Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Published: October 18, 2018 doi: 10.3791/58429
Automatic Translation
1, 1,2
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

Summary

Burada, 3 Yetişkin zebra balığı yaralanma model ve immünsupresif ilaç tedavisi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz doku Yenileyici görüntüleme ve kemik Qafqaz orada tespit rehberlik sağlar.

Abstract

Zebra balığı ekleri (palet) dahil olmak üzere çeşitli organlarda amputasyona sonra yeniden edebiliyoruz. Bu yaralanma sonra yaklaşık iki hafta içinde regrows kemik rejenerasyon içerir. Ayrıca, zebra balığı kemik, hızla sonra kafatasının trepanasyon iyileşmek ve kolayca zebra balığı kemikli fin ışınları tanıttı olabilir kırık onarmak mümkün. Bu yaralanma deneyleri yönetilen uyuşturucu etkisi hızla kemik oluşturan üzerinde test etmek için uygun deneysel paradigmalar temsil eder. Burada, bu 3 yaralanma modellerinin kullanımı ve kemik inhibitör ve immünsupresif etkileri giderek artan sistemik glukokortikoid tedavi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz yetişkin zebra balığı immünsüpresif tedavi için hazırlamak, fin amputasyon, trepanasyon grefti kemik ve fin kırıklar, gerçekleştirmek nasıl göstermek ve her iki kemik oluşturan glukokortikoid kullanımını nasıl etkilediğini açıklamak nasıl bir iş akışı sağlar dokusunu ve hücreler kemik dokusu içinde doğuştan gelen bağışıklık parçası olarak monosit/makrofaj soyundan.

Introduction

Zebra balığı omurgalı geliştirme ve hastalık eğitim için güçlü bir hayvan modeli temsil eder. Gerçeğini onlar are son derece iyi cins küçük hayvanlar ve onların genom tam olarak sıralanmış ve manipülasyon1mükellef nedeni bu. Diğer avantajı vivo içinde görüntüleme yetişkin zebra balığı2ve yüksek işlem hacmi uyuşturucu ekranlar zebra balığı larvalar3' te gerçekleştirme olanağı da dahil olmak üzere farklı aşamalarında sürekli canlı görüntüleme gerçekleştirmek için seçeneği içerir. Ayrıca, zebra balığı yüksek yeniden üretim kapasiteli organ ve dokulara kemik dahil olmak üzere çeşitli sahip ve böylece iskelet hastalığı çalışma ve4,5onarmak için yararlı bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Osteoporoz (GIO) glukokortikoid indüklenen astım veya romatoid artrit gibi otoimmün hastalığı tedavisi sırasında örneğin glukokortikoid ile uzun vadeli tedavi sonuçları bir hastalıktır. GIO glukokortikoid tedavi edilen hastaların yaklaşık % 30 geliştirir ve önemli bir sağlık sorunu6temsil eder; Bu nedenle, immünosupresyon ayrıntılı olarak kemik dokusu üzerinde etkisini araştırmak önemlidir. Son yıllarda çeşitli GIO patogenezi ile ilgili zebra balığı modeller geliştirilmiştir. Glukokortikoid aracılı kemik kaybı counteractive bileşikler kemik kütlesi bir uyuşturucu ekran7artan tanımlaması için yol açan zebra balığı larva, örneğin, içinde indüklenen. Ayrıca, glukokortikoid kaynaklı kemik inhibitör etkileri içinde taklit zebra balığı ölçekler vitro ve in vivo8,9. Bu deneyleri çok ikna edici yaklaşımlar, özellikle de gelir roman immünsüpresif ve kemik anabolik uyuşturucu tanımlaması. Ancak, onlar sadece kısmen iskelet dikkate almalı ve rejeneratif bir bağlamda gerçekleştirilen değil. Böylece, bunlar glukokortikoid aracılı etkileri soruşturma hızlı modları yetişkin, rejeneratif kemik oluşumu sırasında izin vermez.

Burada, yenilenme geçiren yetişkin zebra balığı kemik üzerindeki etkileri glukokortikoid aracılı çalışmaya araştırmacılar sağlayan bir iletişim kuralı mevcut. Yaralanma modelleri kısmi amputasyon zebra balığı kaudal fin, kafatası trepanasyon yanı sıra yüzgeç ışın kırıkları (Şekil 1A-1 C) oluşturulması ve glukokortikoid kuluçka maruz kalma yoluyla ile (Şekil 1E birleştirilir ). Biz son zamanlarda yetişkin zebra balığı yüzgeci ve kafatası kemik10Yenileyici prednizolon, bir sık reçete kortikosteroid ilaçların maruz sonuçlarını açıklamak için bu iletişim kuralı bir kısmını kullandık. Zebra balığı, azalan osteoblast yayılması, eksik osteoblast farklılaşma ve Apoptozis monosit/makrofaj lineage10hızlı indüksiyon prednizolon yönetim yol açar. Glukokortikoid aracılı etkileri kemik meydana gelen kırık onarım sırasında okurken bu yaklaşım yararlı olabilir gibi bu protokol için biz de nasıl kırıklar tek kemikli yüzgeç ışın kesimleri11tanıttı olabilir açıklar. Burada sunulan yöntemleri mekanizmaları hızla kemik Yenileyici glukokortikoid Action altında yatan daha fazla adres için yardımcı olacak ve ayrıca zebra balığı doku rejenerasyonu sistemik ilaç idaresi bağlamında diğer ayarlarında istihdam edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada Landesdirektion Dresden tarafından kabul edildi (izni numaraları: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24 / 9168.11 / 1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).

1. hazırlanması malzemeler ve çözümler

Not: Prednizolon, diğer sebepler gibi immünosupresyon için yol açar. Böylece, deneme sırasında tedavi hayvanlarda bulaşmasını engellemek için önlem alınmalıdır. Bu son, otoklav cam eşya ve 'su balık' (Yani, yetişkin zebra balığı arka için kullanılan su) deneme başlamadan önce.

  1. Deneyde kullanılacak zebra balığı sayısını hesaplayın. Denetimleri hizmet bireylerin eklediğinizden emin olun.
  2. Otoklav Bandı ile alüminyum folyo ile kaplı otoklav 600 mL Cam şişeler. Zebra balığı ayrı ayrı işlem görür, böylece 1 cam kabı zebra balığı gereklidir.
  3. Deney için gerekli balık su miktarını hesaplamak. 300 mL, kişi ve gün gereklidir. Deneme uzunluğu dikkate alın (Örneğin, 1 hafta/7 gün).
  4. Cam şişeler balık su ile doldurun, onları ve basınçlı kap şişeler Otoklav Bandı ile kapatın. İdeal olarak, 2 L şişe ama 1 L veya 5 L de kullanılabilir gibi diğer şişeler kullanın.
    Not: deneyler uzun varsa (Örneğin, 4 hafta/28 gün) ve cam şişeler miktarı sınırlıdır, şişe en az bir seferde birkaç gün hazırlamak ve deneme sürecinde (1.3-1.4) tekrar emin olun.
  5. Dimethylsulfoxide (DMSO) 100 mM filtre steril prednizolon prednizolon stok çözeltisi hazırlamak. 1 mL veya 2 mL microcentrifuge tüp aliquots stokta dondur.
    Dikkat: Her zaman ne zaman giyim giyim koruyucu prednizolon (koruyucu eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü) ile çalışma.
  6. Denemenin ilk gününde, kuluçka çözümlerle prednizolon ve DMSO, sırasıyla hazırlayın. Bu amaçla, 100 mM prednizolon hisse senedi çözüm gerekli miktarda çözülme ve prednizolon 50 µM son bir konsantrasyon autoclaved balık su ekleyin.
    1. Denetim tedavisi DMSO karşılık gelen hacmi autoclaved balık su ekleyin. Örneğin, 2 lt prednizolon içeren balık su üretmek için 100 mM prednizolon stokunun 1 mL 2 L balık su ekleyin. Balık su başka bir 2 L şişe içinde 1 mL DMSO, buna bağlı olarak ekleyin.
    2. İlaç tedavileri, ideal bir Oda 27 ° C'de gerçekleştirmek için ayrılmış olan uygun bir yerde çalışmak

2. nesil zebra balığı yüzgeçleri yaralanmaları

Not: zebra balığı yüzgeçleri kemik incitmek, fin (amputasyon, genellikle içinde kaudal fin) rezeksiyon gerçekleştirmek veya bireysel kemikli fin ışınları (kırık modeli) kırık. Bu amaçla ilk yetişkin zebra balığı uyuşturan.

  1. Amputasyon
    1. Yetişkin zebra balığı uyuşturan, 100 mm çapında Petri kabına %0.02 içeren hazır olun MS-222 (etil-3-aminobenzoate methanesulfonate) (Bu su gerekmez autoclaved olmak) balık suda.
      1. Bir zebra balığı teker teker bir balık net kullanarak MS-222 içeren Petri kabına aktarın ve hareket etmeden kendi tarafında yatıyor ve dokunmaya tepki değil kadar kuluçkaya. İkinci künt forseps ile anal yüzgeç dokunarak sınayın.
      2. Seviye 4 anestezi fin rezeksiyon12için uygun seviyeye olduğu ulaşılana kadar bekleyin. Bu aşamada opercular hareket hızı azalır, kas tonusu kaybolur ve balık dokunmatik12hareket etmez.
    2. Künt forseps al ve anaesthetized zebra balığı dikkatle 100 mm Petri kabına inversed kapağını aktarmak. Zebra balığı yanal onun yanına koyun. Hep aynı yönde, onların doğru vücut tarafında örneğin yalan zebra balığı emin olun. Bir bistüri veya jilet ile fin (Şekil 1A, 2A) % 50'si çıkarabileceğim.
      Not: Zebra balığı yüzgeci yenilenme hızı rezeke fin doku miktarına bağlıdır, Yani, daha fazla fin doku rezeke, fin13hızlı yeniden oluşturur. Böylece, en aza indirmek için fin rejenerasyon değişimler her zaman tüm zebra balığı aynı düzeyde fin çıkarabileceğim emin olun.
    3. Yaralı zebra balığı prednizolon veya autoclaved balık su içeren DMSO 300 mL içeren bir autoclaved cam kabı aktarın. Zebra balığı kaçış önlemek için alüminyum folyo ile cam kabı kapağı.
    4. Zebra balığı deney için gerekli sayısı üst sınırına kadar 2.1.2-2.1.3 arasındaki adımları yineleyin.
  2. Fin kırık
    1. Balık su veya E3% 2 özel çözümde Isıtma tarafından bir özel kaplamalı 100 mm Petri kabına hazırlamak (embriyo medya 3, 50 mM sodyum klorür, 0,17 mM potasyum klorür, 0,33 mM kalsiyum klorür, 0,33 mM magnezyum sülfat). Dikkatli bir şekilde kabaca 10-15 mL çözüm Petri kabına dökün. Çanak alt tamamen örtülmelidir. Kuvvetlendirmek özel izin.
    2. Zebra balığı 2.1 bölümünde açıklandığı gibi uyuşturan.
    3. Künt forseps al ve anaesthetized zebra balığı dikkatle özel kaplamalı 100 mm için Petri kabına aktarın. Zebra balığı yanal onun yanına koyun. Diseksiyon mikroskop altında tamamen farklı kemikli fin ışınları tanımlamak ve ray parçaları fin edebilmek için kaudal fin yayıldı. Hep aynı yönde, onların doğru vücut tarafında örneğin yalan zebra balığı emin olun.
    4. Enjeksiyon iğnesiyle (0.3 mm x 13 mm) bir kırık bir kemik yüzgeç ışın kesimi (Şekil 1B) ortasına tanıtmak. Bir çatlak (ok Şekil2B) görününceye kadar bunu yapmak için iğne biraz segment itilir. Hafif basınç sadece bir iki muhalif hemirays daha güçlü kırık yol açar iken basınç her iki hemiray parçalarını kırık yol açar.
      1. Bu büyük ölçüde fin kararlılığını bozabilir beri yüzgeçleri, çok fazla çatlaklar tanıtmak değil. Bir öneri olarak, 3-5 fin ışınları sadece çatlaklar uygulanır.
      2. Her zaman farklı fin ışınları ve zebra balığı, örneğin sırt yüzgeci ışınları 3, 7 (veya 8) ve ventral fin ray 3 içinde karşılık gelen parçaları çatlaklar üretmek. Kırık distal proksimal düzeyi 3 segmentleri fin ışınları çatallanma noktası 11' e proksimal, idealdir.
    5. Yaralı zebra balığı prednizolon veya autoclaved balık su içeren DMSO 300 mL içeren bir autoclaved cam kabı aktarın. Zebra balığı kaçış önlemek için alüminyum folyo ile cam kabı kapağı.
    6. Zebra balığı deney için gerekli sayısı üst sınırına kadar 2.2.2-2.2.5 arasındaki adımları yineleyin.

3. nesil grefti kafatası yaralanması (ağrısı)

Not: Zebra balığı calvariae homolog memelilerde kemik grefti için. Böylece, GIO patogenezinde okurken bu exoskeletal kemikleri14 temsil bir doku özel ilgi. Kafatası incitmek, ağrısı microdrill11yardımı ile Os frontale ve/veya Os parietale (Şekil 1 c, 2 C) bir delik delme tarafından gerçekleştirilir.

  1. Zebra balığı Bölüm 2.1 göre uyuşturan.
  2. Grefti kemikler de (Şekil 1 c) yukarıda bir diseksiyon mikroskop altında görünecek şekilde imzalat zebra balığı forseps ile dik tutun.
  3. Frontal kemik (Os frontale) ortasına dönen microdrill bulun ve kemik dokunun. Üretilen delik microdrill burr (500 µm, Şekil 2C, Şekil 3B) boyutudur.
    Not: microdrill yanal yaralanma üretirken oynatmamaya dikkat edin. Ne zaman kemiğin dayanıklılığını aniden damla hemen da kes. Herhangi bir daha fazla matkap değil, aksi takdirde beyin hasarlı 15olacak.
  4. Yaralı zebra balığı tam anesteziden normale dönene kadar balık su ile dolu bir kafes aktarın. Dikkatli izle.
  5. Yaralı zebra balığı bir balık suyu artı prednizolon veya DMSO içeren cam kabı için transfer.

4. zebra balığı kuluçka sırasında tedavisinde

Not: prednizolon/DMSO uygulama sırasında balık su içeren ilaç her gün değiştirilmesi gerekir ve zebra balığı düzenli olarak beslenmek gerekir.

  1. Su değişiklikleri
    1. Balık su değişimi, 100 mM prednizolon hisse senedi çözülme ve hazırlamak için 50 µM prednizolon autoclaved balık gerekli miktarda su taze tedavi süresi boyunca her gün. Buna göre denetim zebra balığı balık su içeren DMSO hazırlayın.
    2. Bir tek barındırılıyor zebra balığı kuluçka çözümünün içinde içeren bir cam kabı alın ve zebra balığı uygun bir kap içine, örneğin bir geçici konut kafes dahil çözüm aktarın.
      Not: Her zaman kullanım ayrı geçici konteynerler prednizolon ve DMSO zebra balığı, sırasıyla, DMSO denetim zebra balığı değil maruz prednizolon ve tersi emin olmak için tedavi.
    3. Cam kabı balık su (300 mL) içeren taze uyuşturucu ile tekrar doldur.
    4. Zebra balığı bir balık net kullanarak taze kuluçka solüsyon içeren cam kabı geçici kapsayıcıdan aktarın. Zebra balığı kaçış önlemek için folyo yerine koy.
    5. Deneme süresi 2 hafta aşıldıysa, cam şişeler değişimi.
  2. Besleme
    1. (2 gün için) kısa tedaviler sırasında zebra balığı yem yok. Daha uzun deneyler sırasında zebra balığı beslemek. Kuluçka çözüm kirliliği önlemek için özel dikkat. Böylece, Artemia ssp. yerine pul gıda ile ile sadece iki günde besle.
      Not: Artemia ve düzenli olarak genç zebra balığı beslemek için kullanılır zebra balığı haltering biriminde bulunması gerekir.
      1. Yaklaşık 2 saat önce kendi cam şişeler içinde Artemia ssp ile zebra balığı yem balık su değiştirilir. Bunu yapmak için bir plastik pipet kullanın ve taranmış Artemia çözüm 0.5-1 mL Cam kabı yem.
      2. 2s için bekleyin ve kuluçka çözüm taze uyuşturucu içeren balık su Bölüm 4.1 göre değişimi.

5. analiz örnekleri

Not: Prednizolon ve balık su içeren DMSO yaralı zebra balığı kuluçka sonra sırasıyla, kemik Qafqaz/kalsifikasyon çözümlemesi (5,3 5.1) veya zebra balığı diseksiyon mikroskop (5,4) altında canlı görüntüleme gerçekleştirmek 10,11,16. Canlı görüntüleme fin regenerate belirlemek ve transgenik zebra balığı muhabir gen ekspresyonu farklılıkları algılamak için kullanın.

  1. Faiz dokuların fiksasyonu
    1. Yüzgeçleri ve/veya kafatasları fiksasyonu için %4 paraformaldehyde (PFA) PBS hazırlamak ve depolama için-20 ° C'de dondurmak. Kullanım taze hazırlanan % 4 PFA PBS veya tezcan kullanmadan önce gerekli tutar. Alternatif olarak, %2 PBS PFA-ebilmek var olmak kullanılmış.
      Dikkat: PFA toksik ve dikkatli bir duman başlık altında ele alınmalıdır. Koruyucu giysi giyin.
    2. Yüzgeçleri fiksasyonu için küçük bir petri hazırlamak (Örneğin, 30 mm) soğuk %4 ile PBS PFA ve çanak alt tamamen ele emin olun. Kapaklı küçük bir cam kavanoz ya da bir tüp ile soğuk %4 kafatasları fiksasyonu için hazırlamak PFA PBS içinde.
      Dikkat: Tanıtıcı PFA zehirli olduğu gibi sadece duman başlık altında çözümleri içeren. Koruyucu giysi giyin.
    3. Faiz dokusunun hasat.
      1. Yenileyici hasat için Bölüm 2.1 göre zebra balığı yüzgeci doku veya palet kırıkları ile uyuşturan veya bölüm 5.1.5 göre zebra balığı ötenazi.
      2. Anaesthetized zebra balığı bir petri kapağı aktarın. Bir bistüri veya jilet kullanarak, fin yeniden hasat. Yüzgeçleri hasat doku kullanımı kolaylaştırmak için yenileyici güdük doku eklediğinizden emin olun.
    4. Yüzgeçleri düz Petri kabına 4 ° C'de gecede içeren PFA düzeltmek. Düz fiksasyon fiksasyon sırasında fin dokusunun kıvrık önler.
      1. Düz saptamak için güdük dorsal veya ventral kenarında bir iyi forseps ile fin doku kapmak ve fiksasyon çözümde batırmayın. Karşı kenarına kadar güdük bir ikinci iyi forseps ile kapmak ve biraz çanak alt üzerine doku düşürmek.
      2. 10-20 için tutun bırakmadan önce s. Fin doku artık kıvrılıp değil. Eğer işe yararsa, tekrar ediyorum.
    5. Zebra balığı yaralı kafatası doku hasat için ötenazi. 100 mm çapında Petri kabına %0,1 içeren hazırlamak MS-222 balık suda. Bir zebra balığı teker teker balık ağı kullanarak MS-222 içeren Petri kabına aktarın. Seviye 6 anestezi (medüller Daralt) ulaşıldığında numune12ölümü sağlamak için en az 10 dk bekle.
    6. Bir neşter kullanarak baş artı küçük bir gövde doku vücudun geri kalanından kesti. Cam veya plastik tüp hazır % 4 İngiltere'de yılın çözümde hasat doku bırakın. 4 ° c hafif sallanan ile 24 h için düzeltme.
    7. Örnekleri fiksasyon sonra uzun vadeli tutmak için onları PBS (3 x 20 dk RT az) ile yıkamak ve metanol-tedavi artan metanol dizisi (1 x %30, 1 x %50, % 1 x 70, 2 x %100 metanol PBS içinde 20 dk için).
      1. Onları % 100 metanol-20 ° C'de depolayın Aksi takdirde, doğrudan kemik boyama veya diğer analizler ile PBS ile yıkadıktan sonra devam edin.
  2. Kemik teknikleri boyama ben (alizarin kırmızı boyama)
    Not: Bu boyama van Eeden ve ark. 199617 ve Walker & Kimmel 200718 değişiklikler ile göre gerçekleştirilir.
    1. Yetişkin palet veya kafatasları alizarin kırmızı boyama gerçekleştirmek için hasat ve doku 5.1 bölümlerinde açıklandığı gibi düzeltin.
    2. Örnekleri metanol-20 ° C'de depolanmış bir ters metanol serisi (% 70, % 50 ve %30 PBS, her 1 x 20 dk) yaparak örnekleri rehydrate ve iki kez 20 dk PBS ile yıkayın. Örnekleri 5 min için minimum deiyonize su ile yıkayın.
    3. Alizarin kırmızı kafatasları içinde boyama örnekleri 50 mg/mL tripsin ile % 30'tedavi için oda sıcaklığında Na2B4O7 gecede doymuş. Bu süre içinde kaya örneklerini. Durulama örneklerinde % 30 Na2B4O7 çözüm doymuş. Örnekleri 2 kez 5 min için deiyonize su ile yıkayın. Bu adım için fin doku gerçekleştirilir.
    4. Alizarin kırmızı çözüm (Bölüm B: % 0.5 alizarin kırmızı S toz, % 10 gliserol deiyonize su) ekleyin ve boyama sonra 1, 2, 4 s veya gece için kuluçka RT. Check sırasında örnekleri rock.
    5. Temizlemek için örnekleri tedavi onları azalan % 1 potasyum hidroksit: gliserol serisiyle (3:1 gecede, 1:1 bir gecede, bir gecede 1:3).
    6. Örnekleri % 0,1 potasyum hidroksit 1:1 çözeltilerine saklamak: % 80 gliserol ve görüntüleme için % 80 gliserol ile mount.
      Not: Alcian mavi/alizarin tedavi örnekleri Alcian ile mavi rehidrasyon (Bölüm 5.2.2) için 2 h RT. tedavi yüzgeçleri azalan bir etanol serisi ile sonra çözüm (Bölüm A: son %0.02 Alcian mavi, 50 mM MgCl2, % 70 etanol) boyama boyama kırmızı için kombine 50 mM MgCl2 (% 70, % 50, % 30, her 1 x 15 dk) ve yıkama onları en az 1 h (3 x 20 dk) içinde su deiyonize. (Bölüm 5.2) boyama alizarin red ile devam edin.
  3. Kemik boyama teknikleri II (calcein boyama)
    Not: fin kırıkları ve kafatası yaralanması kalsiyum birikimi tespit etmek, canlı balık calcein solüsyon içeren inkübe.
    1. Deiyonize su (pH 7.5) %0,2 calcein gerekli miktarda hazırlamak. PH tarafsız olduğundan emin olun. 1 M NaOH pH ayarlamak için kullanın.
    2. Aynı anda 100 mL calcein çözeltisi için alüminyum folyo ile kaplı bir cam kabı içinde 20 dk içinde 3 zebra balığı kadar kuluçkaya.
    3. Zebra balığı balık su ile bir ölçek aktarın. Kısa bir süre için balık su ile yeni bir ölçek aktarmadan önce yüzmek izin. Bu yeni ölçek yıkamak 20 dakika yüzmek izin. Fotoğraf (bakınız Bölüm 5.4) çekmek.
  4. Zebra balığı Imaging yaşamak
    1. Zebra balığı ödün vermeden fin veya kafatası deneme boyunca gibi kemik doku Yenileyici görüntüleri bu yaklaşımı kullanın. Zebra balığı Bölüm 2.1 göre uyuşturan.
    2. Fin yeniden oluşturur görüntüleri elde etmek için anaesthetized zebra balığı bir özel kaplamalı Petri kabına (bkz: Bölüm 2.2.1 ve Şekil 1B) üzerine aktarın.
    3. Kafatası kemikleri Yenileyici görüntüleri elde etmek için zebra balığı dik bir sünger (Şekil 1 d) yerleştirin veya gövdesine zebra balığı tutmak için hazırlanan bir özel boyalı çanak içinde yerleştirin.
    4. İstediğiniz büyütme ve çözünürlük stereomicroscopic kurulumu kullanarak görüntüleri elde etmek.
    5. Zebra balığı bir konteyner ile taze veya balık su içeren ilaç geri dönün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada sunulan Protokolü art arda hızlı kemik oluşumunu zebra balığı yüzgeci kafatası10,11,ve16yenilenme sırasında ikna etmek için kullanılmıştır. Prednizolon yönetim ile birlikte sunulan yöntem, prednizolon'ın etkileri kemik yeniden oluşturma sırasında üzerinde çalışmalar takip edilebilir. Örneğin, kemik oluşumu ve yeniden Qafqaz çalışmalar yapılabilir. Prednizolon, diğer sebepler19,20, fin rejenerasyon, kemik oluşumu, alizarin kaudal fin doku (Şekil 3A) sabit boyama kırmızı tarafından algılanan dahil olmak üzere genel inhibisyonu yol açar. Benzer şekilde, prednizolon alizarin kırmızı (Şekil 3B) veya calcein vivo içinde boyama tarafından resimli (grefti) kafatası yaralanması kapanış geciktirme bir etkiye sahiptir. Buna ek olarak, prednizolon monosit/makrofaj lineage apoptosis tetikleyen tarafından hem fin hem de kafatası bir doku, derin bir anti-inflamatuar etkisi giderek artan. Azaltılmış makrofaj numaraları immünhistokimya donmuş dokular tarafından algılanan bölümleri, bir anti-mcherry antikor transgenik mpeg1içinde kullanarak Örneğin, : mCherry zebra balığı (Şekil 3 c)10,21 . Benzer şekilde, numarası, dağıtım, nükleer silahların yayılmasına karşı ve diğer hücre tiplerinin exo - ve iskelet (Örneğin, omurga) hem ilgi apoptosis immünhistokimya yardımı ile analiz edilebilir.

Figure 1
Resim 1 : Zebra balığı içinde yürütülen yordamlar. Bir neşter yardımıyla kaudal fin (amputasyon) anaesthetized zebra balığı rezeksiyon(a). Kırmızı kesikli çizgi amputasyon düzeyini gösterir. (B) Fin stereomicroscope altında bir enjeksiyon iğne ile yapılan anaesthetized zebra balığı kırık ray. Balık işlem sırasında özel kaplı bir Petri kabına üzerinde yatıyor. Özel kaplamalı Petri yemekler de yenilenme veya kırık onarım sırasında zebra balığı yüzgeçleri görüntülerini almak için kullanılır. Calvariae (kafatası yaralanması), (C) trepanasyon anaestetized zebra balığı stereomicroscope altında bir microdrill yardımı ile gerçekleştirilen. (D) görüntü edinme yaralanma sonra kafatasını Yenileyici. Anaesthetized zebra balığı bir sünger dik yerleştirilir ve görüntüleri bir stereomicroscope yardımı ile elde edilir. Petri kabına %0.02 içeren balık su dolu MS-222. Prednizolon veya balık su içeren DMSO zebra balığı (E) kuluçka. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : 0 h sonrası yaralanma HPI yaralanmaları, mikroskobik canlı ön izleme). (A)Amputated kaudal fin. Ölçek çubuğu 200 µm. (B) kırık yüzgeç ışın =. Kırık kırmızı okla gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. (C) Trepanated kafatası =. Yaralanma sitesi tarafından beyaz ok ucu belirtilir. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Yetişkin zebra balığı tedavisinde prednizolon temsilcisi sonuçları. (A)Alizarin kırmızı lekeli FIN 14 gün sonrası amputasyon (dpa) ve gün tedavi (dt) yeniden oluşturur. Prednizolon tedavi fin vardır daha kısa (gösterilmez) ve pozitif Kemik matrisi tespit alizarin red daha küçük bir etki alanını yeniden oluşturur. Ölçek çubuğu 500 µm. (B) Alizarin kırmızı lekeli kafatasları 7 gün sonrası yaralanma (dpi) ve dt =. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam izni10ile değiştirildi. (C) Cryosection görüntülemek zarar görmemiş kafatası ve beyin dokusu (prednizolon) tedavi ve tedavi edilmezse (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) Tg x (osterix: nGFP) transgenik muhabir balık, makrofajlar (doğuştan gelen bağışıklık hücreleri) kırmızı olarak etiketlenir 21 ve kemik dokusunu oluşturan yeşil22etiketlenir. Makrofajlar sayısı önemli ölçüde tedavi prednizolon zebra balığı içinde bırakır. Geurtzen ve ark. içinde açıklanan immünhistokimya gerçekleştirildi 10. çekirdek mavi (DAPI) etiketlenir. Ölçek çubuğu 20 µm. BF =: parlak alan, EPID: epidermis, bn: kemik. Bu rakam izni10ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebra balığı iskelet araştırma birçok bakımdan yararlı kanıtlamış. Seçili mutantlar osteogenesis imperfekta veya osteoartrit23,24,25,26,27gibi insan hastalık yönlerini taklit ve larva yanı sıra ölçekler için kullanılmaktadır kemik anabolik bileşikler küçük molekül ekranlar7,28,29tanımlayın. Zebra balığı klinik pratikte uygulanan ilaçlarla tedaviler Ayrıca ideal sözde yan etkiler, örneğin kemik dokusunda çalışmaya uygundur. Bu bağlamda hızla kemik Yenileyici varlığını ilaç kaynaklı kemik eksikliklerin temel mekanizmaları araştırmak için avantajlıdır. Burada, uyuşturucu tedavisi glukokortikoid prednizolon, kemik dokusu, olumsuz etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir anti-inflamatuar ilaç ile yetişkin kemik rejenerasyon rejimleri ile birleştirilmiştir bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı başarıyla immünsüpresif teşvik ve rejeneratif zebra balığı dokuların inhibitör etkileri kemik için kullanılan ve aynı zamanda prednizolon ve diğer ilaçlar gibi omurga yetişkin doku etkisi üzerinde çalışmalar için adapte edilebilir. İmmünsupresif ilaç tedavileri zebra balığı geçiren fin veya kafatası yeniden oluşturma işlemi gerçekleştirildiğinde aşağıdaki ayrıntıları dikkate alınmalıdır.

Yaralanma deneyleri tekrarlanabilirlik

Fin yeniden oluşturma işlemi sırasında yenilenme hızı (Yani, büyütme fin doku, kemik, zaman birimi başına da dahil olmak üzere) çok rezeke13olmak fin doku miktarına bağlıdır. Fin rejenerasyon istenmeyen değişkenlik önlemek amacıyla, her zaman tüm numuneler dokusunda fin eşdeğer miktarda çıkarabileceğim emin olun.

Kemikli yüzgeç ışın kırıklar yürütülmesini bir enjeksiyon iğne seçilen kemikli yüzgeç ışın segment merkezi hafifçe iterek gerçekleştirilir. 2. hemirays karşı kemikli fin ışınları oluşur gibi kullanılan basınç miktarı bir veya her iki hemirays kırık olup olmadığını belirler. Her iki hemirays kırık destabilize eder sonuçta sırasında aşağıdaki gün ayırmak yüzgeç ışın, çünkü tek bir hemiray, kırık için düşük basınç uygulamak tercih ediyoruz.

Grefti yaralanmaları kafatası Mikrodelme tarafından dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Hasar beyin için (Yani, beyincik) postural ve locomotory yapılırsa açıkları numune15düzensiz yüzme ile belirgin hale gelecektir. Zebra balığı serebellar yaralanma ile ilaç tedavisi için olumsuz tepkiler gösterebilir ve kemik rejenerasyon eğitim için kullanılmamalıdır.

İlaç tedavileri ile ilgili dikkat edilmesi gereken noktalar

Yetişkin zebra balığı tutarlı bir immünsüpresif ve anti-yenileyici etkisi üretmek için bir doz 50 µM prednizolon balık su istihdam. Bu doz larva ve yetişkin zebra balığı ilk doz-yanıt deneyler sırasında tespit. Böylece, uygulanabilir diğer immünsüpresif ajanlar gerekli doz tanımlamak için doz-yanıt deneyler yapılmalıdır. Yetişkinler için Fin regenerate süresi son derece hassas ve kolay algılamak göstergesi için doku değişiklikler olarak bu ilk deneyler fin rejenerasyon rejimi ile birleştirerek öneririz.

İmmünsüpresif tedavi tedavi numuneler mikrobik enfeksiyonlara karşı açmaları. Bu nedenle, tek konut autoclaved kadehler autoclaved balık su içeren önemlidir. Bu koşulları yerine getirmek daha hantal ve steril değildir de, onlar enfeksiyon tedavi zebra balığı en aza indirmek için yardımcı. Biz ('sterilize') pretreat değil Artemia yumurtaları. Ancak, bu zebra balığı, enfeksiyonu önlemek için ek bir ölçüm gerekli olabilir. Ayrıca, metilen mavisi (% 1) gibi antiseptik maddelerin su kullanmadan önce balık eklenebilir.

Prednizolon, hem kısa hem de uzun vadeli, ile deneyler balık su günlük değişiklikler yapılması gerekir. 8 haftaya kadar yetişkin zebra balığı tedavi ettik. Çok sayıda bireylerin tedavisinde uzun bir süre için bazı deneysel 'yük' yol açabilir ve dikkatlice planlanması gerekir. Her zaman autoclaved balık su ve cam eşya hazır gerekli miktarda için çok önemli. Her ne kadar bu zebra balığı (bizim bilgi için) yapılan test edilmemiştir, implantasyon yavaş salınımlı Pellet uyuşturucu ilgi için uzun süreli uyuşturucu pozlama zebra balığı için değerli bir alternatif temsil edebilir.

Transgenik zebra balığı analizleri

Burada, Qafqaz/kalsifikasyon kemik dokuları için alizarin kırmızı ve calcein boyama tarafından leke için 2 yöntem mevcut. Ayrıca, biz Yenileyici fin ve kafatası doku vivo içinde bir stereomicroscope yardımı ile görüntü gösterilmiştir. İkinci transgenik zebra balığı numarası veya etkinlik dokusunu veya bağışıklık hücreleri gibi seçili hücrelerin raporlama görüntüsü çok yararlı bir tekniktir. Örneğin, önce yaralı ödün ve alizarin kırmızı boyama gerçekleştirmek için prednizolon tedavi zebra balığı, fin yeniden oluşturur veya onarım gerçekleştiriyor trepanated kafatasları varlığı, numarası ve etkinlik kemik dokusunu içinde şekillendirme aramak için fotoğrafı olabilir transgenik muhabir satır Tg (osterix: nGFP)22. Aynı şekilde, bir gün içinde oluşur, epidermal yara kapatma fluorophore epidermal doku hızlı Transgenik balık görüntülenir. Ayrıca, yaralanma (veya onların yokluğunda tedavi prednizolon bireyler) sitesinde bağışıklık hücreleri birikimi gerekli ışık kaynağı ve filtreleri ile donatılmıştır bir stereomicroscope ile kolayca izlenebilir.

Özetle, burada sunulan Protokolü immünsüpresif ajanları ve diğer uyuşturucu etkileri sistemik kemik rejenerasyon fin veya kafatası ameliyatı zebra balığı yönetiminde sonra eğitim için kullanılabilir. Bu GIO patogenezinde betimlemek için ve başarılı kemik rejenerasyon yatan mekanizmaları incelemek için faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada bir hibe merkezi rejeneratif terapiler Dresden ("glukokortikoid kaynaklı kemik kaybı mekanizmaları çözülmeye zebra balığı bir model olarak") ve ayrıca Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, proje verilmesi tarafından desteklenmiştir 387653785) FK için. Jan Kaslin ve Avinash Chekuru onların rehberlik ve kemikli fin ışınları calvariae ve kırıklar trepanasyon yapılması hakkında yardım için minnettarız. Deneyler tasarlanmış, gerçekleştirilen ve KG ve FK tarafından analiz etti. FK el yazması yazdı. Biz de Katrin Lambert, Nicole Cudak ve diğer üyeleri Knopf ve marka labs teknik yardım ve tartışma için teşekkür etmek istiyorum. Bizim teşekkür da Marika Fischer ve Jitka Michling mükemmel balık bakımı ve Henriette Knopf ve Josh için el yazması yazım denetleme Currie gider.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3 mm x 13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
  2. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  3. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  4. Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
  5. Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
  6. den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
  7. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  8. de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
  9. Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
  10. Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
  11. Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
  12. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  13. Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
  14. Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
  15. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  16. Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
  17. van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
  18. Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  19. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  20. Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  21. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  22. Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  23. Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
  24. Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
  25. Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
  26. Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
  27. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
  28. Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
  29. de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 140 zebra balığı kemik rejenerasyon yaralanma Fin kafatası sebepler prednizolon
Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult… More

Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter