinger for systemisk narkotika administrasjon i konteksten av sebrafisk vev gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av Landesdirektion-Dresden (tillater tall: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. forberedelse av materialer og løsninger

Merk: Prednisolon, som andre glukokortikoider, fører til immunsuppresjon. Dermed må forholdsregler tas å hindre infeksjon i behandlede dyr under eksperimentet. Denne slutten, autoklav glass ware og "fisk vann" (dvs. vannet som brukes til bakre voksen sebrafisk) før du starter eksperimentet.

  1. Beregne antall sebrafisk som skal brukes i eksperimentet. Husk å inkludere enkeltpersoner som tjener som kontroller.
  2. Autoclave 600 mL glass kanner som dekkes med aluminiumsfolie med autoklav tape. Sebrafisk behandles individuelt, dermed 1 glass kanne kreves per sebrafisk.
  3. Beregne hvor mye fisk vann som trengs for eksperimentet. Det kreves 300 mL per person per dag. Ta hensyn til lengden på eksperimentet (f.eks 1 uke/7 dager).
  4. Fyll glassflasker med fisk vann, lukke dem og autoklav med et autoclave tape. Benytt 2 L flasker, men andre flasker som 1 L eller 5 L kan brukes også.
    Merk: Hvis eksperimenter er lang (f.eks 4 uker/28 dager) og glassflasker er begrenset, må du forberede flasker i minst flere dager om gangen og gjenta prosessen (1,3 til 1,4) gjennom hele eksperimentet.
  5. Forberede en prednisolon lager løsning av sterile-filtrert 100 mM prednisolon i dimethylsulfoxide (DMSO). Fryse bestanden i 1 mL eller 2 mL microcentrifuge tube dele.
    FORSIKTIG: Alltid slitasje verneklær når arbeider med prednisolon (vernehansker, vernebriller, laboratoriefrakk).
  6. På den første dagen av eksperimentet, forberede inkubasjon løsninger med prednisolon og DMSO henholdsvis. Dette tine den nødvendige mengden av 100 mM prednisolon lagerløsning og legge prednisolon autoklaveres fisk vann i en siste konsentrasjon av 50 µM.
    1. For kontroll behandlinger, legge til det tilsvarende volumet av DMSO autoklaveres fisk vann. Som et eksempel, for å produsere 2 L prednisolon inneholder fisk vann, legge til 1 mL av 100 mM prednisolon lager 2 L fisk vann. I en 2 L flaske fisk vann, tilsett 1 mL DMSO tilsvarende.
    2. Arbeid i et passende sted som er ment å utføre medikamentelle behandlinger, ideelt i et rom på 27 ° C.

2. generasjon av skader i sebrafisk finnene

Merk: For å skade bein i sebrafisk finnene, utføre fjernelse av fin (amputasjon, vanligvis i halefinnen) eller brudd personlige benete fin stråler (brudd modell). Dette anaesthetize voksen sebrafisk først.

  1. Amputasjon
    1. For å anaesthetize voksen sebrafisk, forberede 100 mm diameter Petriskål inneholder 0,02% MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate) i fisken vann (dette vannet ikke trenger å være autoklaveres).
      1. Overføre en sebrafisk samtidig til MS-222 inneholder Petriskål ved hjelp av en fisk net og ruge det før den ligger på høykant uten bevegelse og reagerer ikke for å berøre. Teste sistnevnte ved å berøre Gattfinnen med butt tang.
      2. Vent til nivå 4 bedøvelse nås som er riktig nivå for fin resection12. På dette stadiet, frekvensen av opercular bevegelse er redusert muskeltonus er tapt og fisken flytte ikke på touch12.
    2. Ta sløv tang og overføre den anaesthetized sebrafisk nøye til inversed lokket på 100 mm Petriskål. Plass sebrafisk på lateralt. Kontroller at sebrafisk alltid ligge i samme retning, for eksempel på høyre kroppen siden. Skalpell eller et barberblad, resect 50% av fin (figur 1A, 2A).
      Merk: Hastigheten på sebrafisk fin gjenfødelse avhenger på beløpet av resected fin tissue, dvs. mer fin vevet resected raskere fin regenererer13. Derfor, for å minimere variasjoner i fin gjenfødelse pass på å alltid resect fin på samme nivå i alle sebrafisk.
    3. Overføre den skadde sebrafisk til en autoklaveres glass beaker med 300 mL prednisolon eller DMSO som inneholder autoklaveres fisk vann. Dekk glass begeret med aluminiumsfolie å unngå rømning av sebrafisk.
    4. Gjenta trinn 2.1.2 å 2.1.3 til antall sebrafisk for eksperimentet er nådd.
  2. Fin brudd
    1. Klargjør en agarose-belagt 100 mm Petriskål ved å varme en 2% agarose løsning i fisken vann eller E3 (embryoet media 3, 50 mM natriumklorid 0,17 mM kalium klorid, 0,33 mM veisalt, 0,33 mM Magnesiumsulfat). Nøye hell omtrent 10-15 mL løsningen i Petriskål. Bunnen av fatet skal være helt dekket. La agarose stivne.
    2. Anaesthetize sebrafisk som beskrevet i Seksjon 2.1.
    3. Ta sløv tang og overføre den anaesthetized sebrafisk nøye til agarose-belagt 100 mm Petriskål. Plass sebrafisk på lateralt. Under dissection spre mikroskop, halefinnen helt å kunne identifisere distinkte benete fin stråler og fin ray segmenter. Kontroller at sebrafisk alltid ligge i samme retning, for eksempel på høyre kroppen siden.
    4. Med en injeksjon p (0,3 mm x 13 mm) introdusere en brudd i midten av et benete fin ray segment (figur 1B). Dette gjør presset nålen litt på segmentet til en sprekk vises (pil i figur 2B). Mens lett trykk fører til brudd på bare én av de to motstridende hemirays sterkere vil press føre til brudd på begge hemiray segmenter.
      1. Ikke innføre for mange brudd i svømmeføtter, siden dette vil sterkt påvirke stabiliteten av fin. Som et forslag, kan du bruke frakturer i 3 til 5 fin stråler.
      2. Alltid produsere frakturer i tilsvarende segmenter over forskjellige fin stråler og sebrafisk, for eksempel i ryggfinnen stråler 3, 7 (eller 8) og ventrale fin ray 3. Den proksimale-distale brudd er ideell til 3 segmenter proksimale fin stråler bifurkasjonen punkt 11.
    5. Overføre den skadde sebrafisk til en autoklaveres glass beaker med 300 mL prednisolon eller DMSO som inneholder autoklaveres fisk vann. Dekk glass begeret med aluminiumsfolie å unngå rømning av sebrafisk.
    6. Gjenta trinn 2.2.2 til 2.2.5 til antall sebrafisk for eksperimentet er nådd.

3. generasjon Calvarial skallen skader (Trepanation)

Merk: Calvariae i sebrafisk er homologe til calvarial bein i pattedyr. Dermed representerer disse exoskeletal bein14 en vev av spesiell interesse når studere patogenesen av GIO. For å skade skallen, utføres trepanation ved å bore et hull i Os Watford og/eller Os parietale (figur 1 c, 2 C) ved hjelp av en microdrill11.

  1. Anaesthetize sebrafisk i sprøyte 2.1.
  2. Hold de bedøvet sebrafisk oppreist med tang, slik at calvarial beina er godt synlig under disseksjon mikroskop ovenfra (figur 1 c).
  3. Finn den roterende microdrill på midten av frontale ben (Os Watford) og touch benet. Produsert hullet er av microdrill burr (500 µm, figur 2C, figur 3B).
    Merk: Husk å ikke flytte microdrill sidelengs mens skaden. Også stoppe umiddelbart når motstanden av benet plutselig synker. Påfør ikke skade noen ytterligere, ellers hjernen blir skadet 15.
  4. Overføre den skadde sebrafisk til et bur fylt med fisk vann til det fullt gjenoppretter bedøvelsen. Se det nøye.
  5. Overføre den skadde sebrafisk til en fisk vann pluss prednisolon eller DMSO inneholder glass kanne.

4. behandling av sebrafisk under inkubasjonen

Merk: Under anvendelse av prednisolon/DMSO, stoffet som inneholder fisk vann må endres daglig, og sebrafisk må fôres regelmessig.

  1. Vann endre
    1. Å utveksle fisken vann, tine 100 mM prednisolon lager og forberede den nødvendige mengden av 50 µM prednisolon i autoklaveres fisk vann fersk hver dag behandlingsperioden. Forberede DMSO inneholder fisken vann for kontroll sebrafisk tilsvarende.
    2. Ta et glass beaker som inneholder en enkelt ligger sebrafisk i sin inkubasjon løsning og overføre løsningen inkludert sebrafisk i en egnet beholder, for eksempel timelige bolig bur.
      Merk: Alltid bruk separate midlertidige containere for prednisolon og DMSO behandlet sebrafisk, henholdsvis at DMSO kontroll sebrafisk ikke eksponeres prednisolon og vice versa.
    3. Fylle glass begeret med fersk stoff som inneholder fisk vann (300 mL).
    4. Overføre sebrafisk fra midlertidige beholderen til glass begeret inneholder ferske inkubasjon løsning med en fisk netto. Sett tilbake folie for å unngå rømning av sebrafisk.
    5. Hvis tidspunktet for eksperimentet overstiger 2 uker, utveksle glass kanner.
  2. Fôring
    1. Under kort behandlinger (for opptil 2 dager) ikke mat sebrafisk. Under lengre eksperimenter, mate sebrafisk. Ta spesiell bekymre å unngå forurensning av inkubasjon løsningen. Dermed lever med Artemia ssp. stedet flake næringen og bare på hver annen dag.
      Merk: Artemia brukes regelmessig til å mate unge sebrafisk, og bør være tilgjengelig i sebrafisk haltering enheten.
      1. Omtrent mate 2 timer før fisken vann utveksles, sebrafisk med Artemia ssp på deres glass kanner. Å gjøre det, bruke en plastikk pipe og mate 0,5 til 1 mL skravert Artemia løsning per glass kanne.
      2. Vent 2t og utveksle inkubasjon løsningen med frisk stoffet som inneholder fisk vann etter kapittel 4.1.

5. analyser av prøver

Merk: Etter inkubasjon av skadde sebrafisk prednisolon og DMSO som inneholder fisk vann, utføre bein mineralisering/forkalkninger analyser (5,1 til 5,3) eller utføre live bildebehandling av sebrafisk under disseksjon mikroskopet (5.4) 10,11,16. Bruke live imaging å bestemme fin regenerere lengde og oppdage forskjeller i reporter genuttrykk i transgene sebrafisk.

  1. Fiksering av vev rundt
    1. Til å feste svømmeføtter og/eller hodeskaller forberede 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS og fryse på 20 ° C for lagring. Bruk nylagde 4% PFA i PBS eller Tin den nødvendige mengden før bruk. Alternativt, 2% PFA i PBS kan brukes.
      FORSIKTIG: PFA er giftig og bør håndteres forsiktig under avtrekksvifte. Bruk klær.
    2. Til å feste svømmeføtter forberede en liten Petriskål (f.eks 30 mm) med kaldt 4% PFA i PBS og sørge for at bunnen av parabolen er fullstendig dekket. For fiksering av hodeskaller, forberede en liten glasskrukke med lokk eller en tube med kaldt 4% PFA i PBS.
      FORSIKTIG: Håndtaket PFA inneholder løsninger under avtrekksvifte som den er giftig. Bruk klær.
    3. Høste vevet rundt.
      1. For å høste regenererende fin vev eller svømmeføtter frakturer anaesthetize sebrafisk i sprøyte 2.1 eller euthanize sebrafisk i sprøyte 5.1.5.
      2. Overføre anaesthetized sebrafisk til lokket av en Petriskål. Ved hjelp av en skalpell eller barberblad, høste fin regenerere. Kontroller at stubbe vev i å regenerere finnene for å lette håndteringen av høstet vev.
    4. Fastsette finnene i PFA inneholder Petriskål på 4 ° C over natten. Flat fiksering unngår curling opp av fin tissue under fiksering.
      1. For å fikse flat, grip fin vevet med en fin tang ved dorsal eller ventrale stump og Dynk kjeden i fiksering løsningen. Grab motsatt kant av stump med en andre fine tang og litt nedtrykt vev på bunnen av parabolen.
      2. Hold i 10 til 20 før slippe. Fin vevet bør ikke krøll lenger. Hvis den gjør det, gjenta.
    5. Euthanize sebrafisk for å høste skadet skallen vev. Forberede en 100 mm diameter Petriskål med 0,1% MS-222 i fisken vann. Overføre en sebrafisk samtidig til MS-222 inneholder Petriskål ved hjelp av et fiskegarn. Når nivå 6 bedøvelse (medullær Skjul) Vent minst 10 min for å sikre død av prøven12.
    6. Ved hjelp av en skalpell kuttet av hodet pluss litt bagasjerommet vev fra resten av kroppen. Fordype høstet vevet i 4% PFA løsningen i glasskrukke eller plastrør. Løsning 24 h på 4 ° C med milde rocking.
    7. For å lagre prøver langsiktig etter fiksering, vask dem med PBS (3 x 20 min på RT) og metanol behandle i en økende metanol-serien (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanol i PBS for 20 min).
      1. Lagre dem i 100% metanol på 20 ° C. Ellers direkte fortsette med bein flekker eller andre analyser etter vask med PBS.
  2. Bein flekker teknikker jeg (alizarin røde flekker)
    Merk: Denne flekker utføres etter van Eeden et al. 199617 og Walker & Kimmel 200718 med modifikasjoner.
    1. For å utføre alizarin røde flekker på voksen finnene eller hodeskaller, høste og løse vev som beskrevet i delene 5.1.
    2. Hvis prøver ble lagret i metanol på 20 ° C, rehydrate eksempler ved å gjøre en omvendt metanol serien (70%, 50% og 30% i PBS, hver 1 x 20 min) og vask dobbelt 20 min med PBS. Vask prøver for 5 min minimum med deionisert vann.
    3. Å gjøre alizarin røde flekker i hodeskaller, behandle prøver med 50 mg/mL trypsin 30% mettet Na2B4O7 ved romtemperatur over natten. Rock prøver i denne perioden. Skyll prøver 30% mettet Na2B4O7 løsning. Vask prøver med deionisert vann 2 ganger i 5 minutter hver. Dette trinnet utføres ikke fin vev.
    4. Legg alizarin rød løsning (del B: 0,5% alizarin rød S pulver, 10% glyserol i deionisert vann) og rock prøvene under inkubasjonen ved RT. Sjekk til farging etter 1, 2, 4 h eller over natten.
    5. Fjerne prøver behandle dem med et synkende 1% kalium hydroksid: glyserol serien (3:1 overnatting, 1:1 overnatting, 1:3 overnatting).
    6. Lagre prøvene i en 1:1 løsning av 0,1% kaliumhydroksid: 80% glyserol og Monter dem med 80% glyserol for bildebehandling.
      Merk: For kombinert Alcian blå/alizarin røde flekker godbit prøver med Alcian blå flekk løsning (del A: siste 0.02% Alcian blå, 50 mM MgCl2, 70% etanol) etter rehydrering (inndelingen 5.2.2) 2 h på RT. godbit svømmeføtter en synkende etanol serie i 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, hver 1 x 15 min) og vask vaskebuffer dem for minimum 1 h (3 x 20 min) i vann. Fortsett med alizarin røde flekker (inndelingen 5.2).
  3. Bein flekker teknikker II (calcein farging)
    Merk: For å oppdage kalsium deponering i fin frakturer og skallen skader, levende fisk er ruges i calcein som inneholder løsningen.
    1. Forbered nødvendig mengde av 0,2% calcein i deionisert vann (pH 7.5). Kontroller at pH nøytral. Bruk 1 M NaOH for å justere pH.
    2. Inkuber opptil 3 sebrafisk samtidig i 100 mL calcein løsning for 20 min i et glass beaker dekket med aluminiumsfolie.
    3. Overføre sebrafisk til et beaker med fisk vann. La dem svømme kort før du overfører dem til en ny kanne med fisk vann. La dem svømme i denne nye beaker for 20 min å vaske. Ta bilder (se avsnitt 5.4).
  4. Live bildebehandling av sebrafisk
    1. Bruk denne tilnærmingen til å hente bilder av regenererende benvev som i fin eller skallen gjennom hele eksperimentet uten å ofre sebrafisk. Anaesthetize sebrafisk i sprøyte 2.1.
    2. For å skaffe bilder av fin regenererer, overføre den anaesthetized sebrafisk på en agarose-belagt Petriskål (se avsnitt 2.2.1 og figur 1B).
    3. Hvis du vil hente bilder av regenererende hodeskallen bein, plasser sebrafisk oppreist i en svamp (figur 1 d) eller plasserer den i en agarose-belagt rett som er forberedt å holde bagasjerommet på sebrafisk.
    4. Hente bilder på ønsket forstørrelsen og oppløsning bruker en stereomicroscopic oppsett.
    5. Tilbake til sebrafisk til en container med friske eller stoff som inneholder fisk vann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen presenteres her er brukt gjentatte ganger å skape rask bein i regenerering av sebrafisk fin og skull10,11,16. I kombinasjon med metoden presentert av prednisolon administrasjon, kan studier på prednisolons effekter under bein regenerasjon gjennomføres. For eksempel kan studier på bein dannelse og mineralisering i regenerere utføres. Prednisolon, fører som andre glukokortikoider19,20, til total hemming av fin gjenfødelse, inkludert bein formasjon, som oppdages av alizarin røde flekker på fast halefinne vev (figur 3A). Tilsvarende har prednisolon en forsinket effekt på (calvarial) skallen skader nedleggelsen, som kan illustreres ved alizarin røde (figur 3B) eller i vivo calcein flekker. I tillegg utøver prednisolon en dyp anti-inflammatorisk effekt i både fin og skallen vev, ved å utløse apoptose i monocytt/macrophage avstamning. Redusert macrophage tall kan oppdages av immunhistokjemi på frossent seksjoner, f.eks ved å bruke et anti-mcherry antistoff transgene mpeg1: mCherry sebrafisk (Figur 3 c)10,21 . Tilsvarende kan antall, distribusjon, spredning og apoptose andre celletyper interesse for både exo- og endoskeleton (f.eks vertebrae) analyseres ved hjelp av immunohistochemistry.

Figure 1
Figur 1 : Prosedyrer utført i sebrafisk som. (A) fjerning av halefinnen (amputasjon) i anaesthetized sebrafisk ved hjelp av en skalpell. Den røde stiplede linjen angir amputasjon. (B) Fin rokke brudd i anaesthetized sebrafisk utført med en injeksjon nål under stereomicroscope. Fisken er legging på en agarose-belagt Petriskål under prosedyren. Agarose-belagt Petri retter brukes også hente bilder av sebrafisk fins under gjenfødelse eller brudd reparasjon. (C) Trepanation av calvariae (skallen skade) utført i anaestetized sebrafisk ved hjelp av en microdrill under stereomicroscope. (D) Image Vinningen av regenererende hodeskallen bein etter skader. Den anaesthetized sebrafisk plasseres oppreist i en svamp og bilder er ervervet ved hjelp av en stereomicroscope. Petriskål er fylt med fisk vann som inneholder 0.02% MS-222. (E) inkubasjonstiden for sebrafisk prednisolon eller DMSO som inneholder fisk vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Mikroskopiske bo utsikt av skader på 0t innlegg skade hpi). (A) amputere halefinne. Skala bar = 200 µm. (B) Fractured fin ray. Sprekken angis av den røde pilen. Skala bar = 100 µm. (C) Trepanated skallen. Skade området angis av hvitt pilhode. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant resultatene av prednisolon behandling i voksen sebrafisk. (A) Alizarin rød farget fin regenererer 14 dager innlegget amputasjon (dpa) og dagers behandling (dt). Prednisolon behandlet fin regenererer er kortere (vises ikke), og et mindre domene alizarin rød positiv bein matrix oppdages. Skala bar = 500 µm. (B) Alizarin rød farget hodeskaller på 7 dager innlegg skade (PPT) og dt. Skala bar = 100 µm. Dette tallet er endret med tillatelse10. (C) Cryosection Vis av uskadet skallen og hjernen vev av behandlet (prednisolon) og ubehandlet (DMSO) vs (mpeg1: mCherry) x vs (osterix: nGFP) transgene reporter fisk, som makrofager (medfødte immunceller) er merket i rødt 21 og Ben danner osteoblasts merket i grønt22. Antall makrofager drops betydelig prednisolon behandlet sebrafisk. Immunohistochemistry ble utført som beskrevet i Geurtzen et al. 10. kjerner er merket i blått (DAPI). Skala bar = 20 µm. BF: lyse felt, epid: overhuden, bn: bein. Dette tallet er endret med tillatelse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sebrafisk har vist seg nyttig i skjelettlidelser forskning i mange forhold. Valgte mutanter etterligner aspekter av menneskelig sykdom som osteogenesis imperfecta eller slitasjegikt23,24,25,26,27, og Larvene samt skalaer brukes til å identifisere bein anabole forbindelser små molekyl skjermer7,28,29. Behandlinger av sebrafisk med stoffer som brukes i klinisk praksis er videre ideell for å studere mulige bivirkninger, for eksempel i benvev. I denne sammenheng er tilstedeværelse av raskt regenererende bein en fordel å undersøke de underliggende mekanismene medikament-indusert bein mangler. Her presenterer vi en protokoll som behandling med glukokortikoid prednisolon, en brukte anti-inflammatorisk narkotika med bivirkninger i benvev, kombinert med voksen bein gjenfødelse regimer. Denne protokollen har blitt brukt til å indusere suppressive og bein hemmende effekter i regenerativ vev av sebrafisk, og kan også tilpasses til studier av effekten av prednisolon og andre stoffer i voksen vev som ryggraden. Følgende detaljer bør tas i betraktning når suppressive medikamentelle behandlinger utføres i sebrafisk gjennomgår fin eller skull gjenfødelse.

Reproduserbarhet av skade analyser

Under fin regenerasjon avhenger gjenfødelse hastighet (dvs. gjenvekst av fin tissue, inkludert bein, per tidsenhet) veldig mye på mengden av fin tissue som kappet13. For å unngå uønskede variasjon av fin gjenfødelse, husk å alltid resect tilsvarende mengder av fin tissue i alle prøvene.

Gjennomføring av benete fin ray frakturer utføres ved å skyve litt en injeksjon p på midten av et valgt benete fin ray segment. Som benete fin stråler består av 2 motsatte hemirays, bestemmer hvor mye trykk brukes enten en eller begge hemirays er brukket. Vi foretrekker å bruke lavtrykk til brudd bare én hemiray, fordi brudd i begge hemirays tendens til å destabilisere fin ray, som følgelig løsne under følgende dagen.

Calvarial skader av skallen av microdrilling skal utføres forsiktig. Hvis skaden er gjort til hjernen (dvs. lillehjernen) postural og locomotory blir underskudd tydelig av uberegnelig svømming av prøven15. Sebrafisk med lillehjernen skade kan vise bivirkninger av behandling og bør ikke brukes til å studere bein gjenfødelse.

Hensyn medikamentelle behandlinger

Vi bruker en dose av 50 µM prednisolon i fisken vann for å produsere en konsekvent suppressive og anti-regenererende effekt i voksen sebrafisk. Vi oppdaget denne dose under første dose-respons eksperimenter i sebrafisk som larver og voksne. Dose-respons eksperimenter bør derfor utføres for å identifisere nødvendige dosen av andre suppressive midler som kan brukes. For voksne anbefaler vi å kombinere disse initial eksperimenter med det fin gjenfødelse regimet, fin regenerere lengde er en høylig følsom og lett å oppdage avlesning for vev endringer.

Suppressive behandling predisponerer behandlet prøver for mikrobielle infeksjoner. Derfor er én bolig i autoklaveres kanner med autoklaveres fisk vann viktig. Selv om disse forholdene er mer tungvint å utføre, og er ikke sterile, bidrar de til å minimere infeksjon i behandlet sebrafisk. Vi ikke pretreat ("sterilisere') Artemia egg. Dette kan imidlertid være en ytterligere tiltak for å hindre infeksjon i sebrafisk, om nødvendig. Videre kan antiseptisk stoffer som methylene Blåfarge (1%) legges til fisk vann før bruk.

Eksperimenter med prednisolon, både kortsiktig og langsiktig, krever daglige endringer av fisk vann. Vi har behandlet voksen sebrafisk 8 uker. Behandling av et stort antall personer for lang tid kan føre til en viss eksperimentelle "belastning", og må planlegges nøye. Det er avgjørende å alltid ha den nødvendige mengden autoklaveres fisk vann og glass ware klar. Selv om dette ikke har blitt testet i sebrafisk (til vår kunnskap), representere implantasjon av langsom løslate-pellets for narkotika rundt et verdifulle alternativ for langsiktige narkotika eksponering i sebrafisk.

Analyser i transgene sebrafisk

Her presenterer vi 2 metoder stain for mineralisering/forkalkning av bein vev ved alizarin røde og calcein flekker. I tillegg viser vi hvordan regenerating fin og skull vev i vivo ved hjelp av en stereomicroscope. Sistnevnte teknikken er veldig nyttig, hvis transgene sebrafisk rapportering nummeret eller aktivitet av merkede celler, for eksempel osteoblasts eller immunceller, er å bli fotografert. For eksempel ofre skadet og prednisolon-behandlet sebrafisk utføre alizarin røde flekker, fin regenererer eller trepanated hodeskaller blir reparert kan bli fotografert for å se etter tilstedeværelse, antall og aktivitet av Ben danner osteoblasts i transgene reporter linjen vs (osterix: nGFP)22. Likeledes kan epidermal såret nedleggelse, som oppstår innen en dag, visualiseres i transgene fisk, som uttrykker en fluorophore i epidermal vev. Også kan opphopning av immunceller på stedet av skade (eller deres fravær i prednisolon behandlet individer) overvåkes lett med en stereomicroscope utstyrt med de nødvendige lyskilde og filtre.

I sum, kan protokollen presenteres her brukes til å studere virkningene av suppressive agenter og andre rusmidler etter systemisk administrasjon i sebrafisk som gjennomgår bein fornyelse enten i fin eller skallen. Dette vil være nyttig å avgrense patogenesen av GIO og undersøke mekanismene bak vellykket bein gjenfødelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av en bevilgning i den Center for regenerativ terapier Dresden ("sebrafisk som modell å rakne mekanismer for glukokortikoid-indusert bentap"), og i tillegg av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, prosjekt 387653785) til FK. Vi er svært takknemlig til Jan Kaslin og Avinash Chekuru for deres veiledning og hjelp på å utføre trepanation av calvariae og frakturer i benete fin stråler. Eksperimenter ble designet, utført og analyseres av KG og FK. FK skrev manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Katrin Lambert, Nicole Cudak, og andre medlemmer av Knopf og merke laboratorier for kundestøtte og diskusjon. Vår takk går også til Marika Fischer og Jitka Michling for god fisk pleie og Henriette Knopf og Josh Currie for korrekturlesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Tags

Utviklingsbiologi problemet 140 sebrafisk bein gjenfødelse skade Fin skallen glukokortikoider prednisolon
Voksen sebrafisk skade modeller for å studere virkningene av prednisolon i å regenerere benvev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult… More

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter